CN110456051A - 猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器及其制备方法。所述猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器，是将猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体PEDV‑2C11固定于纳米金/二硫化钼/还原石墨烯复合纳米材料修饰的电极表面而构建制得。本发明通过合成纳米金/二硫化钼/还原石墨烯(AuNPs/MoS2/rGO)复合材料来制备免疫传感器，该传感器制备过程更加简便，同时通过事先将纳米金与二硫化钼/还原石墨烯构建复合材料，可维持纳米金在复合材料中的含量保持稳定，同时由于复合纳米材料中可能增加了吸附的的纳米金从而有效地增大了抗体在电极表面的固定量，可提高免疫传感器检测的灵敏度。

Description

猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于动物病原检测领域；具体涉及猪流行性腹泻病毒无标记阻抗型免疫传感器制备方法及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水、精神沉郁等。1971年该病首次报道于英国，我国于1980年首次分离该病毒。各日龄的猪均可感染PEDV发病，其中哺乳仔猪、架子猪、育肥猪等的感染率最高，哺乳仔猪致死率最高。PED一年四季均可发病，自2011年以来，新的变异毒株开始在各地纷纷流行，现已出现在世界各个国家和地区。目前PED已经成为世界流行性疾病，能够快速检测和诊断PEDV，有利于对疫情进行及时控制，能够大大降低猪场的经济损失。
目前，猪流行性腹泻病毒常用的检测方法包括ELISA、荧光定量PCR技术、胶体金抗体检测技术、血清中和试验、原位杂交技术等，这些方法具有一定的局限性，如对抗体进行标记、辐射危害、分析时间长、仪器昂贵、要求操作人员熟练掌握相关实验操作技能等。而免疫传感器是基于抗原抗体特异性识别功能而研制成的一类生物传感器，可分为非标记免疫传感器和标记免疫传感器两大类。目前传感器的种类主要包括质量检测免疫传感器、光学免疫传感器、热量检测免疫传感器和电化学免疫传感器等。相比于其他种类的免疫传感器，电化学免疫传感器有其独到之处，如可以实现在体检测，不受样品颜色、浊度的影响(即样品可以不经处理,不需分离)，所需仪器设备相对简单，根据检测的电信号不同可分为电位型，电流型，电导型、电容型和阻抗型等。特别是阻抗型电化学免疫传感器结合了电化学阻抗的高灵敏性和免疫反应的高特异性，可响应修饰有生物分子的电极界面的电子转移速率的信号变化，以简便、快速、灵敏、响应范围广、不用示踪标记物、不需样品纯化、可进行自动化实时数据输出等优点，突破了以往分析方法的诸多瓶颈，生化检验方面显示出诱人的应用前景。目前，阻抗型电化学免疫主要用于检测疾病生物标志物、食品中的细菌毒素及3-氨基-2-恶唑烷酮残留等。
中国专利ZL201010295008.7公开了一种呋喃它酮残留物无标记的阻抗型免疫传感器，是在金电极表面分别通过1，4-苯二硫醇、纳米金层层组装后固定AMOZ抗体而制得免疫传感器，但制备过程相对复杂，并需要严格控制纳米金组装时间以控制在电极表面的吸附量，从而确保传感器的重复性。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒无标记阻抗型免疫传感器制备方法及其应用。
本发明通过合成纳米金/二硫化钼/还原石墨烯(AuNPs/MoS2/rGO)复合材料来制备免疫传感器，相比与通过自组装方法修饰的纳米金构建的免疫传感器，该传感器制备过程更加简便，同时通过事先将纳米金与二硫化钼/还原石墨烯构建复合材料，可维持纳米金在复合材料中的含量保持稳定，同时由于复合纳米材料中可能增加了吸附的的纳米金从而有效地增大了抗体在电极表面的固定量，可提高了免疫传感器检测的灵敏度。
