CN113720887A - 一种肿瘤细胞快检电化学生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肿瘤细胞快检电化学生物传感器,包括柔性丝网印刷电极以及沉积在柔性丝网印刷电极表面的金纳米颗粒,金纳米颗粒的表面修饰有巯基化叶酸分子,且柔性丝网印刷电极表面被牛血清白蛋白封闭;或者包括柔性丝网印刷电极以及修饰在柔性丝网印刷电极表面的金纳米颗粒‑巯基化叶酸分子复合物,且柔性丝网印刷电极表面被牛血清白蛋白封闭;本发明还公开了采用滴涂法的制备方法;本发明还公开了在该电化学生物传感器中滴加样品液孵育并采用电化学工作站检测电化学阻抗的应用过程。本发明传感器与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性结合能力较强,实现了对肿瘤细胞的快速检测;本发明的制备方法简单;本发明的应用过程提高了肿瘤细胞的检测效率。
Description
技术领域
本发明属于快速检测技术领域,具体涉及一种肿瘤细胞快检电化学生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤在全世界范围内呈上升趋势,恶性肿瘤通常发现晚、进展快,目前仍缺乏有效的早期检测方式。将研究重点放在肿瘤的二级预防,通过筛查手段发现癌前病变和早期恶性肿瘤有利于早期干预的实施以降低发病率和死亡率。因此,开展快速、简便的筛查工作具有重大意义。临床中通过对由组织检查等方法获得的肿瘤样本进行实验室检查评估疾病,现有技术也提出了各种方法用于捕获及检测癌细胞。考虑到临床实验室高强度、高负荷的工作条件,快速高效和无标记的检测方法成为各种生物医学诊断和治疗的首选。
电化学阻抗谱是电化学生物传感器的一种无标记检测技术,具有灵敏度高,特异性强,响应迅速的特点,在活细胞的检测中具有广泛应用,适用于快速、简便的临床检测分析方法。
叶酸受体是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白,分子量为38-40kD,其可与外源性叶酸结合摄取叶酸,维持机体正常的生命活动。叶酸受体广泛分布在正常组织及肿瘤组织中,但其在肿瘤组织中数量及活性远高于正常细胞,有时可比正常组织高出100-300倍。目前已鉴定出的三种叶酸受体异构体,包括叶酸受体-α、叶酸受体-β和叶酸受体-γ。其中叶酸受体-α的表达有很强的组织及肿瘤的特异性,在正常组织及细胞中表达水平很低,而上皮细胞一旦癌变,其表达量会剧烈增加,如在大部分上皮组织来源恶性肿瘤,包括子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌和鼻咽癌等细胞中存在高度表达。因此,基于叶酸受体的表达差异及其对叶酸的高亲和力,FR-α成为肿瘤的一个有吸引力的靶点,叶酸分子成为特异性捕获和检测叶酸受体阳性肿瘤细胞的理想分子。
在各种报道的基于叶酸功能化的生物传感器中,许多纳米材料被用于检测癌细胞,如碳纳米管、金纳米颗粒、石墨烯和树枝状聚合物等,但是这些方法中叶酸多由EDC/NHS的酸胺缩合反应共价固定在电极表面,该反应步骤复杂,反应时间长,反应条件严格。从商业化及重复性的角度考虑,一种简单、稳定、统一的叶酸固定方法将使基于叶酸功能化的生物传感器更易于商业化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足,提供一种肿瘤细胞快检电化学生物传感器。该传感器通过在柔性丝网印刷电极表面沉积具有大比表面积的金纳米颗粒并采用巯基化叶酸分子修饰,或者直接采用金纳米颗粒-巯基化叶酸分子复合物修饰柔性丝网印刷电极表面,提高了巯基化叶酸分子的吸附量,增强了传感器与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性结合能力,有利于实现对肿瘤细胞的快速检测。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:一种肿瘤细胞快检电化学生物传感器,其特征在于,包括柔性丝网印刷电极以及沉积在柔性丝网印刷电极表面的金纳米颗粒,所述金纳米颗粒的表面修饰有巯基化叶酸分子,且所述柔性丝网印刷电极表面被牛血清白蛋白封闭;
或者包括柔性丝网印刷电极以及修饰在柔性丝网印刷电极表面的金纳米颗粒-巯基化叶酸分子复合物,且所述柔性丝网印刷电极表面被牛血清白蛋白封闭。
