CN107144617A - 一种氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器的制备方法,该方法是以羧基化氧化石墨烯为基底,通过碳二亚胺反应在基底上嫁接氨基化的甲胎蛋白适体链,然后将所得复合物修饰到电极上,并用牛血清蛋白封闭修饰电极上的非特异性吸附位点,由此便形成了氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感界面。以该修饰电极为工作电极,采用阻抗法考察传感界面由不同浓度甲胎蛋白溶液所引起的阻抗信号的变化。与现有检测甲胎蛋白的方法相比,本发明采用甲胎蛋白适体对目标蛋白进行分析,不存在冗杂的多重标记操作和辐射、污染等危害,且具有灵敏度高、选择性好、制备简单、分析速度快、反应条件温和、制备成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于新型功能化纳米材料以及电化学传感技术领域,具体涉及一种氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器的制备方法。
背景技术
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)是一种血清糖蛋白,是目前原发性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)确诊最重要的生物标志物。此外,血清中甲胎蛋白含量异常还与一些其他相关疾病有关,如神经管缺陷、脑/脊髓畸形、染色体异常等。因此,血清中甲胎蛋白含量的检测对肝癌临床诊断以及一些疾病的早期筛查具有很重要的意义。
目前,血清中甲胎蛋白含量的确定,临床检测主要采用免疫测定法。常规免疫测定包括酶联免疫吸附测定、放射免疫测定以及荧光免疫测定。但是,这些方法固有其自身缺陷,如会存在部分标记抗体的损失,会造成辐射危害以及环境污染等;并且,荧光免疫测定中所需的镧系元素标记物价格昂贵且容易受到外界干扰。此外,以上分析方法所需分析时间长,且需具备熟练的操作员。
目前亟需一种灵敏度高、选择性好、制备简单、分析速度快、反应条件温和、制备成本低的方法用于甲胎蛋白的检测。
发明内容
为了克服现有技术中甲胎蛋白检测方法的不足,本发明的第一个方面,提供一种用于甲胎蛋白检测的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器,该电化学传感器是通过以下方法制备得到的:
以羧基化氧化石墨烯为基底,通过碳二亚胺反应在基底上嫁接氨基化甲胎蛋白适体,得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物;
然后以该氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物修饰玻碳电极,并用牛血清蛋白封闭修饰后玻碳电极上的非特异性吸附位点,得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物-电极;
再将氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物-电极浸于不同浓度的甲胎蛋白中孵化;孵化结束后,取出电极并洗涤,得到捕获有目标分析物甲胎蛋白的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器。
本发明还保护所述的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器在检测甲胎蛋白含量中的应用。
为了提供一种灵敏度高、选择性好、制备简单、分析速度快、反应条件温和、制备成本低的甲胎蛋白的检测方法,本发明的第二个方面,提供一种采用上述电化学传感器检测甲胎蛋白的方法,该方法不属于疾病的诊断与治疗方法,包括以下步骤:
(1)采用电化学工作站的三电极体系进行检测,以上述结合了甲胎蛋白目标分析物的电化学传感器为工作电极,以银-氯化银电极、铂丝电极为参比电极和对电极,交流阻抗测试参数设置:频率范围为0.05~100KHz,交流微扰振幅为5mV,极化电路选择开路电位;
(2)将三电极浸没于含4~10mM铁氰化钾的PBS电解质溶液中进行交流阻抗测试,不同浓度甲胎蛋白溶液孵化的传感界面,其阻抗信号大小不同,据此绘制工作曲线;
(3)采用以上方法对实际样品中的甲胎蛋白进行分析检测。
与现有技术相比,本发明的技术方案具有如下有益效果:
(1)本发明采用羧基化氧化石墨烯作为传感器的基底材料,氧化石墨烯比表面积大、机械性能好、生物相容性好,其不仅能够增大电极表面积,还能够增加甲胎蛋白适体的修饰量。
(2)本发明将氨基化甲胎蛋白适体用于捕获甲胎蛋白分析物,能够克服抗体分析稳定性较差、制备较复杂以及成本高等缺点,既可以提高检测的特异性,又可以增强分析的灵敏度。
(3)本发明采用阻抗法考察传感界面由不同浓度甲胎蛋白溶液所引起的阻抗信号的变化,采用这种免标记测定简化了分析步骤,提高了分析速度。