本发明所说的猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器，是将猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体(PEDV-2C11)固定于纳米金/二硫化钼/还原石墨烯复合纳米材料修饰的电极表面而构建制得。
本发明还公开了所述猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)金纳米粒子的合成
所有制备纳米金的玻璃器皿都在3:1HCl-HNO3溶液浸泡12h。金纳米粒子的制备根据文献进行，将100mL 0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾，在剧烈搅拌的条件下加入2.0mL1.0％的柠檬酸钠溶液，溶液颜色先由无色变成墨色再变成墨绿色，最后为酒红色并呈透明状。
(2)纳米金/二硫化钼/还原石墨烯复合材料(AuNPs/MoS2/rGO)的合成
首先，采用改进的方法合成了MoS2/rGO。在10mL去离子水中加入0.08g Na2MO4·2H2O和6mg GO，超声分散10min。加入0.126g硫脲溶解，将所得混合物超声处理30min后转移到10mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中。将高压釜放入烘箱加热至200℃并保持24h，冷却至室温。以6000rpm/min的速度离心5min收集所得黑色沉淀物，用水和乙醇洗涤数次，然后在60℃下干燥。在反应过程中，氧化石墨烯(GO)被转化为还原的氧化石墨烯(rGO)。随后，将10mg MoS2/rGO加到10mL已经制备好的金纳米(AuNPs)溶液中，在室温下振荡12h，所得AuNPs/MoS2/rGO用水洗涤后6000rpm/min离心5min得到沉淀物，在60℃下干燥收集最终产物。
(3)免疫传感器的制备
用直径为0.15μm的Al2O3抛光液将GCE表面打磨成镜面后，用超纯水进行超声清洗并在氮气流中干燥。待电极完全干燥后，将5μL AuNPs/MoS2/rGO水溶液(2mg/mL)滴到裸GCE表面，室温晾干。
将修饰好的电极浸入200μL 0.15mg/mL抗体的磷酸缓冲溶液(pH 7.0)中，置于4℃下12h。电极取出后放入10mg/mL的牛血清蛋白中(BSA)1h以封闭非特异性位点。用二次水冲洗除去表面多余的BSA，,制备好的电极浸入PBS(pH 7.0)中，置于4℃保存备用。
实验时，将固定了抗体的电极浸入不同浓度猪流行性腹泻病毒(PEDV)的磷酸缓冲溶液(PBS)(pH 7.4)中，置于37.5℃水浴中反应140min后，取出分别用二次水和磷酸缓冲溶液冲洗干净，然后进行电化学阻抗检测。
本发明还公开了使用上述猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器检测猪流行性腹泻病毒的方法，具体是：
(1)建立阻抗的相对变化率％△Rct与PEDV浓度的关系：测定阻抗型免疫传感器的起始阻抗值Rct(BSA)，以及阻抗型免疫传感器分别与不同浓度的猪流行性腹泻病毒标准溶液进行免疫反应后阻抗值Rct(PEDV-Ab)，按公式计算出阻抗的相对变化率％△Rct；阻抗的相对变化率％△Rct与PEDV浓度对数在82.5至1.65×104TCID50/mL范围内呈线性关系，其中所说的免疫反应条件是在pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行，37.5℃温育140min；
(2)按照步骤(1)的方法和条件将阻抗型免疫传感器与待测物溶液进行免疫反应，测定阻抗值，计算得到抗体与PEDV反应后引起阻抗的相对变化率％△Rct；
(3)根据步骤(1)确定的阻抗的相对变化率％△Rct与PEDV浓度的关系，确定出待测物溶液中PEDV含量。
