CN113125507B - 一种用于检测结核的传感器、制备方法及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测结核的传感器、制备方法及使用方法，包括以下步骤：表面活化、硅烷化处理、表面改性、共价连接。本发明所述的传感器选择结核杆菌的分泌蛋白作为靶标，对传感器的表面功能化参数进行了探索和优化，大大提高了该传感器的灵敏度，对结核杆菌分泌蛋白的检测限可达到0.01fg/mL，电流变化值在很长的浓度梯度范围内线性相关，可在几分钟内完成检测，能够在较短时间内以明显较宽的动态线性范围检测出结核杆菌，具有良好的稳定性和特异性，在实际环境中的结核检测具有广泛的应用前景。

Description

一种用于检测结核的传感器、制备方法及使用方法
技术领域
本发明属于传感器技术领域，尤其是涉及一种用于检测结核的传感器、制备方法及使用方法。
背景技术
结核的发病率和死亡率较高，是一种容易被忽略的慢性传染病。具目前的估计，大约四分之一的世界人口感染了结核分枝杆菌。2019年，全球约有1000万新结核病例，141万人死于结核(2018年相同)，近20亿人被潜在感染。结核是全球十大死亡原因之一，因此结核仍然是一个不容忽视的公共卫生威胁。
快速准确的检测是结核病控制的基础。细菌学检测占结核病诊断的80％。结核病主要通过结核杆菌在人与人之间传播。然而，结核杆菌具有较强的抗恶劣环境的能力，并能在环境中长期生存。目前结核杆菌的常规检测方法主要有培养法、影像学检测、痰涂片镜检、结核菌素敏感性试验、血清学检测及分子诊断等。这些技术大多复杂、耗时、灵敏度低、操作要求高，因此限制了它们在实验室以外的应用。此外，环境介质中结核杆菌的浓度极低且不易检测，杂质会造成干扰。传感器是一种无标记、快速、简便、节省试剂、超灵敏的检测装置，在结核病检测中具有良好的应用前景。虽然传感器在微生物检测中得到了广泛的应用，但其在结核杆菌检测中的适用性仍面临许多挑战。
其中一个挑战是结核杆菌的尺寸超过了传感器的德拜半径，无法对所产生的电信号进行灵敏检测。在本发明中，我们的策略是选择一个小于德拜半径且没有电荷屏蔽的特定结核杆菌生物标志物，以确保生物传感器能够进行灵敏的检测。因此，必须对结核分枝杆菌的识别元件进行筛选。结核杆菌分泌蛋白是早期培养滤液中的主要分泌物，粘附在细胞表面。可在血液、尿液、痰液或脑脊液中检测到。因此分泌蛋白可以用作结核杆菌的特定识别物质，结合生物传感器进行结核检测。
另一个挑战是生物受体与传感器表面的结合程度不够牢固，影响传感器的检测性能。目前用于传感器功能化的方法仍然需要完善，以便提高传感器的特异性和灵敏度。在一定程度内，随着固定在传感器表面的抗体数量的增加，传感器的灵敏度将提高。等离子体处理作为传感器功能化的重要步骤，其处理温度和所通气体也影响表面活化的效果，因此需要对等离子体最佳处理条件进行探索。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种用于检测结核的传感器、制备方法及使用方法，以提高传感器的灵敏度、稳定性和特异性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于检测结核的传感器的制备方法，包括以下步骤：
a.表面活化：利用氩等离子体清洗传感器表面，氩等离子体可以清除传感器表面的污染物而不产生化学反应，利用低温氧等离子体在传感器表面产生羟基，氧等离子体处理可以通过等离子体对表面硅晶片上的氧化层进行物理轰击和化学反应的双重作用，低温等离子体可以只对材料表面进行活化而不影响材料内部，处理后的传感器立即使用，以防止表面降解；
b.硅烷化处理：将步骤a得到的传感器浸泡在甲醇溶液中，置于恒温摇床内，在传感器表面形成氨基；
c.表面改性：将步骤b得到的传感器浸泡在戊二醛溶液中，在传感器表面形成醛基，用于后续连接；
d.共价连接：将步骤c得到的传感器浸润在结核杆菌多克隆抗体内，使结核杆菌多克隆抗体共价结合到传感器表面。
优选的，还包括以下步骤：
e.醛基封闭：使用牛血清蛋白封闭步骤d得到的传感器表面未结合的醛基，消除非特异性结合。
优选的，步骤c、d、e得到的传感器均经过PBS缓冲液冲洗，并氮气吹干。
优选的，步骤b得到的传感器经过甲醇冲洗，并用氮气吹干。
优选的，步骤b中甲醇溶液为5％APTES甲醇溶液，恒温摇床的温度为37℃，恒温时间为6h。
优选的，步骤b得到的传感器放入100℃通氮烘箱中20min。
优选的，步骤c中戊二醛溶液的体积浓度为25％，浸泡时间为3h。
一种根据上述任一所述的制备方法制得的用于检测结核的传感器。
一种如上所述的传感器的使用方法，包括以下步骤：
a.将传感器放入湿暗盒中，保持光强、湿度及温度等因素不变，使用0.01×PBS重复滴定至传感器表面完全浸润性能稳定；
b.向步骤a得到的传感器表面加入含有结核杆菌分泌蛋白的结核样本，使用多功能电源电表监测。
优选的，所述结核样本的制备方法包括以下步骤：
将结核患者痰液样本置于37℃摇床培养3h，使用0.01×PBS进行稀释。
相对于现有技术，本发明所述的用于检测结核的传感器、制备方法及使用方法具有以下优势：
(1)本发明所述的传感器选择结核杆菌的分泌蛋白作为靶标，对传感器的表面功能化参数进行了探索和优化，大大提高了该传感器的灵敏度，对结核杆菌分泌蛋白的检测限可达到0.01fg/mL；
(2)本发明所述的传感器电流变化值在很长的浓度梯度范围内线性相关；
(3)本发明所述的传感器可在几分钟内完成检测，能够在较短时间内以明显较宽的动态线性范围检测出结核杆菌；