(4)与传统甲胎蛋白分析检测方法不同,本发明将具有高特异性识别的甲胎蛋白适体引入传感界面,克服了传统方法中存在的冗杂标记操作和辐射、污染等危害。本发明设计了一种灵敏度高、选择性好、制备简单、反应条件温和、成本低的电化学分析方法以实现对甲胎蛋白的高效检测。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1是氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器制备原理图。
图2是氧化石墨烯羧基化处理前后阻抗谱图。
图3是电极修饰及用于检测甲胎蛋白的阻抗谱图。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
没有特殊说明的话,本发明中采用的试剂或材料均可通过常规途径得到。
本发明中的PBS是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline),它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。
正如背景技术所介绍的,现有技术中甲胎蛋白的检测方法存在着一些不足,为了解决如上的技术问题,本发明的第一个方面,提出一种用于甲胎蛋白检测的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器,该电化学传感器是通过以下方法制备得到的:
以羧基化氧化石墨烯为基底,通过碳二亚胺反应在基底上嫁接氨基化甲胎蛋白适体,得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物;
然后以该氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物修饰玻碳电极,并用牛血清蛋白封闭修饰后玻碳电极上的非特异性吸附位点,得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物-电极;
再将氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物-电极浸于不同浓度的甲胎蛋白中孵化;孵化结束后,取出电极并洗涤,得到捕获有目标分析物甲胎蛋白的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器。
经过试验发现,不同的工艺参数对得到的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物具有一定的影响,本发明从提高检测灵敏度的角度出发,经过对各个步骤工艺参数的筛选优化,得到一种氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物的制备方法,通过该制备方法将足够量的氨基化甲胎蛋白嫁接至羧基化的氧化石墨烯上,以最大程度的提高该电化学传感器的灵敏度。该制备方法包括以下步骤:
(1)将2~6mg氧化石墨烯于1~3ml去离子水中超声分散1~1.5h,得到分散均匀的氧化石墨烯悬乳液;
(2)向获得的氧化石墨烯悬乳液中加入0.3~0.6g NaOH和0.2~0.5g氯乙酸,并超声处理10~12h,以增加氧化石墨烯上的羧基;
(3)将经过羧基化的氧化石墨烯离心洗涤后,加入1~4ml 0.3M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1~3ml 0.2M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),并进行超声处理1~1.5h,以活化氧化石墨烯上的羧基;
(4)将经过活化的氧化石墨烯离心洗涤后,加入0.5~1ml浓度为30~250μg/ml的氨基化甲胎蛋白适体溶液孵化20~40min,以将甲胎蛋白适体链嫁接到氧化石墨烯表面;
(5)将步骤(4)中获得的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物进行离心洗涤,以除去未结合的甲胎蛋白适体,然后将离心洗涤后所得复合物用PBS溶解,并超声分散得到均匀分散液,即得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物分散液。
本发明中的基底材料采用羧基化氧化石墨烯,目的是增加氧化石墨烯表面的羧基官能团含量,进而提高后续采用EDC/NHS将氨基化甲胎蛋白适体嫁接到基底材料上的嫁接量,从而提高传感器的灵敏度;经过试验验证,采用羧基化的氧化石墨烯对最终的检测结果具有重要的影响,它是显著提高该电化学传感器检测灵敏度的关键因素之一。否则,就会使得氧化石墨烯表面剩余较多的未嫁接位点,由于石墨烯及石墨烯衍生物等材料本身就有好的吸附性,若适体嫁接数量很少,就会残留较多的吸附位点,导致在进行目标蛋白甲胎蛋白分析时存在较大背景。
本发明采用氨基化甲胎蛋白适体作为基底材料的修饰物,用来捕获甲胎蛋白目标分析物,不仅可以提高传感器检测的选择性,而且还可以提高分析的灵敏度。
本发明中,氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物修饰玻碳电极的方法包括以下步骤:
将3~10μL氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物分散液滴涂于玻碳电极表面,晾干后,将4~8μL质量分数为0.5%~1.5%的牛血清蛋白滴涂于修饰后的玻碳电极表面,并孵化15~60min,以封闭传感界面的非特异性结合位点,即得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物-电极。
其中,在修饰玻碳电极之前,对玻碳电极进行预处理,预处理方法为:将玻碳电极(直径为3mm)依次用粒径为0.3μm、0.05μm的三氧化二铝抛光粉处理,并先后用乙醇、去离子水将玻碳电极超声清洗干净。
本发中的甲胎蛋白适体是针对甲胎蛋白特异性筛选得到的,在本发明的一些技术方案中,所述甲胎蛋白适体为按照Scientific Reports|5:15552|DOI:10.1038/srep15552设计的序列。与采用抗体分析的方法相比较,适体具有性质稳定、可长期保存、容易大量合成以及成本低等优势。
经过试验验证,不同的制备方法使得检测的灵敏度和准确性差异显著,本发明针对甲胎蛋白的检测,首先通过制备氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物,然后将复合物修饰于玻碳电极表面;这样使得氧化石墨烯与甲胎蛋白适体直接在溶液中进行嫁接,反应充分,耗时短,避免了长时间浸泡反应导致的基底材料—羧基化氧化石墨烯的脱落现象,进而提高了甲胎蛋白检测的灵敏度和准确性。本发明还考察了其它的制备方法,例如:首先制备氧化石墨烯-玻碳电极,然后制备氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物-玻碳电极,但是发现该制备方法得到的电化学传感器的灵敏度和准确性都显著降低,效果不理想。
本发明中所述的用于甲胎蛋白检测的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)将玻碳电极依次用粒径为0.3μm、0.05μm的三氧化二铝抛光粉处理,并先后用乙醇、去离子水将玻碳电极超声清洗干净;
(2)将3~10μL氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物分散液滴涂于玻碳电极表面,晾干;
(3)将4~8μL质量分数为0.5%~1.5%的牛血清蛋白滴涂于修饰后的玻碳电极表面,并孵化15~60min;
(4)将封闭后的玻碳电极浸没于1~2mL含0.00001~100ng/mL甲胎蛋白的PBS溶液中孵化15~60min;电极取出后用PBS振荡清洗,以除去未结合或弱结合的物质,即得到捕获有目标分析物甲胎蛋白的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器。
为了提供一种灵敏度高、选择性好、制备简单、分析速度快、反应条件温和、制备成本低的甲胎蛋白的检测方法,本发明的第二个方面,提供一种采用上述电化学传感器检测甲胎蛋白的方法,为使得检测结果的重复性好、准确性高,该方法对检测条件进行筛选优化,得到包括以下步骤的检测方法:
(1)采用电化学工作站的三电极体系进行检测,以上述结合了甲胎蛋白目标分析物的电化学传感器为工作电极,以银-氯化银电极、铂丝电极为参比电极和对电极,交流阻抗测试参数设置:频率范围为0.05~100KHz,交流微扰振幅为5mV,极化电路选择开路电位;
(2)将三电极浸没于含4~10mM铁氰化钾的PBS溶液中进行交流阻抗测试,不同浓度甲胎蛋白溶液孵化的传感界面,其阻抗信号大小不同,据此绘制工作曲线;
(3)采用以上方法对实际样品中的甲胎蛋白进行分析检测。
以上方法为非疾病诊断和治疗方法。在非疾病诊断和治疗方法上,通过检测甲胎蛋白的含量,可以发现相关的抗癌药物,以及进行对相关抗癌药物的筛选研究。
传统的分析甲胎蛋白的方法如酶联免疫吸附测定、放射免疫测定以及荧光免疫测定,这些方法会存在部分标记抗体的损失,会造成辐射危害以及污染环境等,并且荧光免疫测定中所需的镧系元素标记物价格昂贵且容易受到外界干扰,而本发明将具有高特异性识别的甲胎蛋白适体引入传感界面的设计,克服了传统方法中存在的冗杂标记操作和辐射、污染等危害。采用氨基化甲胎蛋白适体捕获甲胎蛋白目标分析物,不仅可以增强检测的选择性,而且可以提高分析的灵敏度。经试验验证,本发明的检测方法检测线可低至20~80fg/mL级别。以氧化石墨烯/甲胎蛋白适体修饰电极为工作电极,采用阻抗法考察传感界面由不同浓度甲胎蛋白溶液所引起的阻抗信号的变化。当电极表面的适体结合了待测溶液中的甲胎蛋白后,会增大电极阻抗,并引起电解质溶液中氧化还原信号在电极表面的电子转导速率降低,使得所测阻抗信号增大。本发明采用阻抗法进行免标记检测,可简化分析步骤,并提高分析速度。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将2mg氧化石墨烯于1ml去离子水中超声分散1h,得到分散均匀的氧化石墨烯悬乳液。
