CN108490053A - 一种三维石墨烯基比例型信号放大适体传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

一种三维石墨烯基比例型信号放大适体传感器及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于三维石墨烯的比例型信号放大适体传感器制备方法。该方法以金纳米‑三维石墨烯复合物为修饰电极基底材料，然后将二茂铁标记的粘蛋白适体嫁接到三维石墨烯表面的金纳米颗粒上，并用牛血清蛋白对传感界面的非特异性位点进行了封闭。当二茂铁标记适体将粘蛋白捕获到电极表面后，再用甲基蓝标记粘蛋白适体‑金纳米复合物与之共同孵育而后用于电化学检测。本发明采用适体构建传感界面，有利于增强传感器的稳定性和选择性；同时，将二茂铁、甲基蓝两种电活性物质引入传感体系中，可分别起到内参比作用以及信号放大作用。该比例型信号放大适体传感器的构建方法，具有灵敏度高、稳定性好、方法简单、成本效益高等优点。

Description

一种三维石墨烯基比例型信号放大适体传感器及其制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及一种三维石墨烯基比例型信号放大适体传感器及其制备方法与应用，属于新型功能化纳米材料以及电化学生物传感技术领域。
背景技术
肿瘤是对人类生命健康造成严重威胁的重大疾病。肿瘤标志物的检测对肿瘤的及时发现和早期治疗起关键作用。粘蛋白1(Mucin1，MUC1)是一种高分子量(>200KD)的糖蛋白，因其在肿瘤组织中异常表达，目前已被用于肿瘤早期诊断和生物治疗。
MUC1在大多数恶性肿瘤上皮细胞表面会呈现异常表达，比如乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、结直肠癌等等。在正常人体内的上皮细胞中，MUC1的表达量甚微。因此，血清中MUC1含量的高灵敏、高选择性检测对肿瘤临床诊断，尤其是对乳腺癌、卵巢癌的早期筛查具有十分重要的意义。
血清中MUC1含量的测定，目前已报道的方法有酶联免疫吸附测定法、表面增强拉曼法、荧光分析法、电化学发光法等。然而，现有的检测方法仍然存在一些不足，比如灵敏度较低、选择性较差、检测成本较高等。目前亟需一种灵敏度高、选择性好、分析速度快、反应条件温和、制备简单、成本效益高的方法用于MUC1含量的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种三维石墨烯基比例型信号放大适体传感器，以实现MUC1含量的高灵敏、高选择性以及低成本检测，克服现有技术中MUC1检测方法的不足。
本发明所提供的三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将金纳米-三维石墨烯复合材料修饰于玻碳电极表面，得到金纳米-三维石墨烯修饰电极；
(2)将巯基化二茂铁标记MUC1适体嫁接于所述金纳米-三维石墨烯修饰电极表面，得到二茂铁标记MUC1适体/金纳米-三维石墨烯修饰电极；
(3)将所述二茂铁标记MUC1适体/金纳米-三维石墨烯修饰电极上的非特异性吸附位点进行封闭后，浸于不同浓度的MUC1溶液中进行孵育，得到捕获MUC1的修饰电极；
(4)将所述捕获MUC1的修饰电极浸于甲基蓝标记MUC1适体的金纳米复合物的溶液中进行孵育，即得到所述三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器。
上述的制备方法中，所述金纳米-三维石墨烯复合材料按照包括如下步骤的方法制备：
配制氧化石墨烯悬乳液和四氯金酸的混合溶液，向所述混合溶液中加入聚乙二醇，进行反应即得所述金纳米-三维石墨烯复合材料。
上述的制备方法中，所述反应的温度为160～180℃，时间为12～16h；
所述反应结束后经离心得到黑色沉淀物；
所述方法包括对所述黑色沉淀物进行如下处理：
向所述黑色沉淀物中加入水，混匀后置于液氮中进行冷冻，并于-59℃冷冻干燥机内进行干燥处理1～2d。
上述的制备方法中，步骤(1)中，所述修饰步骤之前，对所述玻碳电极进行如下预处理：首先采用三氧化二铝抛光粉(粒径为0.3μm、0.05μm)处理，然后依次用乙醇和水超声清洗，再用氮气吹干表面备用；
所述修饰步骤如下：
将所述金纳米-三维石墨烯复合材料的分散液滴涂于所述玻碳电极表面，经(室温)晾干即可。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述嫁接步骤如下：
将所述金纳米-三维石墨烯修饰电极浸于所述巯基化二茂铁标记MUC1适体的溶液中进行孵育；
所述孵育的时间为30～90min；
