CN112415067A - 猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

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张春红
勾红潮
刘志成
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South China Agricultural University
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Abstract

本发明公开了猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器，其由：工作电极、印刷电路板微电极板、固定于印刷电路板微电极板一侧表面上的结合蛋白、猪流行性腹泻病毒特异性抗体、封闭液制备得到；其中，所述结合蛋白特异性结合所述猪流行性腹泻病毒特异性抗体或所述封闭液。本发明制备得到的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器特异性强，敏感性高，操作简便，能快速完成PEDV检测，对于疾病的现场快筛具有极高的应用价值。

Description

猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于生物传感器领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器及其制备方法与应用。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的一种急性高度接触性的猪肠道传染病。患病猪通常会发生腹泻、呕吐和脱水等症状，对养猪业危害巨大。各种年龄段的猪均可感染，发病率较高，尤以哺乳期仔猪受害最重，给养猪业带来巨大的经济损失。
目前PEDV检测方法主要包括传统病毒分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、酶联免疫吸附(ELISA)、逆转录-环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、免疫荧光技术、血清中和试验(SNT)等方法。病毒分离鉴定是诊断PEDV的金标准，具有准确率高的优点，但其操作复杂，检测时间漫长，无法实现现场快速检测的要求。而ELISA、PCR、RT-qPCR、RT-LAMP、免疫荧光技术、SNT等方法存在特异性较差、或敏感性较低、或操作复杂繁琐、或需要昂贵的仪器设备及专业的技术人员，难以实现PEDV在兽医基层的快速检测，不利于在实际使用中对PEDV疫情进行有效监控预警等不同程度的问题。
近年来，生物传感器在病原微生物快速检测中的应用受到国内外学者的重视，但其技术相对不成熟，尤其是对于猪流行性腹泻病毒相关的生物传感器，其开发程度相对较低，因此，亟待能开发出一种的有效解决现有猪流行性腹泻病毒检测技术缺陷的阻抗型免疫生物传感器，以提高猪流行性腹泻病毒检测效率，满足猪流行性腹泻病毒现场快速检测的使用需求。
发明内容
本发明的目的在于提供猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器；
本发明的另一目的在于提供上述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的制备方法；
本发明的另一目的在于提供基于上述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的猪流行性腹泻病毒检测方法；
本发明的另一目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒检测设备；
本发明的另一目的在于提供上述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器在猪流行性腹泻病毒快速定性检测中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器，该猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器由：工作电极、印刷电路板微电极板(PCR微电极板)、固定于印刷电路板微电极板一侧表面上的结合蛋白、连接于所述结合蛋白上的猪流行性腹泻病毒特异性抗体组成。
其中，上述猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器还包括封闭液。
上述结合蛋白特异性结合上述猪流行性腹泻病毒特异性抗体或上述封闭液。
进一步地，上述结合蛋白可结合猪流行性病毒抗体Fc端。
本发明中的印刷电路板微电极板表面固定的特异性抗体与目标病毒之间具有良好的亲和力是保证本发明中的免疫传感器检测性能的重要因素。
