CN112986205B - 一种基于电学加速的荧光和化学发光检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子快速检测技术领域，具体涉及一种基于电加速的荧光和化学发光快速检测方法，包括如下依次进行的步骤：S1样本加速：将激励信号施加在滴加有目标分子的芯片上，获得结合有目标分子的芯片；所述芯片包括电极片，所述电极片上固定有包被分子；S2二抗加速：在结合有目标分子的芯片上滴加用于结合目标分子的二抗，然后将激励信号施加在芯片上，获得结合有二抗的芯片。本方案能够有效提升荧光和化学发光检测速率，可以加快检测流程和满足床旁快速检测的需求。

Description

一种基于电学加速的荧光和化学发光检测方法
技术领域
本发明涉及分子快速检测技术领域，具体涉及一种基于电学加速的荧光和化学发光检测方法。
背景技术
荧光和化学发光检测属于两种典型的免疫分析检测，而免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，被广泛用于病原物质等目标分子的检测中。荧光检测是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合，以荧光素作为标记物，在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。化学发光检测是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。
目前的荧光和化学发光检测系统需要的时间较长，一次检测往往都是30分钟以上，而且检测所需样品用量较大（>100μL），检测限不够低，对痕量物质进检测具有一定的局限。生物探针与目标（比如抗原-抗体）的反应是依靠热扩散等被动的方式进行的，目前还不能主动控制其中的生物探针-目标发生免疫反应。而有一些提高反应速度的方案，往往是通过“烤箱”的方式来进行，也就是将整体反应池的温度提升，但效果非常有限。亟需研发一种能够有效提升荧光和化学发光检测速率的方法，以加快检测流程和满足床旁快速检测的需求。
发明内容
本发明意在提供一种基于电加速的荧光和化学发光快速检测方法，以解决现有检测方法的检测速度过慢的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于电学加速的荧光和化学发光检测方法，包括如下依次进行的步骤：
S1样本加速：将激励信号施加在滴加有目标分子的芯片上，获得结合有目标分子的芯片；所述芯片包括电极片，所述电极片上固定有包被分子；
S2二抗加速：在结合有目标分子的芯片上滴加用于结合目标分子的二抗，然后将激励信号施加在芯片上，获得结合有二抗的芯片。
本方案的原理及优点是：
本技术在荧光和化学发光检测的基础上，利用芯片上的电极产生特定的电场，在这些电场的作用下，在样品溶液中，可以使得液体局部温度改变，还可以主动控制样品里的目标分子以及二抗的运动，实现目标分子和包被分子、目标分子和二抗的快速结合，从而加速了整个荧光免疫检测的过程。在S1样本加速和S2二抗加速中，施加激励信号，产生电泳效应加快了目标分子和二抗向电极片方向移动的速度，并且产生电热效应使芯片内部形成显著的温度梯度而引起的局部流体流动。温度效应与介电泳效应一同加快目标分子和二抗分别与电极片表面包被分子以及目标分子的结合速度。激励信号是指能够促进芯片中分子运动的交流电信号，其特征参数包括频率以及电压。
采用本方案具有如下的优点：
（1）速度快：可以在5分钟内完成整个流程，是传统的荧光和化学发光检测的检测时间的六分之一。
（2）灵敏度高：因为加入了主动控制，可以克服之前因为空间位阻、浓度分布带来的阻力，可以实现更多的抗原-抗体结合，样品用量仅为10μL左右，并可对样品中的痕量目标分子进行检测。
进一步，在S1样本加速和S2二抗加速中，所述激励信号为电压5mV～40V以及频率500Hz～10MHz。在上述激励信号的作用下，目标分子和二抗可被有效加速，实现对分子运动的主动控制，能够有效提升荧光和化学发光检测速率。
进一步，在S1样本加速和S2二抗加速中，所述激励信号的施加时长为5～90s。激励信号的施加时长可保证目标分子和包被分子、目标分子和二抗充分结合。时间过长对检测效果无增益；时间过短则结合效果不佳，不能实现对痕量物质的检测。
进一步，在S2二抗加速中，所述二抗为荧光二抗或者为酶标二抗。采用荧光二抗，可实现荧光快速检测，采用酶标二抗可实现化学发光检测。
进一步，在S2二抗加速之后，还包括S3检测：对结合有二抗的芯片进行荧光检测或者化学发光检测。通过检测荧光强度或者化学发光强度，可实现对目标分子的定量或者定性检测。