基于金纳米颗粒具有大的比表面积,良好的导电性及生物相容性,同时金纳米颗粒与硫醇类分子间存在固有化学吸附,可以形成稳定的金硫键,本发明的肿瘤细胞快检电化学生物传感器采用柔性丝网印刷电极SPE作为传感基体沉积具有大的比表面积的金纳米颗粒,利用金纳米颗粒Au Nps具有丰富的表面功能和良好的生物相容性,使其稳定沉积在SPE表面,并提供了较大的比表面积,然后利用巯基与金纳米颗粒的固有化学吸附性,使得巯基化叶酸分子吸附在金纳米颗粒的表面进行修饰;或者先利用巯基与金纳米颗粒的固有化学吸附性,制备金纳米颗粒-巯基化叶酸分子复合物,然后将其修饰在SPE表面,构建叶酸-金纳米颗粒修饰的电化学生物传感器,提高了电化学生物传感器对巯基化叶酸分子的吸附量,进而增强了传感器与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性结合能力,提高了结合速度,尤其是提高传感器与肿瘤细胞膜蛋白中的叶酸受体的特异性结合速度,从而电化学生物传感器中SPE的表面阻抗发生变化,并及时转化为电信号进行检测,有利于实现对肿瘤细胞的快速检测;同时,电化学生物传感器中柔性丝网印刷电极表面被牛血清白蛋白封闭,通过牛血清白蛋白覆盖SPE表面对其进行封闭,避免了传感器中非特异性结合位点发生非特异性结合对检测结果造成影响,减少了外界因素干扰,进一步提高了传感器特异性和灵敏度。另外,本发明的肿瘤细胞快检电化学生物传感器采用即抛型的柔性丝网印刷电极SPE作为传感基体,成本低,性能稳定,避免交叉污染。
综上,本发明的肿瘤细胞快检电化学生物传感器原料易得、制备简单,成本低,易于商业化,灵敏度高,特异性强,响应迅速,稳定地实现肿瘤细胞的快速、准确检测,且准确的检查结果将有利于癌前病变和早期恶性肿瘤的早诊断早治疗,同时,高效、快速的实验室检查将缓解目前临床实验室高强度、高负荷的工作现状。
另外,本发明还提供了一种制备上述的肿瘤细胞快检电化学生物传感器芯片的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
步骤一、采用电沉积法将氯金酸溶液滴加于柔性丝网印刷电极SPE的表面,并沉积形成金纳米颗粒Au Nps,得到Au Nps-SPE;
步骤二、采用滴涂法将巯基化叶酸分子溶液滴加于步骤一中得到的Au Nps-SPE的表面,使得巯基化叶酸分子Fa-PEG-SH连接在Au Nps的表面上进行修饰,得到Fa-PEG-SH-AuNps-SPE;
步骤三、将牛血清白蛋白溶液滴加于步骤二中得到的Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE上进行封闭,然后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗,得到电化学生物传感器。
本发明采用电沉积法在柔性丝网印刷电极SPE的表面沉积金纳米颗粒Au Nps,有利于促进金纳米颗粒的形成,然后采用滴涂法使得巯基化叶酸分子Fa-PEG-SH连接在AuNps的表面上,提高了Fa-PEG-SH在Au Nps表面的吸附量,再滴加牛血清白蛋白进行封闭,避免了非特异性结合位点的结合干扰,本发明的制备过程简单,原料易得。
本发明还提供了一种制备上述的肿瘤细胞快检电化学生物传感器芯片的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
步骤一、采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备金纳米颗粒Au Nps,然后将Au Nps溶液加入到巯基化叶酸分子Fa-PEG-SH溶液中搅拌,得到金纳米颗粒-巯基化叶酸分子复合物Fa-PEG-SH-Au Nps溶液;
步骤二、依次采用体积分数75%的乙醇溶液和水对柔性丝网印刷电极SPE进行清洗,并采用氮气吹干;
步骤三、采用滴涂法将步骤一中得到的Fa-PEG-SH-Au Nps溶液滴加于步骤二中经吹干后的SPE的表面,使得Fa-PEG-SH-Au Nps修饰在SPE的表面上,得到Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE;
步骤四、将牛血清白蛋白溶液滴加于步骤三中得到的Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE上进行封闭,然后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗,得到电化学生物传感器。
本发明采用还原法制备金纳米颗粒Au Nps,并与巯基化叶酸分子复合,预先得到纳米颗粒-巯基化叶酸分子复合物,然后采用滴涂法使得该复合物修饰在SPE的表面上,得到Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE,保证了Fa-PEG-SH在Au Nps表面的吸附量,再滴加牛血清白蛋白进行封闭,避免了非特异性结合位点的结合干扰。