其中，当上述猪流行性腹泻病毒特异性抗体完全占据上述结合蛋白的所有可结合的位点或空间时，可以选择不使用封闭液；当上述猪流行性腹泻病毒特异性抗体未能完全占据上述结合蛋白的所有可结合的位点或空间时，加入过量或足量封闭液完全占据上述结合蛋白的剩余可结合的位点或空间，以避免上述结合蛋白在后续检测中结合抗原，产生检测误差。
进一步地，上述印刷电路板微电极板包括：
环氧树脂基片；
固定在环氧树脂基片一侧表面上的若干电极，上述电极为铜电极，上述铜电极表面镀有金涂层；
与上述若干电极相连接的线路。
在本发明的实施例中，上述电极为平行排列，电极长度为6mm；电极宽度均为200μm；电极间的间距均为200μm。
更进一步地，上述环氧树脂为FR-4玻璃环氧树脂。
更进一步地，上述印刷电路板微电极板还包括一个USB端口，用来连接工作电极。
在本发明的实施例中，上述工作电极为电化学工作站电极。
更进一步地，上述金涂层的厚度为100～105nm；上述铜电极的厚度为70～75μm；优选地，上述金涂层的厚度为100nm；上述铜电极的厚度为70μm。
进一步地，上述结合蛋白包括蛋白A。
蛋白A是从A型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分离而得的一种细胞壁蛋白。具有不在抗原结合点而与免疫球蛋白结合的性质，从而能形成含有A蛋白、抗体、抗原的复合物。本发明中的蛋白A可以特异性识别并连接上述猪流行性腹泻病毒特异性抗体IgG的Fc部分，因此，被固定的上述猪流行性腹泻病毒特异性抗体IgG具有Fab端游离的空间取向，从而最大限度保留了抗原结合的能力。本发明中的蛋白A还可以与上述封闭液结合，过量或足量的封闭液可以使本发明中的蛋白A上的可连接部位被完全占据，从而在后续步骤中，本发明中的蛋白A不再具有连接抗原等其他分子的能力。
在本发明实施例中，上述蛋白A来自BCIP/NBT底物显色试剂盒；上述BCIP/NBT底物显色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。
进一步地，上述封闭液包括牛血清蛋白磷酸盐缓冲液(BSA-PBS)。
上述封闭液用于封闭蛋白A中剩余的可连接部位，从而在后续步骤中，使本发明中的蛋白A不再具有连接抗原等其他分子的能力。
进一步地，上述猪流行性腹泻病毒特异性抗体包括猪流行性腹泻病毒S蛋白单克隆抗体。
上述猪流行性腹泻病毒S蛋白单克隆抗体通过本领域常规方法制备得到。
猪流行性腹泻病毒(PEDV)是具有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组中的主要结构蛋白基因有M蛋白(membrane protein)、S蛋白(spike protein)、N蛋白(nucleoprotein)等。S蛋白是跨膜融合蛋白，对病毒入侵和毒力具有重要作用。本发明以S蛋白作为PEDV分子生物学诊断和基因变异检测的主要目标。
本发明的第二个方面，提供：
上述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将上述印刷电路板微电极板接入上述工作电极，在上述的印刷电路板微电极板表面滴加结合蛋白，孵育，得到结合蛋白修饰的微电极板；
(2)在上述结合蛋白修饰的微电极板表面滴加猪流行性腹泻病毒特异性抗体，孵育，即得；
其中，上述制备方法还包括在步骤(2)后在上述结合有特异性抗体的微电极板表面滴加足量封闭液。
进一步地，上述步骤(1)中孵育条件为室温孵育1h；步骤(2)中孵育条件为室温孵育30min。
进一步地，上述结合蛋白的浓度为0.5mg/mL；封闭液的质量体积比为1.0％(BSA(w)/PBS(v))。
本发明的第三个方面，提供：
基于上述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的猪流行性腹泻病毒检测方法，包括以下步骤：
(1)在上述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器表面滴加待测样品和阻抗测量液，孵育，检测加入待测样品前后的阻抗值，建立阻抗谱；
(2)根据上述阻抗谱计算加入待测样品前后的电子传递电阻统计学差异性，判断上述待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒；
其中，上述阻抗测量液包括[Fe(CN)6]3-/4-溶液；
上述判断待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒的标准为：
若加入待测样品前后的电子传递电阻无统计学差异性，则待测样品不含猪流行性腹泻病毒；
若否，则待测样品含猪流行性腹泻病毒。
在本发明的实施例中，上述[Fe(CN)6]3-/4-溶液为铁氰化钾溶液或亚铁氰化钾溶液。
本发明的第四个方面，提供：
一种猪流行性腹泻病毒检测设备，该猪流行性腹泻病毒检测设备中包括上述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器。
本发明的第五个方面，提供：
上述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器在猪流行性腹泻病毒快速定性检测中的应用。