进一步，在S1样本加速中，所述芯片的制备过程包括芯片包被步骤，所述芯片包被步骤用于将包被分子结合在芯片的电极片上；所述芯片包被步骤包括使用硼酸缓冲液作为溶剂配制包被分子溶液；所述硼酸缓冲液由如下方法制备：在0.05～0.2M的硼酸溶液中加入0.0125～0.05M的四硼酸钠溶液，直至pH值为5～8。
采用上述技术方案，在对芯片进行加工形成成品芯片的过程中，需要在醛基化的电极片上共价结合上包被分子。通常为保证上述共价结合过程的顺利进行，以及保证包被分子的活性，需要将包被分子分散和溶解在缓冲液中。发明人最开始使用了最常用的磷酸盐缓冲液（PBS），发现磷酸盐缓冲液虽然能够一定程度上保证包被效果，但是最后获得的成品芯片的电极片上很容易产生腐蚀现象，而腐蚀的芯片只能弃用。发明人通过大量实验研究了腐蚀现像的成因，最终发现缓冲液的选用是一个非常关键的因素。发明人使用了大量的不同类型的缓冲液进行测试，发现本案的硼酸缓冲液（BBS）的抗腐蚀效果最佳。发明人进而分析了本方案的硼酸缓冲液产生上述效果的原因，硼酸缓冲液中的溶质可以在电极片的表面形成抗氧化保护层，进而防止腐蚀的发生。在芯片的加工过程中，使用到本方案的硼酸缓冲液，可以克服金属材质的电极片容易被腐蚀的技术难题，可延长芯片的保存期，提升芯片的品质。并且以上述浓度和pH值配置获得的缓冲液具有较好的抗腐蚀效果，硼酸、四硼酸钠的浓度和pH值超过或者低于上述范围，均不能获得理想的抗腐蚀效果。
进一步，固定有包被分子的电极片相对于未固定包被分子的电极片，在特定阻抗扫描频率下，电容变化率为-50～150%，或者阻抗变化率为-100～100%，或者相位变化率为-30～30%，或者电阻分量变化率为-40～40%，或者电感分量变化率为-200～200%。
采用上述技术方案，实际应用时，在芯片的电极片上固定包被分子的前后，分别使用阻抗仪对芯片进行扫描，绘制出芯片的电容随交流电频率变化的曲线。分析前后两组数据，获得特定阻抗扫描频率，计算在该特定阻抗扫描频率下电容的变化率。计算方法为：电容变化率=（包被后扫描的电容值-包被前扫描的电容值）/包被前扫描的电容值×100%。该电容变化率需要保证在-50～150%，检测结果不在上述范围内的芯片均需要丢弃。实验证明在质控过程中，将电容变化率维持在本范围内，可以有效控制芯片质量，保证芯片的稳定性、均质性以及较高的合格率。
发明人在制作芯片的过程中发现，按照预处理、芯片活化、芯片成膜、芯片交联、芯片包被和封闭与干燥的过程，将包被分子固定在芯片的电极片上，如果不加入一定的质控方式，最终获得的成品芯片的质量稳定性非常不理想，会出现较多的不合格芯片。为克服上述问题，发明人在芯片制作过程中引入了质控过程，即本方案的表征方法。然而芯片制作的流程比较长，技术点锁碎而繁多，在哪个步骤进行质控以及进行怎样的质控，这是现有技术中尚未见报道的。发明人最先尝试在每个步骤严格检测芯片是否出现损坏和污染，丢弃出现破损和污染的芯片，成品芯片的合格率以及稳定性虽然得到了一定的改善，但效果仍不是非常理想。通过大量研究发现，电极片在固定包被分子前后的电容变化率是影响芯片质量的关键（特定阻抗扫描频率下），如果能够将电容变化率的上限和下限设置成-50%和150%，弃用电容变化等超过上述泛围的芯片。那么获得的成品芯片的合格率从及稳定性会具有显著提升。
另外，除了选择电容作为参数进行判断，选择阻抗、相位、电阻分量、电感分量等参数也可做判断。电容、阻抗、相位、电阻分量和电感分量均为芯片的特征参数，也称为电信号值。在特定阻抗扫描频率下的阻抗、相位、电阻分量和电感分量的变化率需要维持在一定范围内，才能保证最终产品的合格率。
综上所述，在芯片包被的过程中，检测并计算在特定阻抗扫描频率下的电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率，并舍弃在规定范围之外的芯片，可以有效排除不合格芯片，提升获得的成品芯片的质量。
进一步，在芯片包被步骤之前依次包括芯片活化步骤、芯片成膜步骤和芯片交联步骤；在芯片活化步骤中，等离子清洗处理所述芯片的电极片，且等离子清洗的介质为空气。通过等离子清洗处理，可以在电极片表面形成活性基团，便于后续APTES覆膜的形成。且使用空气为介质，通过氧化反应，在表面生成-OH、-C=O、-COOH等基团；并使用空气中氮气，在芯片表面生成-NH2基团，可以获得最佳的活化效果。
进一步，在芯片成膜步骤中，在经等离子清洗的电极片上覆盖APTES形成的覆膜。在电极片表面形成APTES覆膜，便于后续醛基化修饰的进行。
进一步，在芯片交联步骤中，对所述覆膜进行醛基化修饰。在电极基片上更为稳定地附着一定数量的醛基，有助于电极片对于包被分子的固定。按照本方案制备而成芯片具有更高的检测稳定性、准确度和灵敏度。
