CN112986336B - 一种缓冲液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子快速检测元件加工技术领域，具体涉及一种缓冲液及其应用。一种缓冲液，其原料包括0.05～0.2M的硼酸溶液和0.0125～0.05M的四硼酸钠溶液，且pH值为5～8。该缓冲液应用在分子检测芯片的加工和生产的实践操作中，可解决由于加工方法导致的芯片电极片容易被腐蚀的技术问题，进而延长了芯片的有效期，提升了芯片质量、良品率并提高了相关检测的准确性和稳定性。

Description

一种缓冲液及其应用

技术领域

本发明涉及分子快速检测元件加工技术领域，具体涉及一种缓冲液及其应用。

背景技术

免疫反应以及亲合反应等原理现已经在分子检测或者诊断的实践中被广泛应用，但是在检测过程中，分子间的结合是依靠热扩散等被动的方式进行的，导致反应速度慢以及检测效果差。本方案的发明人提出了一种可以主动控制上述分子之间的结合反应的装置以及方法，克服了现有技术中的缺陷，详见中国专利CN104965081B（基于移动设备的抗体抗原检测方法）中记载的内容。该方案中使用到了一种特殊的铺设有电极片的芯片，通过在电极片上施加一定电压以及频率的交流电来实现对分子运动的控制。在该方案中，电极片上需要修饰有包被分子（抗体或者抗原或者其他的亲和分子），才能实现检测目的。但是，由于电极片通常是铜、铝等金属材质，并且在将包被分子固定在电极片的过程中，会使用大量生化试剂处理电极片，这样将导致电极片容易被腐蚀（锈蚀），电极片被腐蚀之后检测准确度大大降低，只能弃用。因此，现有的芯片包被加工方法会导致电极片易被腐蚀，进而缩短了电极片的保存时间（有效期），亟需研发一种新的芯片加工方法，以避复或者减少电极片腐蚀的现象的发生。

发明内容

本发明意在提供一种缓冲液，以解决由于加工方法导致的芯片的电极片容易产生腐蚀现象的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种缓冲液，其原料包括0.05～0.2M的硼酸溶液和0.0125～0.05M的四硼酸钠溶液，且pH值为5～8。

本方案的原理及优点是：在对芯片进行加工形成成品芯片的过程中，需要在醛基化的电极片上共价结合上包被分子。通常为保证上述共价结合过程的顺利进行，以及保证包被分子的活性，需要将包被分子的分散和溶解在缓冲液中。发明人最开始使用了最常用的磷酸盐缓冲液（PBS），发现磷酸盐缓冲液虽然能够一定程度上保证包被效果，但是最后获得的成品芯片的电极片上很容易产生腐蚀现象，而腐蚀的芯片只能弃用。发明人通过大量实验研究了腐蚀现像的成因，最终发现缓冲液的选用是一个非常关键的因素。发明人使用了大量的不同类型的缓冲液进行测试，发现本案的硼酸缓冲液（BBS）的抗腐蚀效果最佳。发明人进而分析了本方案的硼酸缓冲液产生上述效果的原因，硼酸缓冲液中的溶质可以在电极片的表面形成抗氧化保护层，进而防止的腐蚀的发生。在芯片的加工过程中，使用到本方案的硼酸缓冲液，可以克服金属材质的电极片容易被腐蚀的技术难题，可延长芯片的保存期，提升芯片的品质。

进一步，缓冲液由如下方法配制：在0.05～0.2M的硼酸溶液中加入0.0125～0.05M的四硼酸钠溶液，直至pH值为5～8。

在本方案中，通过在硼酸溶液中逐渐滴加四硼酸钠溶液，进而将整个缓冲液的pH值调整至5-8，最终获得可以用于芯片加工的缓冲液。现有技术中的硼酸缓冲液的配制方法不同于本方案，现有的方法大致为：使用0.2M的硼酸溶液和0.05M的四硼酸钠溶液按照一定比例混合，即可获得一定pH值的缓冲液。例如，现有技术中配制pH值为7.4的硼酸缓冲液，是将0.2M的硼酸溶液和0.05M的四硼酸钠溶液按照9:1的比例混合；现有技术中配制pH值为8的硼酸缓冲液，是将0.2M的硼酸溶液和0.05M的四硼酸钠溶液按照7:3的比例混合。而本方案采用的是在硼酸溶液中逐渐滴加四硼酸钠溶液的方案，pH值的调控更加的灵活。并且以上述浓度和pH值配置获得的缓冲液具有较好的抗腐蚀效果，硼酸、四硼酸钠的浓度和pH值超过或者低于上述范围，均不能获得理想的抗腐蚀效果。