上述的方法,其特征在于,步骤一中所述氯金酸溶液的浓度为2.5mmol/L~3.0mmol/L。
上述的方法,其特征在于,步骤二中所述巯基化叶酸分子溶液的浓度为50μmol/L~150μmol/L。
上述的方法,其特征在于,步骤三中所述牛血清白蛋白溶液的浓度为0.01mg/mL~10mg/mL,所述封闭的时间为0.5h~1h。
另外,本发明还提供了一种如上述的肿瘤细胞快检电化学生物传感器的应用,其特征在于,该应用的具体过程包括以下步骤:
步骤一、在电化学生物传感器的加样区中滴加样品液,然后放置于培养箱中孵育;
步骤二、将步骤一中经孵育后的电化学生物传感器安装到检测装置中,然后将含有亚铁氰化钾和铁氰化钾的磷酸盐缓冲溶液滴加到电化学生物传感器的加样区;
步骤三、启动与检测装置配套的电化学工作站,对步骤二中滴加了磷酸盐缓冲溶液的电化学生物传感器的加样区进行电化学阻抗检测,获得电化学阻抗值,并进行输出、记录和存储。
本发明的电化学生物传感器应用过程中,先在传感器中滴加样品液,然后进行孵育,如果样品液中含有肿瘤细胞,则肿瘤细胞的膜蛋白叶酸受体充分与传感器表面的巯基化叶酸分子发生特异性结合,使得SPE表面阻抗发生变化,然后在样品区中滴加磷酸盐缓冲溶液后启动电化学工作站,对加样区中的溶液体系进行电化学阻抗检测,利用电化学工作站内置的信号调理转换电路对检测数据进行分析及处理,得到SPE表面阻抗的变化数值,并以声/光/数字信号分别从报警装置和(或)显示装置输出,同时进行记录和存储,该应用过程简单,孵育时间短,阻抗检测快,电化学生物传感器对受检样品液响应迅速,输出结果直观易懂,有效提高了肿瘤细胞的检测效率,有利于在人群中开展肿瘤筛查工作,实现肿瘤的早发现、早诊断、早治疗策略。
上述的应用,其特征在于,步骤一中所述样品液加入量为300μL;所述孵育的温度为37℃,时间为0.5h~1h。
上述的应用,其特征在于,步骤二中所述磷酸盐缓冲溶液中亚铁氰化钾与铁氰化钾的浓度均为1mmol/L,磷酸盐缓冲溶液的滴加量为200μL。
上述的应用,其特征在于,步骤三中所述电化学阻抗检测采用的扫描频率为10mHz~100kHz,在开路电势下施加5mV的AC扰动。
本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明的传感器通过在柔性丝网印刷电极表面沉积具有大比表面积的金纳米颗粒并采用巯基化叶酸分子修饰,或者直接采用金纳米颗粒-巯基化叶酸分子复合物修饰柔性丝网印刷电极表面,提高了巯基化叶酸分子的吸附量,增强了传感器与肿瘤细胞表面叶酸受体特异性结合能力,并及时将柔性丝网印刷电极的表面阻抗变化转化为电信号进行检测,有利于实现对肿瘤细胞的快速检测。
2、本发明的传感器采用牛血清白蛋白对柔性丝网印刷电极表面进行封闭,避免了传感器与肿瘤细胞发生非特异性结合对检测结果造成影响,进一步提高了传感器特异度和灵敏度。
3、本发明的传感器结构简单,检测灵敏度高,特异性强,便于携带使用,有利于提高肿瘤细胞的检测效率。
4、本发明采用电沉积法在柔性丝网印刷电极表面沉积金纳米颗粒,使得金纳米颗粒形成,提高了巯基化叶酸分子在金纳米颗粒表面的吸附量,制备过程简单,原料易得。
5、本发明传感器的应用过程简单,孵育时间短,阻抗检测快,传感器对受检样品液响应迅速,输出结果直观易懂,有效提高了肿瘤细胞的检测效率,有利于在人群中开展肿瘤筛查工作,实现肿瘤的早发现、早诊断、早治疗策略。
下面通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明肿瘤细胞快检电化学生物传感器的制备及应用示意图。
图2为本发明肿瘤细胞快检电化学生物传感器应用过程中的电化学阻抗检测示意图。
图3为本发明实施例1中的SPE、Au Nps-SPE和Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE的循环伏安图。
图4为本发明实施例1中的SPE、Au Nps-SPE、Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE、BSA-Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE以及与肿瘤细胞特异性结合后电化学生物传感器的阻抗体系结果图。
具体实施方式
本发明实施例1~实施例2中采用的水均为去离子水,其余试剂及原料均为分析纯,采用的电化学工作站为德国札纳电化学工作站,型号zennium-E。