具体实施方式
实施例1：芯片加工
本实施例是在未固定包被分子（抗体或者抗原或者其他的亲和分子）的芯片的基础上进行加工形成包被了抗体的成品芯片。
本实施例使用的芯片参见发明人在先专利CN104965081B（基于移动设备的抗体抗原检测方法），在该专利中记载有（并参照该专利的附图2）：一种抗体抗原检测测试系统，包括至少一个反应单元，反应单元包括一个顶部开口的反应腔，反应腔底部设置有一块检测板，检测板上铺设有至少一对电极片，电极片的接线端穿过并固定在反应腔的盒体上；检测板上还固定有目标抗体或抗原的对应抗原或抗体。在本实施例中，芯片具体是指CN104965081B中的反应单元，铺设有电极片的检测板的结构可以参见发明人在先发表论文（Development of an AC electrokinetics-based immunoassay system for on-siteserodiagnosis of infectious diseases，Xiaozhu Liu，Sensors and Actuators A， 171(2011) 406–413，Fig. 3.（b））。通常反应腔和检测板为硅制材料（si），电极片均为金属材质（铝、金或铜，本实施为铝材质），电极片非常容易在加工过程中或者在加工完成后的存放过程中，逐渐地被腐蚀，使得整个芯片失效。另外，为了使得芯片具有结合并检测目标分子，需要在电极片上包被抗体（或者抗原或者其他的亲和分子，统称为包被分子），从而获得成品芯片，本方案在从芯片制作成为成品芯片的方法工艺上进行了改进。
1.预处理：
取未包被抗体的芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，确认芯片的电极片是否有无断条和连条（电极片之间相互平行），有无其他粘附的杂质，选取无断连条及粘附杂质的芯片继续后续实验（称为第一次镜检）。粘附的杂质的判断依据为：在电极片叉指部位（即电极片之间的间隙）没有粒径或者长度大于0.5um的斑点、颗粒、脏物或尘埃粒子，如有就判定为不合格。
2.芯片活化
用现有技术的等离子清洗机处理芯片表面，参数设置为：使用空气作为等离子清洗介质，真空度0.5mbar（可选择范围0.3～0.5mbar）,功率50W（可选择范围50～200W），处理芯片10min（可选择范围5～15min），获得活化后的芯片。该步骤的目的是对芯片表面进行表面清洗和修饰，使用空气中氧气，通过氧化反应，在表面生成-OH、-C=O、-COOH等基团；并使用空气中氮气，在芯片表面生成-NH2基团。
3.芯片成膜
将活化后的芯片全部浸没（芯片的接线除外）到10%（质量百分数，可选择范围1～10%）APTES的乙醇溶液（将APTES溶于无水乙醇中，APTES的质量分数为10%，APTES即为3-氨丙基三乙氧基硅烷）中，常温（常温指18～25℃）放置30min（可选择范围5～60min）。每片芯片用装有无水乙醇的挤瓶冲洗30s,然后氮气吹干，获得成膜后的芯片。
每片成膜后的芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染，则舍弃该芯片（称为第二次镜检），判断方法同第一次镜检。
4.芯片交联
将合格的成膜后的芯片置于63℃（可选择范围50～100℃）烘箱固化60min，拿出冷却放置至常温。每片芯片向反应腔滴加10μl 2.5%（质量百分数，可选择范围1～10%）戊二醛溶液（纯水配制），溶液就覆盖电极片，再放入保湿盒常温（常温是指18～25℃）放置1h（可选择范围0.5～2.0h）。保湿盒的湿度为40%（可选择范围40～60%）。每片芯片用装有超纯水的挤瓶冲洗10s,然后氮气吹干，获得交联之后的芯片。
5.芯片包被
在交联之后的芯片上滴加10ul 10μg/ml 商业化的布鲁氏omp16抗原（一种具体的包被分子溶液，用于分散和溶解包被分子的溶剂为100mM BBS，根据实际需要检测的分子的情况，可选用不同抗原)，于22℃（可选择范围18-25℃）孵育20h（时间可选择在2～24h之间），获得包被后的芯片。接下来用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第三次镜检），判断方法同第一次镜检。
在本步骤中BBS（硼酸缓冲液）的配制方法为：在0.05～0.2M硼酸溶液中加入0.0125～0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为5～8。在本实施例中，具体为（即100mM BBS）：在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4。