(4)本发明所述的传感器具有良好的稳定性和特异性，在实际环境中的结核检测具有广泛的应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例所述的传感器的结构示意图；
图2为本发明实施例所述的传感器对单独氧等离子体、氩+氧等离子体和低温氩+氧等离子体三种条件下检测同一浓度结核杆菌分泌蛋白的响应曲线示意图；
图3为本发明实施例所述的传感器对1fg/mL-100ug/mL梯度浓度分泌蛋白溶液的实时电流响应示意图；
图4为本发明实施例所述的传感器对阴性痰液样本和阳性样本检测结果示意图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
本发明涉及一种用于检测结合的传感器，传感器表面修饰有结核杆菌抗体，制备方法包括以下步骤：
一种制备上述检测结核的传感器的方法，该方法的具体步骤为：
a.表面活化：利用氩等离子体对传感器进行预处理，以清除任何有机污染，利用低温氧等离子体在其表面产生羟基。处理后的传感器立即使用，以防止表面降解。
b.硅烷化处理：将该生物传感器完全浸泡在5％APTES甲醇溶液中，置于37℃摇床6h，在传感器表面形成氨基，然后在10℃通氮烘箱处理20min，使功能基团稳定。
c.表面改性：用25％戊二醛PBS溶液浸润传感器3h，在传感器表面生产醛基，用于后续连接。
d.共价连接：用结核杆菌多克隆抗体浸润传感器3h，将抗体共价结合到传感器。
e.醛基封闭：使用牛血清蛋白封闭d中未结合的醛基，消除非特异性结合，得到的传感器结构如图1所示。
上述制备方法中，步骤b得到的传感器需要使用甲醇进行冲洗，并用氮气吹干，步骤c、d、e得到的传感器则分别需要使用PBS缓冲液进行冲洗，并用氮气吹干，且除预先说明外，所有步骤均在室温下进行。
采用本发明中制备方法制得的检测结核的传感器，为保持传感器性能稳定，其使用方法的具体步骤为：
将修饰好的传感器置于湿暗盒中，保持光强、湿度及温度等物理因素不变，使用0.01×PBS进行重复滴定，使传感器表面完全浸润性能稳定，向上述传感器表面加入含有结核杆菌分泌蛋白的结核样本，用多功能电源电表，实时检测反应的过程。
如图2所示，分别使用单独氧等离子体、氩+氧等离子体和低温氩+氧等离子体三个参数对传感器进行等离子体表面处理，并使用相同浓度结核杆菌分泌蛋白对得到的传感器检测效果进行验证，证明经过本发明中等离子体处理后的传感器具有最好的检测效果。
如图3所示，使用0.01×PBS缓冲液对理想结核样本分泌蛋白进行十倍梯度稀释，按浓度由低到高依次使用本发明制得的传感器进行检测，传感器产生的电流信号在分泌蛋白浓度1fg/mL-100ug/mL浓度范围内线性相关，经计算可得本发明所述传感器的检测限为0.01fg/mL。
对实际结核样本患者痰液进行37℃摇床培养3小时，使用0.01×PBS缓冲液进行稀释处理，并用0.01×PBS缓冲液以及健康人体的阴性痰液作为对照样本，分别使用本发明制备的传感器进行检测，检测结果如图4所示，证明传感器对实际结核样本可以灵敏检测
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测结核的传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.表面活化：利用氩等离子体清洗传感器表面，利用低温氧等离子体在传感器表面产生羟基；
b.硅烷化处理：将步骤a得到的传感器浸泡在甲醇溶液中，置于恒温摇床内，在传感器表面形成氨基；
c.表面改性：将步骤b得到的传感器浸泡在戊二醛溶液中，在传感器表面形成醛基；
d.共价连接：将步骤c得到的传感器浸润在结核杆菌多克隆抗体内，使结核杆菌多克隆抗体共价结合到传感器表面。
2.根据权利要求1所述的用于检测结核的传感器的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
e.醛基封闭：使用牛血清蛋白封闭步骤d得到的传感器表面未结合的醛基。
3.根据权利要求2所述的用于检测结核的传感器的制备方法，其特征在于：步骤c、d、e得到的传感器均经过PBS缓冲液冲洗，并氮气吹干。
4.根据权利要求1所述的用于检测结核的传感器的制备方法，其特征在于：步骤b得到的传感器经过甲醇冲洗，并用氮气吹干。
5.根据权利要求1所述的用于检测结核的传感器的制备方法，其特征在于：步骤b中甲醇溶液为5％APTES甲醇溶液，恒温摇床的温度为37℃，恒温时间为6h。
6.根据权利要求1所述的用于检测结核的传感器的制备方法，其特征在于：步骤b得到的传感器放入100℃通氮烘箱中20min。
7.根据权利要求1所述的用于检测结核的传感器的制备方法，其特征在于：步骤c中戊二醛溶液的体积浓度为25％，浸泡时间为3h。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的制备方法制得的用于检测结核的传感器。
9.一种如权利要求8所述的传感器的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将传感器放入湿暗盒中，使用0.01×PBS重复滴定至传感器表面完全浸润；
b.向步骤a得到的传感器表面加入含有结核杆菌分泌蛋白的结核样本，使用多功能电源电表监测。
10.根据权利要求9所述的传感器的使用方法，其特征在于，所述结核样本的制备方法包括以下步骤：
将结核患者痰液样本置于37℃摇床培养3h，使用0.01×PBS进行稀释。
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