实施例1
本实施例的肿瘤细胞快检电化学生物传感器包括柔性丝网印刷电极以及沉积在柔性丝网印刷电极表面的金纳米颗粒,所述金纳米颗粒的表面修饰有巯基化叶酸分子,且所述柔性丝网印刷电极表面被牛血清白蛋白封闭。
本实施例的肿瘤细胞快检电化学生物传感器的制备方法包括以下步骤:
步骤一、依次采用体积分数75%的乙醇溶液和水对柔性丝网印刷电极SPE进行清洗,并采用氮气吹干,然后向2.5mL水中加入2.8mg氯金酸和13.5μL质量浓度为98%的浓硫酸溶液,得到2.8mmol/L氯金酸溶液,将200μL氯金酸溶液滴加于柔性丝网印刷电极SPE的表面,并采用-0.2V的沉淀电压进行沉积10min,形成金纳米颗粒Au Nps,得到Au Nps-SPE;
步骤二、向50mL的水中加入10mg的巯基化叶酸分子,得到100μmol/L的巯基化叶酸分子溶液,然后采用滴涂法将30μL巯基化叶酸分子溶液滴加于步骤一中得到的Au Nps-SPE的表面,在4℃避光静置过夜并进行干燥,使得巯基化叶酸分子Fa-PEG-SH连接在Au Nps的表面上,得到Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE;
步骤三、向10mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中加入1mg的BSA,得到0.1mg/mL的BSA母液,然后稀释至0.01mg/mL,得到BSA溶液,取200μL的BSA溶液滴加于步骤二中得到的Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE上,室温避光静置30min进行封闭,得到BSA-Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE,然后采用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液在摇床上洗涤1h,得到电化学生物传感器。
本实施例肿瘤细胞快检电化学生物传感器的应用过程包括以下步骤:
步骤一、采用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液对电化学生物传感器进行清洗,并采用氮气吹干,然后在电化学生物传感器的加样区中滴加300μL样品液,然后放置于37℃的培养箱中孵育0.5h;
步骤二、采用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液对步骤一中经孵育后的电化学生物传感器进行清洗,并采用氮气吹干,然后安装到检测装置中,再将200μL含有1mmol/L亚铁氰化钾和1mmol/L铁氰化钾的磷酸盐缓冲溶液滴加到电化学生物传感器的加样区;
步骤三、启动与检测装置连接的电化学工作站,对步骤二中滴加了磷酸盐缓冲溶液的电化学生物传感器的加样区进行电化学阻抗检测,电化学阻抗检测采用的扫描频率为10mHz~100kHz,在开路电势下施加5mV的AC扰动,获得电化学阻抗值,并进行输出、记录和存储。
图1为本发明肿瘤细胞快检电化学生物传感器的制备及应用示意图,从图1可以看出,电化学生物传感器的制备及应用过程为:在SPE上沉积Au Nps,然后将Fa-PEG-SH连接在Au Nps上进行修饰,再采用BSA进行封闭,得到电化学生物传感器,向电化学生物传感器中滴加样品液后,样品液中如果存在肿瘤细胞(即图中的cell)则会与Fa-PEG-SH发生特异性结合,经电化学阻抗检测获取数据并进行分析,从而判断样品液中存在肿瘤细胞。
图2为本发明肿瘤细胞快检电化学生物传感器应用过程中的电化学阻抗检测示意图,从图2可以看出,传感器包括电化学生物传感器和用于对电化学生物传感器进行检测的检测装置(包括电化学工作站、信号调理转换电路、信号输出装置及控制装置),电化学生物传感器中设置有加样区用于盛放样品液,还包含工作电极、对电极和参比电极作为导电部件,用于响应电极表面的阻抗变化,各电极通过电线连入电化学工作站,经信号调理转换电路及信号输出装置(包括报警装置、显示装置和记录装置)实现对电化学阻抗数据的采集、转换及输出,控制装置对传感器的开关进行控制。
图3为本实施例中的SPE、Au Nps-SPE和Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE的循环伏安图,从图3可以看出,Au Nps-SPE的峰值电流较SPE明显增大,说明Au Nps已成功修饰于SPE表面;Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE的峰值电流较SPE和Au Nps-SPE均减小,说明Fa-PEG-SH已成功连接于Au Nps。