6.封闭与干燥
每片包被后的芯片用200uL移液器加入20μL的100mM BBS,然后用氮气吹干，重复1次。每片芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第四次镜检），判断方法同第一次镜检。用10μL移液器滴加10μL 10% 牛血清白蛋白封闭液（溶剂为100mM BBS).于室温中封闭0.5h。每片芯片用200μL移液器加入20μL 100nM BBS,然后用氨气吹干，重复1次，获得成品芯片。
每片芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第五次镜检），判断方法同第一次镜检。
实施例2：芯片加工
本实施例在实施例1的基础上进行改进，在“5.芯片包被”过程中加入了阻抗扫描的质控过程，以保证芯片的良品率。具体如下：
芯片包被
在交联之后的芯片上滴加10ul 10μg/ml 商业化的布鲁氏omp16抗原（一种具体的包被分子溶液，用于分散和溶解包被分子的溶剂为100mM BBS，根据实际需要检测的分子的情况，可选用不同抗原)，孵育5min（可选择范围2～10min）。
然后使用阻抗仪连接于电极片的接线端进行阻抗频率扫描测量和分析。扫描频率范围为1MHz到100Hz（正弦交流电），激励电压为5mV（可选择范围1mV～100mV），采样点数201点，测量时间为3s，保存各芯片阻抗频率扫描数据（称为包被前阻抗扫描，获得在不同扫描频率下的电极片各响应参数，包括阻抗、相位、电阻分量、电容分量、电感分量等，作图获得包被前上述参数随频率变化的曲线）。在包被前阻抗扫描结束后，将芯片放在保湿盒中，于22℃(需控制环境温度）包被20h（时间可选择在2～24h之间），获得包被后的芯片。包被结束后，从保湿盒中取出芯片，然后用阻抗仪从扫描频率范围为1MHz到100Hz，激励电压为5mV（可选择范围1mV～100mV），采样点数201点，测量时间为3s。保存各芯片阻抗频率扫描数据（称为包被后阻抗扫描，获得在不同扫描频率下的电极片各响应参数，包括阻抗、相位、电阻分量、电容分量、电感分量等，作图获得包被前上述参数随频率变化的曲线）。
对比包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描结果，判定芯片是否合格，判定方法为：在上述阻抗扫描频率下，计算包被后扫描获得的电容值与包被前扫描获得的电容值的变化率，具体计算方法为：电容变化率=（包被后扫描的电容值-包被前扫描的电容值）/包被前扫描的电容值×100%。电容变化率需控制在-50.0～150.0%，不在此范围内的芯片为不合格芯片，需要丢弃。特定阻抗扫描频率是通过包被前电容随频率变化的曲线和包被后电容随频率变化的曲线来确认的，具体的确认方法为：计算获得包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描的同一频率下的电容变化率，电容变化率（在此处若该值为负数，则取其绝对值）的最大值所对应的扫描频率值即为特定阻抗扫描频率。在本实施例中，具体是在频率50KHz（即特定阻抗扫描频率）下计算电容变化率，并控制特定阻抗扫描频率下的电容变化率在60.0～100.0%范围内，其中，特定阻抗扫描频率下的电容变化率又称为扫描前后最大电容变化率。由于芯片批次以及包被探针不一样会使得特定阻抗扫描频率存在差异，所以需要在包被前后进行阻抗扫描，获得特定阻抗扫描频率，在该特定阻抗扫描频率下的电容变化率需要维持在一定范围内（-50.0～150.0%），才能保证成品芯片的合格率。
另外，除了选择电容作为参数进行判断，选择阻抗、相位、电阻分量、电感分量等参数也可做判断。电容、阻抗、相位、电阻分量和电感分量均为芯片的特征参数，也称为电信号值。在特定阻抗扫描频率下的阻抗、相位、电阻分量和电感分量的变化率需要维持在一定范围内，才能保证最终产品的合格率，范围分别为：阻抗变化率-100～100%、相位变化率-30～30%、电阻分量变化率-40～40%、电感分量变化率-200～200%。其中，阻抗变化率=（包被后扫描的阻抗值-包被前扫描的阻抗值）/包被前扫描的阻抗值×100%；相位变化率=（包被后扫描的相位值-包被前扫描的相位值）/包被前扫描的相位值×100%；电阻分量变化率=（包被后扫描的电阻分量值-包被前扫描的电阻分量值）/包被前扫描的电阻分量值×100%；电感分量变化率=（包被后扫描的电感分量值-包被前扫描的电感分量值）/包被前扫描的电感分量值×100%。