本发明首次利用电化学阻抗技术，通过直接测定抗原-抗体发生免疫反应前后对阻抗测试溶液铁氰化钾和亚铁氰化钾在传感器表面发生氧化还原时电子传递阻抗的改变，制备针对PEDV特异的快速检测无标记型免疫传感器，寻求PEDV浓度与免疫反应前后阻抗变化率之间的关系，实现对PEDV的快速检测。
本发明设计了一种新的阻抗型免疫传感器，合成AuNPs/MoS2/rGO复合材料，并采用电化学阻抗谱学技术对PEDV进行检测。以Fe(CN)6 3-/4-作为探针，通过电化学阻抗谱学检测到PEDV-2C11单克隆抗体与PEDV发生特异性反应后电子传递阻抗增加引起阻抗的变化。在最佳条件下，当PEDV的浓度在82.5至1.65×104TCID50/mL之间,阻抗的相对变化值与其浓度对数呈线性关系。该免疫传感器具有宽检测范围、重复性和选择性。结果表明，该免疫传感器将可用于猪流行性腹泻病(PED)的检测。
附图说明
图1AuNPs/MoS2/rGO复合材料的制备。
图2无标记电化学免疫传感器的构建及与PEDV孵育之前(a)和后(b)阻抗响应的示意图。
图3是抗体浓度对抗体固定后电极阻抗的影响。
图4是免疫反应时间对阻抗相对变化率的影响。
图5是免疫反应溶液的pH对阻抗相对变化率的影响。
图6是免疫反应温度对阻抗相对变化率的影响。
图7是不同PEDV浓度下的阻抗图谱。曲线a到i所对应PEDVD的浓度依次为0.0,82.5,1.65×102,3.3×102,8.25×102,1.65×103,3.3×103,8.25×103和1.65×104TCID50mL-1。
图8阻抗相对变化对PEDV浓度对数的线性拟合曲线。
具体实施方式
本发明中所使用的猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体PEDV-2C11公开于《猪流行性腹泻病毒的流行病学调查及快速检测方法的初步建立》(扬州大学硕士论文，2016-4-1)；申请人单位保存，可向公众提供。
(一)传感器的制备
1.金纳米粒子的合成
所有制备纳米金的玻璃器皿都在3:1HCl-HNO3溶液浸泡12h。金纳米粒子的制备根据文献(Nature Physical Science,1973,241:20-22)行，将100mL 0.01％的HAuCl4溶液加热至沸腾，在剧烈搅拌的条件下加入2.0mL 1.0％的柠檬酸钠溶液，溶液颜色先由无色变成墨色再变成墨绿色，最后为酒红色并呈透明状。
2.AuNPs/MoS2/rGO的合成
图1显示了AuNPs/MoS2/rGO的合成过程。首先，采用改进的方法合成了MoS2/rGO。在10mL去离子水中加入0.08g Na2MO4·2H2O和6mg GO，超声分散10min。加入0.126g硫脲溶解，将所得混合物超声处理30min后转移到10mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中。将高压釜放入烘箱加热至200℃并保持24h，冷却至室温。以6000rpm/min的速度离心5min收集所得黑色沉淀物，用水和乙醇洗涤数次，然后在60℃下干燥。在反应过程中，氧化石墨烯(GO)被转化为还原的氧化石墨烯(rGO)。随后，将10mg MoS2/rGO添加到10mL已制备好的金纳米(AuNPs)溶液中，在室温下振荡12h。所得AuNPs/MoS2/rGO用水洗涤后6000rpm/min离心5min得到沉淀物，在60℃下干燥收集最终产物。
3.免疫传感器的制备
图2显示了在GCE上制备该电化学免疫传感器的过程。用直径为0.15μm的Al2O3抛光液将GCE表面打磨成镜面后，用超纯水进行超声清洗并在氮气流中干燥。待电极完全干燥后，将5μL AuNPs/MoS2/rGO水溶液(2mg/mL)滴到裸GCE表面，室温晾干。
将修饰好的电极浸入200μL 0.15mg/mL抗体的磷酸缓冲溶液(pH 7.0)中，置于4℃下12h。电极取出后放入10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)中1h以封闭非特异性位点。用二次水冲洗除去表面多余的BSA，,制备好的电极浸入PBS(pH 7.0)中，置于4℃保存备用。