所述孵育结束后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，以除去未结合或弱结合于电极表面的适体。
上述的制备方法中，步骤(3)中，所述封闭步骤如下：
将牛血清蛋白(质量分数为0.5％～1.5％)滴涂于所述二茂铁标记MUC1适体/金纳米-三维石墨烯修饰电极表面并孵育15～60min，然后采用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
于所述MUC1溶液中孵育的时间为20～60min，然后采用所述磷酸盐缓冲溶液冲洗，以除去弱结合于适体上的蛋白。
上述的制备方法中，步骤(4)中，向四氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠，经回流反应得到金纳米颗粒；
向所述金纳米颗粒的分散液中加入巯基化甲基蓝标记MUC1适体溶液，经孵育得到所述甲基蓝标记MUC1适体的金纳米复合物；
所述孵育包括如下步骤：
于25℃摇床轻微振荡孵育16～20h；然后转入含0.1M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液中孵育20～24h；再用含0.1M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液离心(12000rmp，10min)洗涤数次。
上述的制备方法中，步骤(4)中，所述孵育的时间为30～60min，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗。
本发明上述制备得到的三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器可用于电化学工作站三电极体系进行交流伏安法(ACV)检测，用于检测肿瘤标志物MUC1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用金纳米-三维石墨烯复合物作为修饰电极的基底材料，三维石墨烯具有比表面积大、机械性能好、生物相容性好等优点，其存在可以大大提高电极的表面积；并且，附着于三维石墨烯表面的金纳米颗粒不仅能够增强电极导电性，还有利于嫁接更多的适配体从而提高检测的灵敏度。
(2)本发明将巯基化二茂铁标记MUC1适体用于捕获粘蛋白分析物，能够克服抗体分析稳定性较差、制备较复杂以及成本高等缺点，既可以提高分析的灵敏度，又可以提高检测的选择性。同时，二茂铁在电极表面的电信号可以作为内参比，从而有利于检测方法准确性的提高。
(3)本发明将甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物用作信号放大元件。当二茂铁标记MUC1适体将目标粘蛋白捕获后，再用甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物与电极共同孵育，电极表面的粘蛋白会与甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物结合。由于金纳米颗粒表面结合有较多的甲基蓝标记适体，则电极表面上一分子的粘蛋白可以将多分子的甲基蓝标记MUC1适体结合到电极表面，从而产生较强的甲基蓝电信号以起到信号放大的作用。
(4)本发明将二茂铁、甲基蓝两种电活性物质同时引入传感体系，两种电活性物质可以分别产生相应的电化学信号。其中，二茂铁信号起内参比作用，甲基蓝信号起信号放大作用，由此形成了比例型信号放大电化学传感机制，本方法具有灵敏度高、方法简单、准确性高等优点。
附图说明
图1是三维石墨烯基比例型信号放大适体传感器的制备原理图。
图2是氧化石墨烯(GO)、还原氧化石墨烯(RGO)、金纳米-三维石墨烯(Au-RGO)材料的X射线衍射(XRD)表征图谱。
图3是金纳米颗粒的透射电镜(TEM)表征图。
图4是电极逐层修饰以及捕获目标蛋白后的阻抗(EIS)表征图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器，通过以下方法制备得到：
(1)采用氧化石墨烯(GO)为基底材料，加入适量四氯金酸(HAuCl4)溶液，并以聚乙二醇(PEG)为还原剂，通过水热反应和冷冻干燥处理，生成金纳米-三维石墨烯复合材料(Au-RGO)；
(2)将Au-RGO修饰到洁净的玻碳电极(GCE)表面，得到金纳米-三维石墨烯修饰电极(Au-RGO/GCE)；并通过金硫键相互作用将巯基化二茂铁标记MUC1适体(Fc-Apt)嫁接到电极表面，得到二茂铁标记MUC1适体/金纳米-三维石墨烯修饰电极(Fc-Apt/Au-RGO/GCE)；