图4为本发明实施例1中的SPE、Au Nps-SPE、Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE、BSA-Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE以及与肿瘤细胞特异性结合后电化学生物传感器的阻抗体系结果图,从图4可以看出,Au Nps-SPE的阻抗值较SPE明显减小,说明Au Nps已成功修饰于SPE表面,而Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE的阻抗值较Au Nps-SPE及SPE均进一步增大,说明Fa-PEG-SH已成功连接于Au Nps,BSA-Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE的阻抗值进一步增大,说明BSA完成了对非特异性位点的封闭。当电化学生物传感器与肿瘤细胞特异性结合后,其阻抗值继续明显增大,说明本发明的肿瘤细胞快检化学生物传感器对肿瘤细胞具有良好的响应。
实施例2
本实施例的肿瘤细胞快检电化学生物传感器包括柔性丝网印刷电极以及修饰在柔性丝网印刷电极表面的金纳米颗粒-巯基化叶酸分子复合物,且所述柔性丝网印刷电极表面被牛血清白蛋白封闭。
本实施例的肿瘤细胞快检电化学生物传感器的制备方法包括以下步骤:
步骤一、向2mL的水中加入4mg的巯基化叶酸分子Fa-PEG-SH,得到2mg/ml的巯基化叶酸分子溶液,采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备平均粒径13nm的金纳米颗粒Au Nps,然后将0.2mL的Au Nps溶液加入到2mL巯基化叶酸分子Fa-PEG-SH溶液中搅拌24h,得到金纳米颗粒-巯基化叶酸分子复合物Fa-PEG-SH-Au Nps溶液;
步骤二、依次采用体积分数75%的乙醇溶液和水对柔性丝网印刷电极SPE进行清洗,并采用氮气吹干;
步骤三、采用滴涂法将30μL的步骤一中得到的Fa-PEG-SH-Au Nps溶液滴加于步骤二中经吹干后的SPE的表面,在4℃避光静置过夜并进行干燥,使得Fa-PEG-SH-Au Nps修饰在SPE的表面上,得到Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE;
步骤四、向10mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液中加入1mg的BSA,得到0.1mg/mL的BSA母液,然后稀释至0.01mg/mL,得到BSA溶液,取200μL的BSA溶液滴加于步骤三中得到的Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE上,室温避光静置30min进行封闭,得到BSA-Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE,再采用磷酸盐缓冲溶液在摇床上洗涤1h,得到电化学生物传感器。
本实施例肿瘤细胞快检电化学生物传感器的应用过程包括以下步骤:
步骤一、采用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液对电化学生物传感器进行清洗,并采用氮气吹干,然后在电化学生物传感器的加样区中滴加300μL样品液,然后放置于37℃的培养箱中孵育0.5h;
步骤二、采用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液对步骤一中经孵育后的电化学生物传感器进行清洗,并采用氮气吹干,然后安装到检测装置中,再将200μL含有1mmol/L亚铁氰化钾和1mmol/L铁氰化钾的磷酸盐缓冲溶液滴加到电化学生物传感器的加样区;
步骤三、启动与检测装置连接的电化学工作站,对步骤二中滴加了磷酸盐缓冲溶液的电化学生物传感器的加样区进行电化学阻抗检测,电化学阻抗检测采用的扫描频率为10mHz~100kHz,在开路电势下施加5mV的AC扰动,获得电化学阻抗值,并进行输出、记录和存储。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化,均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (10)