实验时，将固定了抗体的电极浸入不同浓度猪流行性腹泻病毒(PEDV)的磷酸缓冲溶液(PBS)(pH 7.4)中，置于37.5℃水浴中反应140min后，取出分别用二次水和磷酸缓冲溶液冲洗干净，然后进行电化学阻抗检测。
(二)检测方法的建立
(1)抗体浓度的影响
传感器对抗原的响应与抗体在电极表面的固定量有关，电极表面单位面积固定的抗体量越多，则可结合抗原的位点就越多，越有利于与抗原分子的结合。在传感器的制备中，当改变抗体用量时，所得传感器的性能呈现明显差异。由图3可见，当抗体浓度小于0.10mg/mL时，随着抗体浓度的增加，Rct逐渐增大；而当抗体浓度在0.10～0.20mg/mL时，Rct基本保持不变。这是由于暴露于免疫电极表面可供抗原反应的活性位点有限，抗体用量达到一定值后即达饱和状态。故本实验选择抗体浓度为0.15mg/mL来固定抗体于电极表面。
(2)抗体-抗原免疫反应条件优化
①温育时间的影响
在免疫反应中，温育时间是衡量免疫反应检测的一个重要因素。本实验中，为了选择免疫反应最佳反应时间，将固定了抗体的电极在浓度为8.25×102mLTCID50/mL磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中温育，检测不同温育时间下的阻抗相对变化值。从图4可以看出：温育时间小于120min时，阻抗的相对变化随着温育时间的延长而增加。当温育时间达到20min后，阻抗的相对变化基本不变，表明抗原的吸附量达到最大。因此，选取140min作为免疫反应的温育时间。
②抗体-抗原反应的pH值的影响
将固定了抗体的电极分别浸入到含不同pH的浓度同为8.25×102mLTCID50/mL的磷酸盐缓冲溶液中温育140min，测量其阻抗的相对变化。结果表明：pH值从6.0到7.4，阻抗的相对变化值逐渐增大，pH值从7.4到8.5，阻抗的相对变化值逐渐减小(图5)。因此，选取pH7.4的磷酸盐缓冲液作为抗体-抗原反应的最佳缓冲液。
③抗体-抗原反应的温育温度的影响
温育温度对电极表面发生的免疫反应有一定的影响。将修饰了抗体的电极浸入浓度为8.25×102mLTCID50/mL的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中温育140min，当温育温度从20增加到50℃时，阻抗的相对变化值在37.5℃时达到最大值(图6)。因此选取37.5℃作为免疫反应最佳温育温度。
(3)干扰试验
选择了以沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和大肠杆菌为干扰物来探讨该免疫传感器的特异性。在浓度为8.25×102mLTCID50/mL溶液中分别加入不同浓度的干扰物质，将固定了抗体的电极浸入其中进行反应，测定其阻抗值(见表1)。从表1可以看出，加入干扰物质后，阻抗只有轻微的变化，其RSD小于5％。由此可见，该免疫传感器具有良好的的特异性。
表1 不同浓度干扰物对8.25×102tcid50 ml-1PEDV的阻抗影响
(三)PEDV检测
配制不同浓度的PEDV标准溶液，将含固定好抗体的修饰电极在上述优化得到的最佳条件下与不同浓度的PEDV标准溶液进行免疫反应。然后将修饰电极、饱和甘汞电极和铂电极三电极体系浸入含5.0mM Fe(CN)6 3-/4-的0.1M KC的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)的阻抗测试溶液中，利用CHI电化学工作站在开路电位和正弦波电位振幅为10mV的条件下，于10-1Hz到105Hz频率范围测定其交流阻抗图谱(图7)，再通过等效电路拟合求得Fe(CN)6 3-/4在修饰电极表面发生氧化还原反应时电子传递的阻抗值，并按公式(1)进行数据处理：
式中：Rct(PEDV-Ab)是PEDV与固定在电极上的抗体复合后的阻抗值，Rct(BSA)是用牛血清蛋白封闭了特异性位点后的阻抗值。