本发明的有益效果是：
1.本发明制备得到的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器具有特异性好，敏感性高等优点，具有应用于PEDV快速检测的前景。
2.基于本发明制备得到的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的猪流行性腹泻病毒检测，具有操作简便、检测效果灵敏、易于快速完成检测等优点。
附图说明
图1为PEDV S蛋白单克隆抗体质量检测结果；
图2为PCB微电极板的结构示意图；
图3为电化学阻抗谱(EIS)表征基础反应过程图；
图4为电极表面修饰过程的Nyquist图表征以及阻抗谱数据拟合，其中(a)裸电极，(b)蛋白A修饰，(c)抗体固定，(d)BSA-PBS封闭，(e)PEDV捕获；
图5为电化学阻抗检测等效电路Randles模型；
图6为PEDV滴度对数值与电子传递电阻的变化值之间的线性关系；
图7为免疫传感器特异性评价结果；
图8为免疫传感器的再生性评价结果。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实验仪器与试剂
仪器：
CHI660E电化学工作站(购自上海辰华仪器有限公司)。
试剂：
PEDV S蛋白单克隆抗体(购自MEDIAN Diagnostics)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)(由广东省农科院动物卫生研究所保藏并提供)，硝酸纤维素膜(NC膜)(购自美国PALL公司)，蛋白A(BCIP/NBT底物显色试剂盒)(购自北京索莱宝科技有限公司)，铁氰化钾、亚铁氰化钾均购自Sigma，碱性磷酸酯酶标记马抗鼠IgG、BSA、PBS均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
PEDV S蛋白单克隆抗体需进行抗体质量检测(Dot-ELISA法)，具体步骤如下：
以NC膜为固相载体，将滴度为106.1934TCID50/mL的PEDV进行10倍梯度倍比稀释后滴加在NC膜上，在37℃干燥后形成固相抗原。将NC膜浸入5％BSA中封闭1h，加入1：800稀释的PEDV S蛋白单克隆抗体孵育45min，使其与固相抗原形成抗原-抗体复合物，再加入碱性磷酸酯酶标记马抗鼠IgG(1：800稀释)孵育45min，使之与上述抗原-抗体复合物结合。最后，加入BCIP/NBT底物显色20min，出现紫色斑点者为阳性，不显色者为阴性。
结果如图1所示，在病毒滴度较高时，NC膜上呈现出较深的紫色斑点，随着病毒浓度降低，抗原-抗体结合后呈现的斑点颜色越来越浅。实验结果表明，PEDV S蛋白单克隆抗体与PEDV之间具有良好的亲和力，能够应用于免疫传感器的制备。
猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的制备
猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的制备方法包括以下步骤：
1.PCB微电极板的制备
使用传统的印刷电路板制造技术在FR-4玻璃环氧树脂基片上先镀上70μm厚的铜作为电极，然后在铜电极表面镀上100nm厚的金涂层，PCB微电极板上的电极使用线路相互连接。如图2所示，电极为平行排列，电极长度为6mm，电极宽度均为200μm，电极间的间距均为200μm，交错连接在两条平行线路上。印刷电路板微电极板还具有一个USB端口，用来连接CHI660E电化学工作站。
将PCB微电极板依次用1mol/L NaOH、1mol/L HCl溶液浸泡清洗1min，加入无水乙醇浸泡30s，每步之后都用超纯水冲洗。然后用擦镜纸多次轻轻擦拭电极表面，用超纯水彻底冲洗，并用氮气吹干，即得到表面洁净的PCB微电极板。
2.抗体修饰电极板
在上述步骤1中得到的表面洁净的PCB微电极板表面滴加40μL蛋白A(1mg/mL)，室温下孵育1h后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到蛋白A修饰的微电极板。
然后将40μL(0.5mg/mL)的PEDV S蛋白单克隆抗体滴加到蛋白A修饰过的电极板表面，室温下孵育45min后，用超纯水冲洗，并用氮气干燥。
然后滴加足量BSA-PBS溶液(1.0％，w/v)，以封闭电极表面未结合抗体的位点，室温下孵育30min，用超纯水冲洗，并用氮气干燥，即得抗体修饰电极板。
抗体固定完成后，电极板可接入工作电极得到猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器并直接用于目标病毒检测，或者放置于4℃封闭环境下保存待用。
本发明中的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器中的反应过程如图3所示。
基于猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的检测方法
在猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器表面滴加40μL待测样品(103.1934TCID50/mL滴度的PEDV病原液)，加入铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液，室温下孵育45min，使待测样品的目标病毒与传感器表面的抗体发生免疫结合。测定与传感器表面的抗体发生免疫结合前后的阻抗变化(结合前或封闭液封闭后的电子传递电阻记为Ret1，结合后或样本电子传递电阻记为Ret2，阻抗变化ΔRet为Ret1-Ret2)，测量频率范围为1Hz～1MHz，外加交流电压幅值为5mV。记录反应过程中的Nyquist阻抗谱(阻抗实部vs阻抗虚部)，用ZSimpWin软件建立等效电路模型并进行阻抗谱拟合。根据待测样品的阻抗谱和猪流行性腹泻病毒阳性对照的阻抗谱的拟合情况，判断待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒，具体为：若待测样品的阻抗谱和猪流行性腹泻病毒阳性对照的阻抗谱的均无显著性差异，则待测样品含有猪流行性腹泻病毒；若否，则待测样品不含猪流行性腹泻病毒。
通过使用EIS的Nyquist图表征本发明阻抗型免疫生物传感器从裸电极到捕获病毒的全过程，可以发现，以5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-作为氧化还原对，X轴从左到右对应频率的下降(图4)。每个阻抗谱包含一个高频区的半圆和一条低频区的直线，分别代表电极界面的电子传递过程和扩散过程。当蛋白A、PEDV S蛋白单克隆抗体、BSA-PBS、和PEDV病毒结合于阻抗型免疫生物传感器表面后，会抑制电极表面[Fe(CN)6]3-/4-的电子传递过程，导致界面阻抗增加，在Nyquist图上表征为阻抗谱半圆直径的逐渐增大，基础反应结果表明本免疫传感器能用于PEDV的检测。
采用图5所示的Randles等效电路模型对电化学阻抗谱进行模拟和解析。其中Rs、Cdl、Ret和Zw分别代表电解液电阻、双电层电容，电子传递电阻和Warburg阻抗。表1为等效电路的拟合数据，从数据可以看出该等效电路模型可应用于该免疫传感器电化学阻抗谱的解析。采用该等效电路分别对裸电极、蛋白A修饰、PEDV S蛋白单克隆抗体固定(抗体固定)、BSA-PBS封闭和PEDV捕获等过程进行表征拟合，得到等效电路各元件在电极表面不同吸附状态下的拟合值(表1)。
表1等效电路各元件的拟合值
Figure BDA0002707544590000071
由表1可见，随着电极表面的逐层修饰，Rs值、Cdl值，Zw值变化不大，Ret的变化最为显著，从裸电极到PEDV孵育的过程逐渐增大(存在统计学差异性)，因此，可通过Ret表征电极表面固定和病毒吸附过程。
猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器效果检测
1.猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的敏感性评价
取滴度为106.1934TCID50/mL PEDV病毒液，对病毒液进行10倍倍比稀释，取梯度滴度的病毒液滴加到封闭液封闭后的传感器表面，经45min捕获后进行检测，拟合电路后建立标准曲线。
结果如图6所示，随着病毒滴度增大，吸附到电极表面的病毒数量增加，从而使[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的电子传递阻力变大，导致Ret随之增加，当PED病毒滴度在102.1934TCID50/mL～106.1934TCID50/mL范围时，病毒滴度的对数lg(TCID50/mL)与电子传递电阻的变化值ΔRet(电极捕获病毒后的Ret值与BSA封闭后的Ret差值)呈线性关系，线性函数为：
y＝3250.2x-5658.6
R2＝0.9702。本发明传感器检测下限(LOD)定义为空白溶液测量信号+3倍标准偏差，此时lg(TCID50/mL)＝2.397，即本传感器可检测到的PEDV最低滴度为102.397TCID50/mL。
2.猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的特异性评价
分别将40μL滴度相同(106TCID50/mL)的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、轮状病毒(RV)，猪伪狂犬病病毒(PRV)滴加到猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器表面进行捕获，室温孵育45min后对比电子传递电阻的变化值ΔRet。
特异性评价结果表明(图7)，PEDV孵育后信号变化明显，而猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、轮状病毒(RV)，猪伪狂犬病病毒(PRV)等均不会引起阻抗信号的明显变化且△Ret值均在误差范围内，证明该免疫传感器具有良好的特异性，能用于特异性地识别PEDV。