进一步，缓冲液由如下方法配制：在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4。以上述方法配制的硼酸缓冲液可以获得最佳的防腐蚀效果，是一种优选方案。其中，硼酸和四硼酸钠的浓度更低，在有效起到缓冲作用的同时，能够实现最大程度的抗腐蚀。

进一步，一种缓冲液在芯片加工上的应用，所述芯片加工包括用于将包被分子结合在芯片的电极片上的芯片包被步骤；在所述芯片包被步骤中，使用所述缓冲液作为溶剂配制包被分子溶液。为了包被分子能够大量且稳定地结合在电极片上，需要使用包被分子溶液较为长时间地浸泡电极片，而液体的试剂会对电极片产生一定的腐蚀作用，特别是长时间的浸泡这种作用更加显著。在本方案中，使用特定的硼酸缓冲液配制包被分子溶液后，电极片的腐蚀现象被大大缓解，从而提升了芯片的质量。

进一步，在芯片包被步骤之后包括封闭与干燥步骤；在封闭与干燥步骤中，使用所述缓冲液作为溶剂配制封闭液，所述封闭液用于封闭电极片上的非包被分子结合位点。为了封闭液能够充分封闭电极片上的非特异性位点，需要使用封闭液浸泡电极片一段时间，而液体的试剂会对电极片产生一定的腐蚀作用。在本方案中，使用特定的硼酸缓冲液配制封闭液后，电极片的腐蚀现象被大大缓解，从而提升了芯片的质量。

进一步，在使用封闭液封闭电极片上的非包被分子结合位点之前以及之后，分别使用所述缓冲液洗所述电极片。在封闭前后用缓冲液洗芯片可除去杂质分子，而使用本方案特定的硼酸缓冲液进行清洗，可进一步避免腐蚀现象的发生。

进一步，所述电极片的材质为铝和/或铜。铝和铜为电极片的常用材料，使用本方案的硼酸缓冲液进行电极片的加工，可以最大程度地防止这两种金属材料被腐蚀。

进一步，在所述芯片包被步骤中，通过使用所述包被分子溶液浸泡所述电极片，将所述包被分子结合在所述电极片上，浸泡的时长为2～24h。上述时长可保证包被分子能够较为充分地与电极片结合，使得电极片上有足够量的用于结合目标分子的包被分子。

进一步，所述电极片的表面上有醛基化修饰。通过在电极片的表面进行醛基化修饰，包被分子（例如蛋白质）上的基团可以与醛基共价结合，从而将包被分子固定在电极片上。

进一步，在封闭与干燥步骤中，通过使用所述封闭液浸泡结合有包被分子的电极片，将电极片上的非包被分子结合位点封闭，浸泡的时长为0.5～2.0h。上述时长保证了芯片上的非特异性位点被充分封闭。

具体实施方式

实施例1：芯片加工

本实施例是在未固定包被分子（抗体或者抗原或者其他的亲和分子）的芯片的基础上进行加工形成包被了抗体的成品芯片。

本实施例使用的芯片参见发明人在先专利CN104965081B（基于移动设备的抗体抗原检测方法），在该专利中记载有（并参照该专利的附图2）：一种抗体抗原检测测试系统，包括至少一个反应单元，反应单元包括一个顶部开口的反应腔，反应腔底部设置有一块检测板，检测板上铺设有至少一对电极片，电极片的接线端穿过并固定在反应腔的盒体上；检测板上还固定有目标抗体或抗原的对应抗原或抗体。在本实施例中，芯片具体是指CN104965081B中的反应单元，铺设有电极片的检测板的结构可以参见发明人在先发表论文（Development of an AC electrokinetics-based immunoassay system for on-siteserodiagnosis of infectious diseases，Xiaozhu Liu，Sensors and Actuators A， 171(2011) 406–413，Fig. 3.（b））。通常反应腔和检测板为硅制材料（si），电极片均为金属材质（铝、金或铜，本实施为铝材质），电极片非常容易在加工过程中或者在加工完成后的存放过程中，逐渐地被腐蚀，使得整个芯片失效。另外，为了使得芯片具有结合并检测目标分子，需要在电极片上包被抗体（或者抗原或者其他的亲和分子，统称为包被分子），从而获得成品芯片，本方案在从芯片制作成为成品芯片的方法工艺上进行了改进。

1.预处理：

取未包被抗体的芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，确认芯片的电极片是否有无断条和连条（电极片之间相互平行），有无其他粘附的杂质，选取无断连条及粘附杂质的芯片继续后续实验（称为第一次镜检）。粘附的杂质的判断依据为：在电极片叉指部位（即电极片之间的间隙）没有粒径或者长度大于0.5um的斑点、颗粒、脏物或尘埃粒子，如有就判定为不合格。