(3)采用牛血清蛋白(BSA)掩盖修饰电极Fc-Apt/Au-RGO/GCE上的非特异性吸附位点，得到封闭后的修饰电极BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE；再将BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE浸没于含有不同浓度MUC1的溶液中进行孵育；孵育结束后，取出电极并洗涤，得到捕获有目标蛋白的修饰电极MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE；
(4)以柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)和四氯金酸(HAuCl4)溶液为原料制备金纳米颗粒；并将巯基化甲基蓝标记MUC1适体(MB-Apt)与金纳米溶液共同孵育，得到嫁接有甲基蓝标记MUC1适体的金纳米复合物(MB-Apt@Au)；
(5)将(3)中捕获有目标蛋白的修饰电极MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE浸没于含有适量MB-Apt@Au的溶液中进行孵育，所得的MB-Apt@Au/MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE用于电化学工作站三电极体系进行交流伏安法(ACV)检测。
经过试验发现，不同的工艺参数对得到的三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器具有一定的影响，本发明从提高检测灵敏度的角度出发，经过对各个步骤工艺参数的筛选优化，得到一种三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器的制备方法。
本发明通过水热反应和冷冻干燥处理制备了用作修饰电极基底材料的金纳米-三维石墨烯复合物(Au-RGO)。三维石墨烯具有比表面积大、机械性能好、生物相容性好等优点，其存在能够大大提高电极的表面积；且附着于三维石墨烯表面的金纳米颗粒不但可以增强电极导电性，还有利于嫁接更多的巯基化二茂铁标记粘蛋白适体以提高检测的灵敏度。具体地，金纳米-三维石墨烯复合物的制备方法可按照如下工艺进行：
(1)将3～6mg氧化石墨烯于1～3ml超纯水中超声分散1～2h，得到分散均匀的氧化石墨烯悬乳液；
(2)将(1)中氧化石墨烯悬乳液稀释到6～8mL，再加入100～300μL四氯金酸溶液(1％,w/w)混合均匀；然后将15～30mg聚乙二醇加入2～4mL超纯水中，待其充分溶解后再加入到氧化石墨烯与四氯金酸的混合溶液中，并超声处理0.5～1.5h以使其充分混合均匀。
(3)将(2)中混合溶液转入25mL水热反应装置，于160～180℃烘箱中反应12～16h后冷却至室温。将反应产物取出后用超纯水离心洗涤三次，保留所得黑色沉淀物。
(4)向沉淀物中加入5～10mL超纯水，混匀后置于液氮中快速冷冻，并于-59℃冷冻干燥机内进行干燥处理，1～2d后所得黑色絮状物即为金纳米-三维石墨烯复合物。
本发明以四氯金酸溶液为原料，以柠檬酸三钠为还原剂，通过加热回流的方式制备了金纳米颗粒。所制备的金纳米颗粒用于嫁接巯基化甲基蓝标记MUC1适体以起信号放大作用。具体地，金纳米颗粒以及甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物可按照如下工艺进行
(1)取50～100mL浓度为1mM的四氯金酸溶液于加热回流装置中，在磁子搅拌条件下加热至剧烈沸腾；
(2)向(1)中迅速加入8～15mL浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液，再次加热回流5～15min；
(3)停止加热后于搅拌条件下冷却至室温，并将所得酒红色的金纳米转移到棕色试剂瓶中置于4℃冰箱备用。
(4)取1～3mL(3)中制得的金纳米，并向其中加入150～250μL浓度为50μM的甲基蓝标记粘蛋白适体溶液，于25℃摇床轻微振荡孵育16～20h；
(5)将(4)中液体转入含0.1M氯化钠(NaCl)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中孵育20～24h；然后用含0.1M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液离心(12000rmp,10min)洗涤三次；
(6)将(5)中离心所得甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物(MB-Apt@Au)溶解于1～3mL Tris-EDTA缓冲溶液中，并置于4℃冰箱中备用。