3.猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的再生性评价
为探究猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的再生耐用性，使用同一样品进行多次检测(5次，10次，15次，20次，25次)，每次检测完成后对PCB微电极板清洗再生，并在再次使用前对其裸电极进行Nyquist图的测量并进行拟合分析。若裸电极测量值每次清洗再生后均无显著差异，则该电极可继续用于病毒的检测；若存在显著差异，则继续清洗，直至裸电极测量值无显著差异。若反复清洗后，裸电极测量值仍与此前相比存在显著差异且无法清洗至无显著差异，则表明印刷电路板微电极板表面已损坏。
结果如图8所示，检测完样品后对传感器进行清洗再生，对使用5次，10次，15次，20次，25次后的裸电极的进行Nyquist图测量后进行拟合分析，分析拟合电路的Ret值，结果表明其变化无显著差异，证明本传感器具有较稳定的再生性，可重复再生使用，并且随着使用次数增多，可降低检测成本。
综上所述，本发明中的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器通操作简单、所需样品量少、检测时间短，且灵敏度高、特异性强，具有应用于PEDV快速检测的前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器由：工作电极、印刷电路板微电极板、固定于印刷电路板微电极板一侧表面上的结合蛋白、连接于所述结合蛋白上的猪流行性腹泻病毒特异性抗体组成。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器，其特征在于，所述印刷电路板微电极板包括：
环氧树脂基片；
固定在环氧树脂基片一侧表面上的若干电极，所述电极为铜电极，所述铜电极表面镀有金涂层；
与所述若干电极相连接的线路。
3.根据权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器，其特征在于，所述金涂层的厚度为100～105nm；所述铜电极的厚度为70～75μm。
4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器，其特征在于，所述结合蛋白包括蛋白A。
5.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒特异性抗体包括猪流行性腹泻病毒S蛋白单克隆抗体。
6.权利要求1至5任一项所述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述印刷电路板微电极板接入所述工作电极，在所述的印刷电路板微电极板表面滴加结合蛋白，孵育，得到结合蛋白修饰的微电极板；
(2)在所述结合蛋白修饰的微电极板表面滴加猪流行性腹泻病毒特异性抗体，孵育，即得；
其中，所述制备方法还包括在步骤(2)后在所述结合有特异性抗体的微电极板表面滴加足量封闭液。
7.基于权利要求1至5任一项所述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器的猪流行性腹泻病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在权利要求1至5任一项所述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器表面滴加待测样品和阻抗测量液，孵育，检测加入待测样品前后的阻抗值，建立阻抗谱；
(2)根据所述阻抗谱计算加入待测样品前后的电子传递电阻统计学差异性，判断所述待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒；
其中，所述阻抗测量液包括[Fe(CN)6]3-/4-溶液。
8.根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒检测方法，其特征在于，所述判断待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒的标准为：
若加入待测样品前后的电子传递电阻无统计学差异性，则待测样品不含猪流行性腹泻病毒；
若否，则待测样品含猪流行性腹泻病毒。
9.一种猪流行性腹泻病毒检测设备，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒检测设备中包括权利要求1至5任一项所述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器。
10.权利要求1至5任一项所述的猪流行性腹泻病毒阻抗型免疫生物传感器在猪流行性腹泻病毒快速定性检测中的应用。
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