1.一种肿瘤细胞快检电化学生物传感器,其特征在于,包括柔性丝网印刷电极以及沉积在柔性丝网印刷电极表面的金纳米颗粒,所述金纳米颗粒的表面修饰有巯基化叶酸分子,且所述柔性丝网印刷电极表面被牛血清白蛋白封闭;
或者包括柔性丝网印刷电极以及修饰在柔性丝网印刷电极表面的金纳米颗粒-巯基化叶酸分子复合物,且所述柔性丝网印刷电极表面被牛血清白蛋白封闭。
2.一种制备如权利要求1所述的肿瘤细胞快检电化学生物传感器的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
步骤一、采用电沉积法将氯金酸溶液滴加于柔性丝网印刷电极SPE的表面,并沉积形成金纳米颗粒Au Nps,得到Au Nps-SPE;
步骤二、采用滴涂法将巯基化叶酸分子溶液滴加于步骤一中得到的Au Nps-SPE的表面,使得巯基化叶酸分子Fa-PEG-SH连接在Au Nps的表面上进行修饰,得到Fa-PEG-SH-AuNps-SPE;
步骤三、将牛血清白蛋白溶液滴加于步骤二中得到的Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE上进行封闭,然后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗,得到电化学生物传感器。
3.一种制备如权利要求1所述的肿瘤细胞快检电化学生物传感器的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
步骤一、采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法制备金纳米颗粒Au Nps,然后将Au Nps溶液加入到巯基化叶酸分子Fa-PEG-SH溶液中搅拌,得到金纳米颗粒-巯基化叶酸分子复合物Fa-PEG-SH-Au Nps溶液;
步骤二、依次采用体积分数75%的乙醇溶液和水对柔性丝网印刷电极SPE进行清洗,并采用氮气吹干;
步骤三、采用滴涂法将步骤一中得到的Fa-PEG-SH-Au Nps溶液滴加于步骤二中经吹干后的SPE的表面,使得Fa-PEG-SH-Au Nps修饰在SPE的表面上,得到Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE;
步骤四、将牛血清白蛋白溶液滴加于步骤三中得到的Fa-PEG-SH-Au Nps-SPE上进行封闭,然后采用磷酸盐缓冲溶液进行清洗,得到电化学生物传感器。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤一中所述氯金酸溶液的浓度为2.5mmol/L~3.0mmol/L。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤二中所述巯基化叶酸分子溶液的浓度为50μmol/L~150μmol/L。
6.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,步骤三中所述牛血清白蛋白溶液的浓度为0.01mg/mL~10mg/mL,所述封闭的时间为0.5h~1h。
7.一种如权利要求1所述的肿瘤细胞快检电化学生物传感器的应用,其特征在于,该应用的具体过程包括以下步骤:
步骤一、在电化学生物传感器的加样区中滴加样品液,然后放置于培养箱中孵育;
步骤二、将步骤一中经孵育后的电化学生物传感器安装到检测装置中,然后将含有亚铁氰化钾和铁氰化钾的磷酸盐缓冲溶液滴加到电化学生物传感器的加样区;
步骤三、启动与检测装置配套的电化学工作站,对步骤二中滴加了磷酸盐缓冲溶液的电化学生物传感器的加样区进行电化学阻抗检测,获得电化学阻抗值,并进行输出、记录和存储。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,步骤一中所述样品液加入量为300μL;所述孵育的温度为37℃,时间为0.5h~1h。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,步骤二中所述磷酸盐缓冲溶液中亚铁氰化钾与铁氰化钾的浓度均为1mmol/L,磷酸盐缓冲溶液的滴加量为200μL。
10.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,步骤三中所述电化学阻抗检测采用的扫描频率为10mHz~100kHz,在开路电势下施加5mV的AC扰动。
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