以阻抗的相对变化率对PEDV浓度对数做图，可得在82.5到1.65×104TCID50 mL-1范围内呈良好的线性关系(图8)。据此可进行PEDV残留物含量测定。
为了评价该免疫传感器在分析应用中的应用潜力，测定了阴性猪粪样品中的PEDV浓度。然而，采用方法分析未观察到PEDV阻抗变化的相对变化。因此，通过在添加不同浓度的PEDV的猪粪阴样品，通过测定回收率进一步评价基于该电化学免疫传感器检测PEDV方法的准确性。实验结果表明：在三个不同加样水平下，回收率在93.83～109.15％之间，相对标准偏差(RSD)均小于6.9％，说明该方法具有较好的准确度，可用于实际应用中PEDV的测定。

Claims (3)

1.一种猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器，其特征在于，是将猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体PEDV-2C11固定于纳米金/二硫化钼/还原石墨烯复合纳米材料修饰的电极表面而构建制得。
2.权利要求1所述猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)金胶的制备：制备金纳米粒子溶液；
(2)纳米金/二硫化钼/还原石墨烯复合材料的合成
首先，合成二硫化钼/还原石墨烯：在10mL去离子水中加入0.08g Na2MO4·2H2O和6mg氧化石墨烯，超声分散10min；加入0.126g硫脲溶解，将所得混合物超声处理30min后转移到10mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中；将高压釜放入烘箱加热至200℃并保持24h，冷却至室温；以6000rpm/min的速度离心5min收集所得黑色沉淀物，用水和乙醇洗涤数次，然后在60℃下干燥。在反应过程中，氧化石墨烯被转化为还原的氧化石墨烯；随后，将10mgMoS2/rGO添加到10mL已制备好的金纳米溶液中，在室温下振荡12h，所得AuNPs/MoS2/rGO复合材料用水洗涤后6000rpm/min离心5min得到沉淀物，在60℃下干燥收集最终产物；
(3)免疫传感器的制备
用直径为0.15μm的Al2O3抛光液将GCE表面打磨成镜面后，用超纯水进行超声清洗并在氮气流中干燥，待电极完全干燥后，将5μL AuNPs/MoS2/rGO水溶液滴到裸GCE表面，室温晾干；
将修饰好的电极浸入200μL 0.15mg/mL单克隆抗体PEDV-2C11的磷酸盐缓冲溶液中，置于4℃下12h，电极取出后放入10mg/mL的牛血清蛋白中1h以封闭非特异性位点；用二次水冲洗除去表面多余的牛血清蛋白，制备好的电极浸入pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，置于4℃保存备用；
将固定了抗体的电极浸入不同浓度猪流行性腹泻病毒的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，置于37.5℃水浴中反应140min后，取出分别用二次水和磷酸缓冲溶液冲洗干净，然后进行电化学阻抗检测。
3.用权利要求1所述阻抗型免疫传感器检测猪流行性腹泻病毒的方法，包括以下步骤：
(1)建立阻抗的相对变化率％△Rct与猪流行性腹泻病毒浓度的关系：测定阻抗型免疫传感器的起始阻抗值Rct(BSA)，以及阻抗型免疫传感器分别与不同浓度的猪流行性腹泻病毒标准溶液进行免疫反应后阻抗140min；
(2)按照步骤(1)的方法和条件将阻抗型免疫传感器与待测物溶液进行免疫反应，测定阻抗值，计算得到抗体与猪流行性腹泻病毒反应后引起阻抗的相对变化率％△Rct；
(3)根据步骤(1)确定的阻抗的相对变化率％△Rct与猪流行性腹泻病毒浓度的关系，确定出待测物溶液中猪流行性腹泻病毒含量。
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