CN112986552B - 一种检测黄曲霉毒素b1的生物芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测黄曲霉毒素B1的生物芯片及其制备方法，涉及生物芯片技术领域。本发明所述检测黄曲霉毒素B1的生物芯片包含基体芯片、3‑氨丙基三乙氧基硅烷与吡咯的复合膜层和探针分子层，所述探针分子层包含醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体中的至少一种；所述3‑氨丙基三乙氧基硅烷和吡咯的复合膜层中3‑氨丙基三乙氧基硅烷和吡咯的质量比为1:2~5。本发明所述生物芯片对黄曲霉毒素B1的检测灵敏度较高。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片技术领域，尤其涉及一种检测黄曲霉毒素B1的生物芯片及其制备方法。
背景技术
随着生命科学的发展，生物芯片应运而生，生物芯片是通过微缩技术，根据分子间特异性地相互作用的原理，将分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物成分的准确、快速、大信息量的检测。
传统的生物芯片检测方法是芯片上的探针分子（核酸、蛋白质等生物分子）与待测生物分子通过扩散或布朗运动结合来进行检测，检测时间长。目前研究发现，通过使用电极片作为芯片，基于电学检测方法进行检测可以大幅提高检测效率，但该技术的难点在于，生物分子难以在电极片表面附着，制备工艺对电极片的性能也具有较大影响，尤其对于小分子待测物，芯片的表面状态对其检测精度影响巨大。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种检测黄曲霉毒素B1（AFB1）的生物芯片及其制备方法，所述生物芯片对于黄曲霉毒素B1的检测具有较高的灵敏度。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种检测黄曲霉毒素B1的生物芯片，所述生物芯片包含基体芯片、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）与吡咯的复合膜层和探针分子层，所述探针分子层包含醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体中的至少一种；所述APTES和吡咯的复合膜层中APTES和吡咯的质量比为1:2~5。
适配体与黄曲霉毒素抗体均能与黄曲霉毒素B1结合，为了便于进行电学检测，需要将上述两种探针分子包被在电极片芯片外，但直接包被探针分子容易脱落，为了增强探针分子与电极片芯片的结合强度，提高检测灵敏度，本发明在芯片与探针分子间制备了一层APTES与吡咯的复合膜层。通过对ATPES与吡咯的配比进行选择，使得制备的膜层可与芯片及探针分子形成良好的连接。
优选地，所述APTES和吡咯的复合膜层中APTES和吡咯的质量比为1:4。当两者以上述比例复配后制备的生物芯片灵敏度最高。
优选地，所述探针分子层为醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体的复配物，所述复配物中，醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体的体积比为1:0.5~3。
醛基修饰的适配体可以与上述APTES和吡咯的复合膜层稳定结合，本领域公知，黄曲霉毒素抗体与黄曲霉毒素B1具有良好的结合性，当将两者以上述配比复配后可保证芯片具有稳固的结构，同时在不降低测量灵敏度的情况下，还能节省成本，具有较高的经济效益。
优选地，所述探针分子层中，醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体的体积比为1:1~3。当两者的比例在所述范围内时，可保证生物芯片对黄曲霉毒素B1兼具良好的检测灵敏度和特异性。
同时，本发明还公开了一种上述检测黄曲霉毒素B1的生物芯片的制备方法，包括如下步骤：
（1）分别以有机溶剂、水冲洗基体芯片，然后以空气对基体芯片进行等离子清洗，清洗条件为：10~100W，5~20min；
（2）以空气对基体芯片进行等离子活化，活化条件为：10~30W，15~30min；
（3）以3-氨丙基三乙氧基硅烷和吡咯混合液为原料，以等离子涂覆法制备膜层，涂覆条件为：10~50W，20~30min；
（4）在涂覆有膜层的芯片表面滴加探针分子溶液，于30~40℃下孵育1~3h，得到所述生物芯片。
采用上述等离子方法制备生物芯片可极大地提高生物芯片的制备效率，并且无需使用其他添加剂，对环境无污染，对资源无浪费。
优选地，所述步骤（3）中，涂覆条件为：20~30W，25min。若涂覆功率过低、时间过短，膜层厚度较薄，探针分子无法良好地固定在芯片上，生物芯片表面探针密度太低，对于小分子的黄曲霉毒素B1来说无法进行精准地检测；若功率过高、时间过长，膜层太厚，一是容易导致膜层与芯片的结合不牢固，另一方面，芯片对黄曲霉毒素B1的检测灵敏度会降低。