其中，对于电容、阻抗、相位、电阻分量、电感分量等参数，特定阻抗扫描频率存在差异，在使用不同参数对芯片进行表征的时候，特定阻抗扫描频率是指：计算获得包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描的同一频率下的电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率，电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率（在此处若该值为负数，则取其绝对值）的最大值所对应的扫描频率值即为该参数的特定阻抗扫描频率（即电容的特定阻抗扫描频率、阻抗的特定阻抗扫描频率、相位的特定阻抗扫描频率、相位的特定阻抗扫描频率、电阻分量的特定阻抗扫描频率，以及电感分量的特定阻抗扫描频率）。
接下来用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第三次镜检），判断方法同第一次镜检。
实施例3：基于电加速的荧光检测
使用本方案的成品芯片进行荧光检测时，操作步骤如下：
本实施例使用实施例1制备的芯片进行实际样本的检测，具体以布鲁氏病样品（布鲁氏病抗体阳性血清标准样品，布鲁氏病抗体即为目标分子，抗体效价为200000IU）的检测为例，说明利用本成品芯片进行荧光检测的过程：
1. 样本加速
用10μL移液器在成品芯片上滴加布鲁氏病样品，每个芯片10μL样品，将激励信号施加在芯片上，持续30S（可选择范围为：5～90S）。使用20μL 1×PBS冲洗样本加速后的芯片两次。在本方案中，将激励信号施加在芯片上即为：使用阻抗仪在固定电压和固定频率下，对芯片的电极片进行处理。固定电压和固定频率可以分别选择为5mV～40V以及500Hz～10MHz，都可以起到加速分子运动的作用，促进布鲁氏病样品中的抗体与芯片上固定的抗原结合。在本实施的中，具体选用的固定电压和固定频率为2V和5kHz。
2. 荧光二抗加速
用10μL移液器在成品芯片上滴加量子点标记的荧光二抗（1μg/ml溶于1×PBS，此处的二抗具体是指通过免疫反应产生的，可以与样品血清中的布鲁氏病抗体特异性结合的蛋白分子，芯片上固定的抗原与血清中的抗体结合，该抗体与量子点标记的荧光二抗结合，本实施中使用的量子点具体为碳量子点的聚苯乙烯荧光微球），每个芯片10μL荧光二抗，将激励信号（固定电压和固定频率分别具体为2V和5kHz，固定电压和固定频率可以分别选择为5mV～40V以及500Hz～10MHz）施加在芯片上，持续30S（可选择范围为：5～90S）。使用20μL1×PBS冲洗样本加速后的芯片两次。
3. 荧光检测。
仪器自动读取并计算荧光强度，激发波长360nm，发射波长610nm。本实施例的检测结果为阳性，成功检出布鲁氏病样品中的目标抗体。
实施例4：基于电加速的化学发光检测
使用成品芯片进行化学发光检测的具体步骤如下：
1. 样本加速
同实施例2的“1.样本加速”
2. 酶标二抗加速
用10μL移液器在成品芯片上滴加辣根过氧化酶偶联二抗（酶标二抗，1μg/ml溶于1×PBS），每个芯片10μL 酶标二抗，将激励信号（固定电压和固定频率分别具体为2V和5kHz，固定电压和固定频率可以分别选择为5mV～40V以及500Hz～10MHz）施加在芯片上，持续30S（可选择范围为：5-90S）。使用20μL 1×PBS冲洗样本加速后的芯片两次。
3. 化学发光检测。
在酶标二抗加速后的芯片中加入10ul布鲁诺底物，仪器自动读取并计算化学发光强度，本实施例的检测结果为阳性，成功检出布鲁氏病样品中的目标抗体。
实验例1：质控和表征条件研究
采用实施例2的芯片制备方法制备芯片100个，并选取其中20个芯片进行合格率检测（表1中的编号1）。为了测试质控表征方法的效果，在本实验例中设置了对比实验，具体设置情况如下：编号2在实施例2的基础上，对电容变化率的限定范围调整为-50～50%，超出该范围的芯片需要舍弃；编号3在实施例2的基础上，对电容变化率的限定范围调整为80～150%，超出该范围的芯片需要舍弃；编号4在实施例2的基础上，对电容变化率的限定范围调整为-50～150%，超出该范围的芯片需要舍弃；编号5在实施例2的基础上，去掉了镜检质控的过程；编号6在实施例2的基础上，去掉了阻抗检测质控的过程；编号7在实施例2的基础上，去掉了镜检质控和阻抗检测质控的过程；编号8-10在实施例2的基础上，对电容变化率的限定范围进行了调整，超出表格中所示范围的芯片需要舍弃；编号11和12在实施例2的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对阻抗变化率的控制，并限定了具体的阻抗变化率范围；编号13和14在实施例2的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对相位变化率的控制，并限定了具体的相位变化率范围；编号15和16在实施例2的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对电阻分量变化率的控制，并限定了具体的电阻分量变化率范围；编号17和18在实施例2的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对电感分量变化率的控制，并限定了具体的电感分量变化率范围。