(2)于上述氧化石墨烯悬乳液中加入0.3g NaOH和0.2g氯乙酸,并超声处理12h,以增加氧化石墨烯上的羧基。如图2所示,氧化石墨烯在羧基化处理前后,其对应的阻抗谱发生了较大变化,表明羧化后的氧化石墨烯其表面的羧基官能团含量增加。
(3)将经过羧基化的氧化石墨烯离心洗涤,然后加入1.5ml 0.3M的EDC和1ml 0.2M的NHS,并进行超声处理1h,以活化氧化石墨烯上的羧基。
(4)将经过活化的氧化石墨烯离心洗涤后,加入0.5ml浓度为100μg/ml的氨基化甲胎蛋白适体溶液(Tris-EDTA溶液配制备)孵化20min,以将甲胎蛋白适体链嫁接到氧化石墨烯表面。
(5)将上述氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物进行离心并用PBS洗涤,以除去未结合的甲胎蛋白适体。然后将离心所得复合物用0.5ml PBS溶解,并超声分散得到均匀分散液。
实施例2
氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将4mg氧化石墨烯于1.5ml去离子水中超声分散1h,得到分散均匀的氧化石墨烯悬乳液。
(2)于上述氧化石墨烯悬乳液中加入0.4g NaOH和0.3g氯乙酸,并超声处理12h,以增加氧化石墨烯上的羧基。
(3)将经过羧基化的氧化石墨烯离心洗涤,然后加入3ml 0.3M的EDC和2ml 0.2M的NHS,并进行超声处理1h,以活化氧化石墨烯上的羧基。
(4)将经过活化的氧化石墨烯离心洗涤后,加入0.75ml浓度为200μg/ml的氨基化甲胎蛋白适体溶液(Tris-EDTA溶液配制备)孵化30min,以将甲胎蛋白适体链嫁接到氧化石墨烯表面。
(5)将上述氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物进行离心并用PBS洗涤,以除去未结合的甲胎蛋白适体。然后将离心所得复合物用0.5ml PBS溶解,并超声分散得到均匀分散液。
实施例3
氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将6mg氧化石墨烯于2ml去离子水中超声分散1h,得到分散均匀的氧化石墨烯悬乳液。
(2)于上述氧化石墨烯悬乳液中加入0.6g NaOH和0.5g氯乙酸,并超声处理12h,以增加氧化石墨烯上的羧基。
(3)将经过羧基化的氧化石墨烯离心洗涤,然后加入4ml 0.3M的EDC和3ml 0.2M的NHS,并进行超声处理1h,以活化氧化石墨烯上的羧基。
(4)将经过活化的氧化石墨烯离心洗涤后,加入1ml浓度为250μg/ml的氨基化甲胎蛋白适体溶液(Tris-EDTA溶液配制备)孵化40min,以将甲胎蛋白适体链嫁接到氧化石墨烯表面。
(5)将上述氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物进行离心并用PBS洗涤,以除去未结合的甲胎蛋白适体。然后将离心所得复合物用0.75ml PBS溶解,并超声分散得到均匀分散液。
实施例4
如图1所示,一种用于肿瘤标志物检测的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器的制备方法和甲胎蛋白的检测方法,包括以下步骤:
(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用粒径为0.3μm、0.05μm的三氧化二铝抛光粉处理,并先后用乙醇、去离子水将电极超声清洗干净。
(2)将3μL氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物分散液(实施例1中制备得到的)滴涂于电极表面,并于室温下晾干,4℃保存备用。
(3)将4μL质量分数为0.5%的牛血清蛋白滴涂于以上修饰电极表面,并于4℃环境下孵化15min,以封闭传感界面的非特异性结合位点。
(4)将封闭后的修饰电极浸没于1mL含0.00001~100ng/mL一系列不同浓度的甲胎蛋白的PBS标准溶液中孵化15min。电极取出后用PBS振荡清洗,以除去未结合或弱结合的物质。
(5)采用电化学工作站的三电极体系进行检测,以特异性结合了甲胎蛋白目标分析物的修饰电极为工作电极,以银-氯化银电极、铂丝电极为参比电极和对电极,交流阻抗测试参数设置:频率范围为0.05~100KHz,交流微扰振幅为5mV,极化电路选择开路电位。
将三电极浸没于含4mM铁氰化钾的PBS电解质溶液中进行阻抗测试,不同浓度甲胎蛋白溶液孵化的传感界面,其阻抗信号大小不同,据此绘制工作曲线。
将实际样品代替甲胎蛋白标准溶液,然后采用以上方法对实际样品中的甲胎蛋白进行分析检测。
如图3所示,电极经修饰、封闭以及用于检测目标蛋白后,阻抗谱发生了相应的变化。表明甲胎蛋白适体可以嫁接到氧化石墨烯表面;同时,经牛血清蛋白封闭后,适体能够对目标蛋白进行特异性捕获。
实施例5
一种用于肿瘤标志物检测的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器的制备方法和甲胎蛋白的检测方法,包括以下步骤:
(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用粒径为0.3μm、0.05μm的三氧化二铝抛光粉处理,并先后用乙醇、去离子水将电极超声清洗干净。
(2)将6μL氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物分散液(实施例2中制备得到的)滴涂于电极表面,并于室温下晾干,4℃保存备用。
(3)将6μL质量分数为1%的牛血清蛋白滴涂于以上修饰电极表面,并于4℃环境下孵化25min,以封闭传感界面的非特异性结合位点。
(4)将封闭后的修饰电极浸没于1.5mL含0.00001~100ng/mL一系列不同浓度的甲胎蛋白的PBS标准溶液中孵化25min。电极取出后用PBS振荡清洗,以除去未结合或弱结合的物质。
(5)采用电化学工作站的三电极体系进行检测,以特异性结合了甲胎蛋白目标分析物的修饰电极为工作电极,以银-氯化银电极、铂丝电极为参比电极和对电极,交流阻抗测试参数设置:频率范围为0.05~100KHz,交流微扰振幅为5mV,极化电路选择开路电位。
将三电极浸没于含6mM铁氰化钾的PBS电解质溶液中进行阻抗测试,不同浓度甲胎蛋白溶液孵化的传感界面,其阻抗信号大小不同,据此绘制工作曲线。
将实际样品代替甲胎蛋白标准溶液,然后采用以上方法对实际样品中的甲胎蛋白进行分析检测。
实施例6
一种用于肿瘤标志物检测的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器的制备方法和甲胎蛋白的检测方法,包括以下步骤:
(1)将直径为3mm的玻碳电极依次用粒径为0.3μm、0.05μm的三氧化二铝抛光粉处理,并先后用乙醇、去离子水将电极超声清洗干净。
(2)将10μL氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物分散液(实施例3中制备得到的)滴涂于电极表面,并于室温下晾干,4℃保存备用。
(3)将8μL质量分数为1.5%的牛血清蛋白滴涂于以上修饰电极表面,并于4℃环境下孵化40min,以封闭传感界面的非特异性结合位点。
(4)将封闭后的修饰电极浸没于1.5mL含0.00001~100ng/mL甲胎蛋白的PBS溶液中孵化40min。电极取出后用PBS振荡清洗,以除去未结合或弱结合的物质。
(5)采用电化学工作站的三电极体系进行检测,以特异性结合了甲胎蛋白目标分析物的修饰电极为工作电极,以银-氯化银电极、铂丝电极为参比电极和对电极,交流阻抗测试参数设置:频率范围为0.05~100KHz,交流微扰振幅为5mV,极化电路选择开路电位。
将三电极浸没于含10mM铁氰化钾的PBS电解质溶液中进行阻抗测试,不同浓度甲胎蛋白溶液孵化的传感界面,其阻抗信号大小不同,据此绘制工作曲线。
将实际样品代替甲胎蛋白标准溶液,然后采用以上方法对实际样品中的甲胎蛋白进行分析检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于甲胎蛋白检测的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器,其特征是,该电化学传感器是通过以下方法制备得到:
以羧基化氧化石墨烯为基底,通过碳二亚胺反应在基底上嫁接氨基化甲胎蛋白适体,得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物;
然后以该氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物修饰玻碳电极,并用牛血清蛋白封闭修饰后玻碳电极上的非特异性吸附位点,得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物-电极;
再将氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物-电极浸于不同浓度的甲胎蛋白中孵化;孵化结束后,取出电极并洗涤,得到捕获有目标分析物甲胎蛋白的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器。
2.如权利要求1所述的电化学传感器,其特征是,氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物的制备方法包括以下步骤:
(1)将2~6mg氧化石墨烯于1~3ml去离子水中超声分散1~1.5h,得到分散均匀的氧化石墨烯悬乳液;
(2)向获得的氧化石墨烯悬乳液中加入0.3~0.6g NaOH和0.2~0.5g氯乙酸,并超声处理10~12h,以增加氧化石墨烯上的羧基;
(3)将经过羧基化的氧化石墨烯离心洗涤后,加入1~4ml 0.3M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1~3ml 0.2M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),并进行超声处理1~1.5h,以活化氧化石墨烯上的羧基;