优选地，所述步骤（4）中，探针分子溶液的滴加量为0.5~0.6μg/cm2。将醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体按比例混合即为探针分子溶液。探针分子与黄曲霉毒素B1直接结合，当其含量过少时，对黄曲霉毒素B1的检测效率会降低，当其含量过高时，与膜层的结合强度会降低。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供了一种新的检测黄曲霉毒素B1的生物芯片，通过对生物芯片各层结构的原料进行选择，使得制备出的生物芯片具有稳定的结构，对黄曲霉毒素B1具有较高的灵敏度。同时本发明还提供了一种制备所述生物芯片的方法，所述方法工艺简单，并且成本较低。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例和对比例所用的芯片选用中国专利CN104965081B、专利名称为“基于移动设备的抗体抗原检测方法”中的反应单元，反应单元包括一个顶部开口的反应腔，反应腔底部设置有一块检测板，检测板上铺设有至少一对电极片，电极片的接线端穿过并固定在反应腔和盒体上。铺设有电极片的检测板的结构可以参见发明人在先发表论文（Development of an AC electrokinetics-based immunoassay system for on-siteserodiagnosis of infectious diseases，Xiaozhu Liu，Sensors and Actuators A，171(2011) 406–413，Fig. 3.（b））。反应腔和检测板为硅制材料（Si），电极片均为金属材质（Al）。
APTES和吡咯来自Sigma，醛基修饰的适配体（该适配体序列为：5'-GTT GGG CACGTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-CHO-3'）来自西南大学食品科学学院，黄曲霉毒素抗体（抗AFB1单克隆抗体（6mg/mL））来自北京沫之东生物技术有限公司，黄曲霉毒素标准品（AFB1、AFB2、AFG1、AFM1）、赭曲霉毒素 A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）来自新加坡Pribolab公司。
实施例1~3和对比例1~2均为检测黄曲霉毒素B1的生物芯片，其复合膜层中APTES和吡咯的配比见表1，具体制备方法如下：
（1）对芯片进行镜检，利用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，取无断条、无连条、无粘附杂质的芯片，剔除不合格芯片。过程中，判断芯片表面无粘附杂质的依据为：在电极片叉指部位（即电极片之间的间隙）没有大于0.5μm的斑点、颗粒、赃物和尘埃粒子，如有就判定为不合格。分别以甲苯、丙酮、乙醇、水冲洗基体芯片，在每种试剂中泡5min，冲10s，氮气吹干后以空气对基体芯片进行等离子清洗，真空度为0.5mbar，清洗条件为：50W，10min；
（2）以空气对基体芯片进行等离子活化，真空度为0.5mbar，活化条件为：20W，20min；
（3）以APTES和吡咯混合液为原料，以等离子涂覆法制备膜层，涂覆条件为：30W，25min；
（4）在涂覆有膜层的芯片表面滴加探针分子溶液，滴加量为0.6μg/cm2，探针分子溶液中醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体的体积比为1:2.5，将滴加了探针分子溶液的芯片放置于37℃下孵育2h，得到所述生物芯片。
表1
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 |
| APTES：吡咯（质量比） | 1:2 | 1:4 | 1:5 | 1:1 | 1:6 |
实施例4~7和对比例3~4均为检测黄曲霉毒素B1的生物芯片，其制备方法与实施例2的区别仅在于，探针分子溶液中醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体的体积比不同，两者的配比如表2所示。
表2
| 项目 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 | 对比例3 | 对比例4 |
| 醛基修饰的适配体：黄曲霉毒素抗体（体积比） | 1:2 | 1:3 | 1:0.5 | 1:1 | 1:4 | 1:0.2 |
实施例8~9和对比例5~7均为检测黄曲霉毒素B1的生物芯片，其制备方法与实施例2的区别在于清洗、活化、涂覆或孵育条件，具体制备条件如表3所示。
表3
| 项目 | 实施例8 | 实施例9 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 |
| 清洗条件 | 10W，20min | 100W，5min | 50W，10min | 50W，10min | 50W，10min |
| 活化条件 | 30W，15min | 10W，30min | 40W，10min | 20W，20min | 20W，20min |
| 涂覆条件 | 10W，30min | 50W，20min | 30W，25min | 60W，20min | 30W，25min |
| 孵育条件 | 40℃，1h | 30℃，3h | 37℃，2h | 37℃，2h | 25℃，5h |
对实施例1~9和对比例1~7制备出的生物芯片的灵敏度和特异性进行测试，通过检出限来评估灵敏度的高低，通过生物芯片对3ng/mL的AFB2、AFM1、AFG1、OTA、DON、ZEN六种共存干扰毒素的响应性进行特异性评估。