检测的标准样品为布鲁氏病血清企业标准参考品（每份标准参考品用量10μl，包括10份布病抗体阳性血清参考品，10份布病阴性血清参考品）。其中，10个芯片用于检测10份抗体阳性血清参考品，10个芯片用于检测10份抗体阳性血清参考品。10份布病抗体阳性血清参考品的抗体效价为200000IU。检测后统计合格率，标准参考品的检测的方法如下：
在芯片上加入标准样品后，用阻抗仪对芯片施加交流电并同时检测电极片的电容变化。在固定频率下，用固定电压进行60s的连续测量。同时计算这60s电容的平均变化率，即为检测结果。分别检测10份企业阴性参考品和10份企业阳性参考品，对照检测结果和阈值判定芯片是否合格。检测阈值设定为20，检测结果的数值大于20为阴性，检测结果的数值小于20为阳性。10份阳性质控品的检测结果应该全部小于20，10份阴性质控品的检测结果应该全部大于20，不符合上述，则判定为该芯片不合格。合格率计算方法为：合格率=合格的芯片数量/20×100%。实验结果参见表1。
表1：质控方式对于合格率的影响
编号 质控方式 特征参数 特征参数变化率 合格芯片数量 合格率
1 阻抗检测质控+镜检质控 电容 60～100% 20 100.0%
2 阻抗检测质控+镜检质控 电容 -50～50% 20 100.0%
3 阻抗检测质控+镜检质控 电容 80～150% 19 95.0%
4 阻抗检测质控+镜检质控 电容 -50～150% 18 90.0%
5 阻抗检测质控 电容 60～100% 15 75.0%
6 镜检质控 N/A N/A 13 65.0%
7 N/A N/A N/A 8 40.0%
8 阻抗检测质控+镜检质控 电容 -100～200% 15 75.0%
9 阻抗检测质控+镜检质控 电容 100～250% 15 75.0%
10 阻抗检测质控+镜检质控 电容 -150～50% 16 80.0%
11 阻抗检测质控+镜检质控 阻抗 -100～100% 20 100.0%
12 阻抗检测质控+镜检质控 阻抗 -150～150% 16 80.0%
13 阻抗检测质控+镜检质控 相位 -30～30% 20 100.0%
14 阻抗检测质控+镜检质控 相位 -50～50% 17 85.0%
15 阻抗检测质控+镜检质控 电阻分量 -40～40% 20 100.0%
16 阻抗检测质控+镜检质控 电阻分量 -60～60% 17 85.0%
17 阻抗检测质控+镜检质控 电感分量 -200～200% 20 100.0%
18 阻抗检测质控+镜检质控 电感分量 -300～300% 17 85.0%
根据表1的结果可知，采用阻抗检测质控和镜检质控的双重质控方式，并将电容变化率控制在-50～150%，可以获得较为理想的成品芯片合格率。而采用单一的质检方式或者不质检（参见编号6和7的实验数据），会导致最后的成品芯片的合格率降低。在阻抗检测质控过程中，在特定频率下的电容变化率是否维持在一定范围内对于合格率的提升非常关键。如果电容变化率不在-50～150%内（参见编号8-10的实验数据），则成品芯片的合格率大幅下降。使用阻抗变化率、相位变化率、电阻分量变化率和电感分量变化率来对芯片进行表征，并选取符合范围要求的芯片，舍弃超范围芯片，均可以获得理想的合格率（参见编号11-18的实验数据）。
实验例2：成品芯片抗腐蚀效果研究
本实验例对实施例1的“5.芯片包被”和“6.封闭与干燥”中的缓冲液进行了研究，具体的方式是使用测试缓冲液代替实施例的硼酸缓冲液，并通过实施例的方法制备获得成品芯片。将刚制备完成的成品芯片置于干燥密封袋中（编号1-9的测试均使用10个成品芯片，均独自包装于干燥密封袋中），每日使用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面（主要是电极片），判断电极片是否出现腐蚀或者锈蚀的现象，如果出现，记载该现象出现的日期，并统计抗锈蚀时长，实验结果如表2所示。
表2：抗锈蚀时长测试结果（mean±SD，N=10）
编号 测试缓冲液类型 测试缓冲液配制方法 抗锈蚀时长（天）
1 BBS 参见实施例1 67.00±3.74