本发明三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器可按照如下工艺进行：
(1)对玻碳电极(GCE)进行预处理：将玻碳电极(直径为3mm)依次用粒径为0.3μm、0.05μm的三氧化二铝抛光粉处理，并先后用乙醇、超纯水超声清洗干净，再用氮气吹干电极表面备用；
(2)取1mg金纳米-三维石墨烯复合物(Au-RGO)溶解于1～2mL超纯水中，并超声处理0.5～1.5h得到均匀的分散液；取3～10μL金纳米-三维石墨烯复合物分散液滴涂于玻碳电极表面，于室温下晾干，得到修饰电极Au-RGO/GCE；
(3)将Au-RGO/GCE浸没于20～60μL浓度为2～4μM的巯基化二茂铁标记MUC1适体溶液中孵育30～90min，取出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，以除去未结合或弱结合于电极表面的适体，得到修饰电极Fc-Apt/Au-RGO/GCE；
(4)将4～8μL质量分数为0.5％～1.5％的牛血清蛋白滴涂于Fc-Apt/Au-RGO/GCE表面，并孵育15～60min以封闭传感界面的非特异性结合位点，取出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，得到修饰电极BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE；
(5)将掩盖后的修饰电极BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE浸没于30～60μL含有某浓度MUC1的溶液中孵育20～60min，取出后将电极用磷酸盐缓冲溶液冲洗以除去弱结合于适体上的蛋白，得到捕获有粘蛋白的修饰电极MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE；
(6)将捕获有粘蛋白的修饰电极MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE浸没于30～50μL甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物(MB-Apt@Au)中孵育30～60min，取出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，以除去弱结合于电极表面的适体-金纳米复合物，得到的MB-Apt@Au/MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE可用于电化学工作站三电极体系进行交流伏安法(ACV)检测。
经过试验验证，不同的制备方法使得检测的灵敏度和准确性存在一定的差异。本发明针对粘蛋白的检测，首先制备了金纳米-三维石墨烯复合物作为修饰电极的基底材料，基于三维石墨烯具有比表面积大、机械性能好、生物相容性好等优点，其采用可以大大提高电极的表面积；并且附着于三维石墨烯表面的金纳米颗粒不仅能够增强电极导电性，还有利于嫁接更多的二茂铁标记粘蛋白适体以捕获较多的目标蛋白，从而提高检测的灵敏度。同时，二茂铁在电极表面产生的电信号可作为内参比信号，有利于增强检测体系的抗干扰能力，提高检测结果的准确性。
本发中的粘蛋白适体是针对MUC1蛋白特异性筛选得到的，在本发明的一些技术方案中，所述粘蛋白适体是按照已报道文献设计的序列，并在原适体序列基础上分别进行了巯基化处理，以及进行了二茂铁、甲基蓝两种电活性物质的修饰。与采用抗体分析的方法相比较，适体具有性质稳定、可长期保存、容易大量合成以及成本低等优势。
本发明合成了粒度均匀的金纳米颗粒，并采用巯基化甲基蓝标记MUC1适体与其结合，进而用作信号放大元件。当电极表面的二茂铁标记MUC1适体将目标粘蛋白捕获后，再用甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物与电极共同孵育，电极表面的粘蛋白会与甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物结合。由于金纳米颗粒表面结合有较多的甲基蓝标记适体，则电极表面上一分子的粘蛋白可以将多分子的甲基蓝标记MUC1适体结合到电极表面，从而产生较强的甲基蓝电信号以起到信号放大的作用。
本发明将二茂铁、甲基蓝两种电活性物质同时引入传感体系，两种电活性物质可以分别产生相应的电化学信号。其中，二茂铁信号起内参比作用，甲基蓝信号起信号放大作用，由此形成了比例型信号放大电化学传感机制，本方法具有灵敏度高、方法简单、准确性高等优点。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1、金纳米-三维石墨烯复合材料(Au-RGO)的制备