(4)将经过活化的氧化石墨烯离心洗涤后,加入0.5~1ml浓度为30~250μg/ml的氨基化甲胎蛋白适体溶液孵化20~40min,以将甲胎蛋白适体链嫁接到氧化石墨烯表面;
(5)将步骤(4)中获得的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物进行离心洗涤,以除去未结合的甲胎蛋白适体,然后将离心洗涤后所得复合物用PBS溶解,并超声分散得到均匀分散液,即得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物分散液。
3.如权利要求1所述的电化学传感器,其特征是,氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物修饰玻碳电极的方法包括以下步骤:
将3~10μL氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物分散液滴涂于玻碳电极表面,晾干后,将4~8μL质量分数为0.5%~1.5%的牛血清蛋白滴涂于修饰后的玻碳电极表面,并孵化15~60min,以封闭传感界面的非特异性结合位点,即得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物-电极。
4.如权利要求3所述的电化学传感器,其特征是,在修饰玻碳电极之前,对玻碳电极进行预处理,预处理方法为:将玻碳电极依次用粒径为0.3μm、0.05μm的三氧化二铝抛光粉处理,并先后用乙醇、去离子水将玻碳电极超声清洗干净。
5.如权利要求4所述的电化学传感器,其特征是,玻碳电极的直径为3mm。
6.如权利要求1所述的电化学传感器,其特征是,将封闭后的玻碳电极浸没于1~2mL含0.00001~100ng/mL甲胎蛋白的PBS溶液中孵化15~60min。
7.一种用于甲胎蛋白检测的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)将玻碳电极依次用粒径为0.3μm、0.05μm的三氧化二铝抛光粉处理,并先后用乙醇、去离子水将玻碳电极超声清洗干净;
(2)将3~10μL氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物分散液滴涂于玻碳电极表面,晾干;
(3)将4~8μL质量分数为0.5%~1.5%的牛血清蛋白滴涂于修饰后的玻碳电极表面,并孵化15~60min;
(4)将封闭后的玻碳电极浸没于1~2mL含0.00001~100ng/mL甲胎蛋白的PBS溶液中孵化15~60min;电极取出后用PBS振荡清洗,以除去未结合或弱结合的物质,即得到捕获有目标分析物甲胎蛋白的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征是,氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物的制备方法包括以下步骤:
(1)将2~6mg氧化石墨烯于1~3ml去离子水中超声分散1~1.5h,得到分散均匀的氧化石墨烯悬乳液;
(2)向获得的氧化石墨烯悬乳液中加入0.3~0.6g NaOH和0.2~0.5g氯乙酸,并超声处理10~12h,以增加氧化石墨烯上的羧基;
(3)将经过羧基化的氧化石墨烯离心洗涤后,加入1~4ml 0.3M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1~3ml 0.2M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),并进行超声处理1~1.5h,以活化氧化石墨烯上的羧基;
(4)将经过活化的氧化石墨烯离心洗涤后,加入0.5~1ml浓度为30~250μg/ml的氨基化甲胎蛋白适体溶液孵化20~40min,以将甲胎蛋白适体链嫁接到氧化石墨烯表面;
(5)将步骤(4)中获得的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物进行离心洗涤,以除去未结合的甲胎蛋白适体,然后将离心洗涤后所得复合物用PBS溶解,并超声分散得到均匀分散液,即得到氧化石墨烯/甲胎蛋白适体复合物分散液。
9.权利要求1~6中任一项所述的氧化石墨烯/甲胎蛋白适体电化学传感器在检测甲胎蛋白含量中的应用。
10.一种采用权利要求1~6中任一项所述的电化学传感器检测甲胎蛋白的方法,该方法为非疾病诊断和治疗方法,其特征是,包括以下步骤:
(1)采用电化学工作站的三电极体系进行检测,以权利要求1~6中的结合了目标分析物的电化学传感器为工作电极,以银-氯化银电极、铂丝电极为参比电极和对电极,交流阻抗测试参数设置:频率范围为0.05~100KHz,交流微扰振幅为5mV,极化电路选择开路电位;
(2)将三电极浸没于含4~10mM铁氰化钾的PBS电解质溶液中进行交流阻抗测试,不同浓度甲胎蛋白溶液孵化的传感界面,其阻抗信号大小不同,据此绘制工作曲线;
(3)采用以上方法对实际样品中的甲胎蛋白进行分析检测。
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