2 BBS 在0.05M硼酸溶液中加入0.0125M四硼酸钠溶液，直至pH值为5.0 63.60±3.86
3 BBS 在0.2M硼酸溶液中加入0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为8.0 63.20±4.42
4 BBS 在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为9 N/A
5 BBS 在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为4 N/A
6 BBS 在0.3M硼酸溶液中加入0.1M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4 55.10±2.47*
7 BBS 在0.02M硼酸溶液中加入0.005M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4 52.60±3.17*
8 PBS 参见PBS配方（pH7.4） N/A
9 碳酸缓冲液 在0.1M碳酸氢钠溶液中滴加0.1M碳酸钠溶液，直至pH值为9.0。 N/A
10 硼酸溶液 0.1M硼酸溶液 N/A
11 四硼酸钠溶液 0.025M四硼酸钠溶液 N/A
1L PBS配方（pH7.4）：磷酸二氢钾0.24g；磷酸氢二钠1.44g；氯化钠8g；氯化钾0.2g；加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。表2中*表示该实验组与编号1的数据相比具有显著差异（T检验，p＜0.05）。N/A表示在芯片加工过程中电极片已经大量发生锈蚀（通过镜检发现），属于不合格芯片，使用编号4、5和8-11的缓冲液（溶液），不能有效获得合格的成品芯片。
由实验结果可知，采用本方案的硼酸缓冲液制备的成品芯片，可获得较长的保质期，但是如果硼酸缓冲液中的硼酸或者四硼酸钠的浓度过高或者过低，缓冲液的pH值过高或者过低，都不利于抗氧化膜的形成，获得的成品芯片的抗腐蚀效果差。如果换用其他缓冲液或者是单用硼酸溶液或者是单用四硼酸钠溶液，均不能获得理想的抗腐蚀效果。
实验例3：未加工芯片抗腐蚀效果研究
将未固定包被分子的芯片（即实施例中1.预处理步骤中最初获得的芯片）置于测试缓冲液中（浸泡），每日使用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面（主要是电极片），判断电极片是否出现腐蚀或者锈蚀的现象，如果出现，记载该现象出现的日期，并统计抗锈蚀时长（每组实验使用一片未经过本方案加工的芯片）。本实验例也对测试缓冲液对于不同材质电极片的作用进行了研究，实验结果如表3所示。
表3：抗锈蚀时长测试结果
编号 测试缓冲液 测试缓冲液配制方法 锈蚀时间
1 BBS 参见实施例1 3天
2 BBS 在0.05M硼酸溶液中加入0.0125M四硼酸钠溶液，直至pH值为5.0 3天
3 BBS 在0.2M硼酸溶液中加入0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为8.0 3天
4 BBS 在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为9 1天
5 BBS 在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为4 1天
6 BBS 在0.3M硼酸溶液中加入0.1M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4 1天
7 BBS 在0.02M硼酸溶液中加入0.005M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4 1天
8 PBS 参见PBS配方（pH7.4） 1天
9 碳酸缓冲液 在0.1M碳酸氢钠溶液中滴加0.1M碳酸钠溶液，直至pH值为9.0 1天
由实验结果可知，采用本方案的硼酸缓冲液，对电极片均有较好的抗腐蚀作用。缓冲液的pH值过高或者过低，都不利于抗氧化膜的形成，使得电极片的抗腐蚀效果差。如果换用其他缓冲液，均不能获得理想的抗腐蚀效果。
实验例4：芯片活化和芯片成膜条件研究
本实验例对芯片活化和芯片成膜条件进行了研究。编号1为实施例2中制备的芯片；编号2为APTES浓度为5%，其他条件和处理方式同实施例2；编号3为APTES浓度为1%，其他条件和处理方式同实施例2；编号4使用氮气代替空气作为芯片活化步骤中介质，其他条件和处理方式同实施例2；编号5使用氧气代替空气作为芯片活化步骤中介质，其他条件和处理方式同实施例2；编号6使不采用“2.芯片活化”，直接进行“3.芯片成膜”，其他条件和处理方式同实施例2；编号7使不采用“3.芯片成膜”，在“2.芯片活化”后直接进行“4.芯片交联”，其他条件和处理方式同实施例2。每组各选取10片成品芯片进行检测