检出限的测试方法：配制不同浓度的黄曲霉毒素B1磷酸缓冲盐溶液，在3kHz的交流频率和50mV的电压下用阻抗分析仪检测免疫反应前后生物芯片表面的双电层电容，计算归一化后电容的变化率，绘制归一化电容变化率与黄曲霉毒素B1磷酸缓冲盐溶液中黄曲霉毒素浓度的对数值之间的关系图，每一个浓度水平做三次平行样，取平均值；得出实施例1~9和对比例1~7的最低检出限，具体结果见表4。
表4
| 项目 | 最低检出限（pg/mL） | 特异性 |
| 实施例1 | 0.031 | 均未检出 |
| 实施例2 | 0.016 | 均未检出 |
| 实施例3 | 0.022 | 均未检出 |
| 实施例4 | 0.018 | 均未检出 |
| 实施例5 | 0.020 | 均未检出 |
| 实施例6 | 0.026 | AFB2有响应 |
| 实施例7 | 0.023 | 均未检出 |
| 实施例8 | 0.032 | 均未检出 |
| 实施例9 | 0.031 | 均未检出 |
| 对比例1 | 0.051 | 均未检出 |
| 对比例2 | 0.035 | 均未检出 |
| 对比例3 | 0.23 | 均未检出 |
| 对比例4 | 0.27 | AFB2,AFG1,OTA有响应 |
| 对比例5 | 0.31 | 均未检出 |
| 对比例6 | 0.43 | 均未检出 |
| 对比例7 | 0.36 | 均未检出 |
从表4中可知，实施例2具有最小的最低检出限，表明实施例2所述生物芯片对黄曲霉毒素B1具有最高的检测精度和灵敏度。此外，从实施例1~3和对比例1~2的结果中可知，膜层中APTES和吡咯的质量比对生物芯片的性能具有较大影响，只有当两者的质量比为1:2~5时，制备出的生物芯片才能对黄曲霉毒素B1进行更精准的检测。另外，从实施例4~7和对比例3~4的对比中可知，探针分子的成分同样对生物芯片的灵敏度具有一定影响，当醛基修饰的适配体的含量太高时，黄曲霉毒素抗体的比例降低，对黄曲霉毒素B1的特异性降低，当黄曲霉毒素抗体的含量太高时，探针分子与膜层的结合性变差，会降低灵敏度。除此之外，从实施例8~9和对比例5~7的对比中可知，生物芯片的制备条件对生物芯片的性能也具有较大影响，对于不同的膜层材料、不同的探针分子，其制备条件也需针对性地进行选择。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但并不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (4)
1.一种检测黄曲霉毒素B1的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片包含基体芯片、3-氨丙基三乙氧基硅烷与吡咯的复合膜层和探针分子层；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷和吡咯的复合膜层中3-氨丙基三乙氧基硅烷和吡咯的质量比为1:4~5；所述探针分子层为醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体的复配物，所述复配物中，醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体的体积比为1:1~3；
所述的检测黄曲霉毒素B1的生物芯片的制备方法包括如下步骤：
（1）分别以有机溶剂、水冲洗基体芯片，然后以空气对基体芯片进行等离子清洗，清洗条件为：50W，10min；
（2）以空气对基体芯片进行等离子活化，活化条件为：20W，20min；
（3）以3-氨丙基三乙氧基硅烷和吡咯混合液为原料，以等离子涂覆法制备膜层，涂覆条件为：30W，25min；
（4）在涂覆有膜层的芯片表面滴加探针分子溶液，于30~40℃下孵育1~3h，得到所述生物芯片。
2.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的生物芯片，其特征在于，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷和吡咯的复合膜层中3-氨丙基三乙氧基硅烷和吡咯的质量比为1:4。
3.如权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的生物芯片，其特征在于，所述步骤（4）中，探针分子溶液的滴加量为0.5~0.6μg/cm2。
4.如权利要求3所述的检测黄曲霉毒素B1的生物芯片，其特征在于，所述探针分子溶液的制备方法为：按比例将醛基修饰的适配体和黄曲霉毒素抗体混合。
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|---|---|---|---|---|
| CN1364819A (zh) * | 2002-02-07 | 2002-08-21 | 武汉大学 | N－取代吡咯共聚物及其制备方法和用途 |
| CN108254552A (zh) * | 2016-12-28 | 2018-07-06 | 田纳西大学研究基金会 | 通过交流动电学检测生物标志物的方法 |
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