(1)将5mg氧化石墨烯于1ml超纯水中超声分散2h，得到分散均匀的氧化石墨烯悬乳液；
(2)将(1)中氧化石墨烯悬乳液稀释到6mL，再加入200μL四氯金酸溶液(1％,w/w)混合均匀；然后将25mg聚乙二醇加入4mL超纯水中，待其充分溶解后再加入到氧化石墨烯与四氯金酸的混合溶液中，并超声处理1h以使其充分混合均匀。
(3)将(2)中混合溶液转入25mL水热反应装置，于160℃烘箱中反应12h后冷却至室温。将反应产物取出后用超纯水离心洗涤三次，保留所得黑色沉淀物。
(4)向沉淀物中加入8mL超纯水，混匀后置于液氮中快速冷冻，并于-59℃冷冻干燥机内进行干燥处理，2d后所得黑色絮状物即为金纳米-三维石墨烯复合物。
图2分别是氧化石墨烯(GO)、还原氧化石墨烯(RGO)、金纳米-三维石墨烯(Au-RGO)材料的X射线衍射表征图谱。GO在11.27o处存在C(001)峰，经过水热还原反应后所得RGO、Au-RGO材料在该位置的峰消失，且在24.18o处出现了C(002)峰，表明GO已被还原为RGO；同时，在Au-RGO材料的图谱中，37.98o、44.37o、64.55o、77.59o处分别对应Au(111)、(200)、(220)、(311)晶面，表明金纳米粒子的生成。
实施例2、金纳米-三维石墨烯复合材料(Au-RGO)的制备
(1)将4mg氧化石墨烯于1ml超纯水中超声分散1h，得到分散均匀的氧化石墨烯悬乳液；
(2)将(1)中氧化石墨烯悬乳液稀释到8mL，再加入150μL四氯金酸溶液(1％,w/w)混合均匀；然后将20mg聚乙二醇加入2mL超纯水中，待其充分溶解后再加入到氧化石墨烯与四氯金酸的混合溶液中，并超声处理0.5h以使其充分混合均匀。
(3)将(2)中混合溶液转入25mL水热反应装置，于170℃烘箱中反应15h后冷却至室温。将反应产物取出后用超纯水离心洗涤三次，保留所得黑色沉淀物。
(4)向沉淀物中加入5mL超纯水，混匀后置于液氮中快速冷冻，并于-59℃冷冻干燥机内进行干燥处理，2d后所得黑色絮状物即为金纳米-三维石墨烯复合物，其X射线衍射表征图谱与图2基本一致。
实施例3、金纳米颗粒以及甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物的制备：
(1)取80mL浓度为1mM的四氯金酸溶液于加热回流装置中，在磁子搅拌条件下加热至剧烈沸腾；
(2)向(1)中迅速加入10mL浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液，再加热回流10min；
(3)停止加热后于搅拌条件下冷却至室温，并将所得酒红色的金纳米转移到棕色试剂瓶中置于4℃冰箱备用。
如图3所示，所合成的粒度均匀的金纳米颗粒直径约为15nm。
(4)取1mL(3)中制得的金纳米，并向其中加入150μL浓度为50μM的甲基蓝标记MUC1适体溶液，于25℃摇床轻微振荡孵育16h；
(5)将(4)中液体转入含0.1M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液中孵育20h；然后用含0.1M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液离心(12000rmp,10min)洗涤三次；
(6)将(5)中离心所得甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物(MB-Apt@Au)溶解于1mLTris-EDTA缓冲溶液中，并置于4℃冰箱中备用。
实施例4、金纳米颗粒以及甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物的制备
(1)取100mL浓度为1mM的四氯金酸溶液于加热回流装置中，在磁子搅拌条件下加热至剧烈沸腾；
(2)向(1)中迅速加入15mL浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液，再加热回流15min；
(3)停止加热后于搅拌条件下冷却至室温，并将所得酒红色的金纳米转移到棕色试剂瓶中置于4℃冰箱备用。
(4)取2mL(3)中制得的金纳米，并向其中加入250μL浓度为50μM的甲基蓝标记MUC1适体溶液，于25℃摇床轻微振荡孵育20h；
(5)将(4)中液体转入含0.1M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液中孵育24h；然后用含0.1M氯化钠的磷酸盐缓冲溶液离心(12000rmp，10min)洗涤三次；