在每片芯片的特定阻抗扫描频率下，计算每片芯片包被后扫描获得的电容值与包被前扫描获得的电容值的变化率，继而计算芯片的电容变化率的平均值和标准差，计算得到芯片包被批内差变异系数CV，芯片包被批内差变异系数CV的计算公式为：变异系数（CV）＝（标准差SD/平均值X）100％，芯片包被批内差变异系数CV如表4所示。
表4：芯片活化和芯片成膜条件研究的实验分组和结果
编号 1 2 3 4 5 6 7
CV（%） 10.8 11.7 12.6 25.9 27.1 36.2 61.3
由表4可知，编号1-3的芯片包被批内差变异系数CV仅为远低于编号7，在芯片上形成APTES膜明显有助于包被分子稳定地固定在芯片上，且包被分子不易脱落，从而使得同一批次生产的成品芯片上固定的包被分子量更趋于相同，保证同一批次生产的成品芯片的质量的稳定性。编号1-3的芯片包被批内差变异系数CV仅为远低于编号6，未进行芯片活化步骤而制得的成品芯片，即使是同一批次内生产的，其上固定的包被分子量差异较大，导致同一批次生产的成品芯片的质量不稳定。编号1-3与编号4和5相比，这说明在芯片活化步骤中，对于清洗介质的选择，将会影响后续的芯片加工步骤。本发明中，选择空气作为清洗介质时，能够有效减小芯片包被批内差，提高成品芯片的质量的稳定性。
综上所述，本发明中，使用空气作为等离子清洗的清洗介质，并在芯片上形成APTES膜，且将芯片成膜步骤中的APTES的浓度限制在1～10%范围内，减小芯片包被批内差变异系数，使得同批次内生产的成品芯片上固定的包被分子量更趋于相同，提高同一批次内成品芯片的质量的稳定性。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (7)

1.一种基于电学加速的荧光或化学发光检测方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤：
S1样本加速：将激励信号施加在滴加有目标分子的芯片上，获得结合有目标分子的芯片；所述芯片包括电极片，所述电极片上固定有包被分子，所述包被分子用于与所述目标分子特异性结合；
S2二抗加速：在结合有目标分子的芯片上滴加用于结合目标分子的二抗，然后将激励信号施加在芯片上，获得结合有二抗的芯片；
S3检测：对结合有二抗的芯片进行荧光检测或者化学发光检测；
在S1样本加速中，所述芯片的制备过程包括芯片包被步骤，所述芯片包被步骤用于将包被分子结合在芯片的电极片上；在芯片包被步骤中，固定有包被分子的电极片相对于未固定包被分子的电极片，在特定阻抗扫描频率下，电容变化率为-50～150%，或者阻抗变化率为-100～100%，或者相位变化率为-30～30%，或者电阻分量变化率为-40～40%，或者电感分量变化率为-200～200%；
所述芯片包被步骤包括使用硼酸缓冲液作为溶剂配制包被分子溶液；所述硼酸缓冲液由如下方法制备：在0.05～0.2M的硼酸溶液中加入0.0125～0.05M的四硼酸钠溶液，直至pH值为5～8；所述电极片的材质为铝。
2.根据权利要求1所述的一种基于电学加速的荧光或化学发光检测方法，其特征在于，在S1样本加速和S2二抗加速中，所述激励信号为电压5mV～40V以及频率500Hz～10MHz。
3.根据权利要求2所述的一种基于电学加速的荧光或化学发光检测方法，其特征在于，在S1样本加速和S2二抗加速中，所述激励信号的施加时长为5～90s。
4.根据权利要求3所述的一种基于电学加速的荧光或化学发光检测方法，其特征在于，在S2二抗加速中，所述二抗为荧光二抗或者为酶标二抗。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的一种基于电学加速的荧光或化学发光检测方法，其特征在于，在芯片包被步骤之前依次包括芯片活化步骤、芯片成膜步骤和芯片交联步骤；在芯片活化步骤中，等离子清洗处理所述芯片的电极片，且等离子清洗的介质为空气。
6.根据权利要求5所述的一种基于电学加速的荧光或化学发光检测方法，其特征在于，在芯片成膜步骤中，在经等离子清洗的电极片上覆盖APTES形成的覆膜。
7.根据权利要求6所述的一种基于电学加速的荧光或化学发光检测方法，其特征在于，在芯片交联步骤中，对所述覆膜进行醛基化修饰。
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