(6)将(5)中离心所得甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物(MB-Apt@Au)溶解于1.5mL Tris-EDTA缓冲溶液中，并置于4℃冰箱中备用。
实施例5、三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器的制备
原理示意图如图1所示。
如图1所示，此种方法，包括以下步骤：
(1)对玻碳电极(GCE)进行预处理：将玻碳电极(直径为3mm)依次用粒径为0.3μm、0.05μm的三氧化二铝抛光粉处理，并先后用乙醇、超纯水超声清洗干净，再用氮气吹干电极表面备用；
(2)取1mg金纳米-三维石墨烯复合物(Au-RGO)溶解于1mL超纯水中，并超声处理1h得到均匀的分散液；取5μL金纳米-三维石墨烯复合物分散液滴涂于玻碳电极表面，于室温下晾干，得到修饰电极Au-RGO/GCE；
(3)将Au-RGO/GCE浸没于40μL浓度为2μM的巯基化二茂铁标记MUC1适体溶液中孵育40min，取出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，以除去未结合或弱结合于电极表面的适体，得到修饰电极Fc-Apt/Au-RGO/GCE；
(4)将5μL质量分数为1％的牛血清蛋白滴涂于Fc-Apt/Au-RGO/GCE表面，并孵育30min以封闭传感界面的非特异性结合位点，取出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，得到修饰电极BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE；
(5)将掩盖后的修饰电极BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE浸没于40μL含有某浓度MUC1的溶液中孵育30min，取出电极后用磷酸盐缓冲溶液冲洗以除去弱结合于适体上的蛋白，得到捕获有粘蛋白的修饰电极MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE；
(6)将捕获有粘蛋白的修饰电极MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE浸没于40μL甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物(MB-Apt@Au)中孵育30min，取出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，以除去弱结合于电极表面的适体-金纳米复合物，得到MB-Apt@Au/MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE即可用于电化学工作站三电极体系进行交流伏安法(ACV)检测。
如图4所示，电极经修饰、封闭、捕获目标蛋白、结合信号放大元件后，对应的阻抗谱发生了相应的变化，表明该方法对电极层层组装修饰以及用于粘蛋白检测的可行性。
实施例6、三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器的制备
(1)对玻碳电极(GCE)进行预处理：将玻碳电极(直径为3mm)依次用粒径为0.3μm、0.05μm的三氧化二铝抛光粉处理，并先后用乙醇、超纯水超声清洗干净，再用氮气吹干电极表面备用；
(2)取1mg金纳米-三维石墨烯复合物(Au-RGO)溶解于1.5mL超纯水中，并超声处理0.5h得到均匀的分散液；取6μL金纳米-三维石墨烯复合物分散液滴涂于玻碳电极表面，于室温下晾干，得到修饰电极Au-RGO/GCE；
(3)将Au-RGO/GCE浸没于30μL浓度为2μM的巯基化二茂铁标记MUC1适体溶液中孵育50min，取出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，以除去未结合或弱结合于电极表面的适体，得到修饰电极Fc-Apt/Au-RGO/GCE；
(4)将4μL质量分数为1％的牛血清蛋白滴涂于Fc-Apt/Au-RGO/GCE表面，并孵育20min以封闭传感界面的非特异性结合位点，取出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，得到修饰电极BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE；
(5)将掩盖后的修饰电极BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE浸没于50μL含有某浓度MUC1的溶液中孵育40min，取出电极后用磷酸盐缓冲溶液冲洗以除去弱结合于适体的蛋白，得到捕获有粘蛋白的修饰电极MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE；
(6)将捕获有粘蛋白的修饰电极MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE浸没于30μL甲基蓝标记MUC1适体-金纳米复合物(MB-Apt@Au)中孵育50min，取出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，以除去弱结合于电极表面的适体-金纳米复合物，得到MB-Apt@Au/MUC1/BSA/Fc-Apt/Au-RGO/GCE可用于电化学工作站三电极体系进行交流伏安法(ACV)检测。
本实施例中，电极经修饰、封闭、捕获目标蛋白、结合信号放大元件后，对应的阻抗谱具有与图4相同的变化趋势，表明该方法对电极层层组装修饰以及用于粘蛋白检测的可行性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)将金纳米-三维石墨烯复合材料修饰于玻碳电极表面，得到金纳米-三维石墨烯修饰电极；
(2)将巯基化二茂铁标记MUC1适体嫁接于所述金纳米-三维石墨烯修饰电极表面，得到二茂铁标记MUC1适体/金纳米-三维石墨烯修饰电极；
(3)将所述二茂铁标记MUC1适体/金纳米-三维石墨烯修饰电极上的非特异性吸附位点进行封闭后，浸于不同浓度的MUC1溶液中进行孵育，得到捕获MUC1的修饰电极；
(4)将所述捕获MUC1的修饰电极浸于甲基蓝标记MUC1适体的金纳米复合物的溶液中进行孵育，即得到所述三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述金纳米-三维石墨烯复合材料按照包括如下步骤的方法制备：
配制氧化石墨烯悬乳液和四氯金酸的混合溶液，向所述混合溶液中加入聚乙二醇，进行反应即得所述金纳米-三维石墨烯复合材料。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述反应的温度为160～180℃，时间为12～16h；
所述反应结束后经离心得到黑色沉淀物；
所述方法包括对所述黑色沉淀物进行如下处理：
向所述黑色沉淀物中加入水，混匀后置于液氮中进行冷冻，并于-59℃冷冻干燥机内进行干燥处理1～2d。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述修饰步骤之前，对所述玻碳电极进行如下预处理：首先采用三氧化二铝抛光粉处理，然后依次用乙醇和水清洗；
所述修饰步骤如下：
将所述金纳米-三维石墨烯复合材料的分散液滴涂于所述玻碳电极表面，经晾干即可。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述嫁接步骤如下：
将所述金纳米-三维石墨烯修饰电极浸于所述巯基化二茂铁标记MUC1适体的溶液中进行孵育；
所述孵育的时间为30～90min；
所述孵育结束后用磷酸盐缓冲溶液冲洗。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述封闭步骤如下：
将牛血清蛋白滴涂于所述二茂铁标记MUC1适体/金纳米-三维石墨烯修饰电极表面并孵育15～60min，然后采用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
于所述MUC1溶液中孵育的时间为20～60min，然后采用所述磷酸盐缓冲溶液冲洗。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，向四氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠，经回流反应得到金纳米颗粒；
向所述金纳米颗粒的分散液中加入巯基化甲基蓝标记MUC1适体溶液，经孵育得到所述甲基蓝标记MUC1适体的金纳米复合物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述孵育的时间为30～60min，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗。
9.权利要求1-8中任一项所述方法制备的三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器。
10.权利要求9所述三维石墨烯基比例型信号放大适体电化学传感器在检测肿瘤标志物MUC1中的应用。
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