2.芯片活化

用现有技术的等离子清洗机处理芯片表面，参数设置为：使用空气作为等离子清洗介质，真空度0.5mbar（可选择范围0.3～0.5mbar）,功率50W（可选择范围50～200W），处理芯片10min（可选择范围5～15min），获得活化后的芯片。该步骤的目的是对芯片表面进行表面清洗和修饰，使用空气中氧气，通过氧化反应，在表面生成-OH、-C=O、-COOH等基团；并使用空气中氮气，在芯片表面生成-NH₂基团。

3.芯片成膜

将活化后的芯片全部浸没（芯片的接线除外）到10%（质量百分数，可选择范围1～10%）APTES的乙醇溶液（将APTES溶于无水乙醇中，APTES的质量分数为10%，APTES即为3-氨丙基三乙氧基硅烷）中，常温（常温指18～25℃）放置30min（可选择范围5～60min）。每片芯片用装有无水乙醇的挤瓶冲洗30s,然后氮气吹干，获得成膜后的芯片。

每片成膜后的芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染，则舍弃该芯片（称为第二次镜检），判断方法同第一次镜检。

4.芯片交联

将合格的成膜后的芯片置于63℃（可选择范围50～100℃）烘箱固化60min，拿出冷却放置至常温。每片芯片向反应腔滴加10μl 2.5%（质量百分数，可选择范围1～10%）戊二醛溶液（纯水配制），溶液就覆盖电极片，再放入保湿盒常温（常温是指18～25℃）放置1h（可选择范围0.5～2.0h）。保湿盒的湿度为40%（可选择范围40～60%）。每片芯片用装有超纯水的挤瓶冲洗10s,然后氮气吹干，获得交联之后的芯片。

5.芯片包被

在交联之后的芯片上滴加10ul 10μg/ml 商业化的布鲁氏omp16抗原（一种具体的包被分子溶液，用于分散和溶解包被分子的溶剂为100mM BBS，根据实际需要检测的分子的情况，可选用不同抗原)，于22℃（可选择范围18～25℃）孵育20h（时间可选择在2～24h之间），获得包被后的芯片。接下来用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第三次镜检），判断方法同第一次镜检。

在本步骤中BBS（硼酸缓冲液）的配制方法为：在0.05～0.2M硼酸溶液中加入0.0125～0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为5～8。在本实施例中，具体为（即100mM BBS）：在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4。

6.封闭与干燥

每片包被后的芯片用200uL移液器加入20μL的100mM BBS,然后用氮气吹干，重复1次。每片芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第四次镜检），判断方法同第一次镜检。用10μL移液器滴加10μL 10% 牛血清白蛋白封闭液（溶剂为100mM BBS).于室温中封闭0.5h。每片芯片用200μL移液器加入20μL 100nM BBS,然后用氨气吹干，重复1次，获得成品芯片。

每片芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第五次镜检），判断方法同第一次镜检。

实施例2：芯片加工

本实施例在实施例1的基础上进行改进，在“5.芯片包被”过程中加入了阻抗扫描的质控过程，以保证芯片的良品率。具体如下：

芯片包被

在交联之后的芯片上滴加10ul 10μg/ml 商业化的布鲁氏omp16抗原（一种具体的包被分子溶液，用于分散和溶解包被分子的溶剂为100mM BBS，根据实际需要检测的分子的情况，可选用不同抗原)，孵育5min（可选择范围2～10min）。

然后使用阻抗仪连接于电极片的接线端进行阻抗频率扫描测量和分析。扫描频率范围为1MHz到100Hz（正弦交流电），激励电压为5mV（可选择范围1mV～100mV），采样点数201点，测量时间为3s，保存各芯片阻抗频率扫描数据（称为包被前阻抗扫描，获得在不同扫描频率下的电极片各响应参数，包括阻抗、相位、电阻分量、电容分量、电感分量等，作图获得包被前上述参数随频率变化的曲线）。在包被前阻抗扫描结束后，将芯片放在保湿盒中，于22℃(需控制环境温度）包被20h（时间可选择在2～24h之间），获得包被后的芯片。包被结束后，从保湿盒中取出芯片，然后用阻抗仪从扫描频率范围为1MHz到100Hz，激励电压为5mV（可选择范围1mV～100mV），采样点数201点，测量时间为3s。保存各芯片阻抗频率扫描数据（称为包被后阻抗扫描，获得在不同扫描频率下的电极片各响应参数，包括阻抗、相位、电阻分量、电容分量、电感分量等，作图获得包被前上述参数随频率变化的曲线）。

对比包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描结果，判定芯片是否合格，判定方法为：在上述阻抗扫描频率下，计算包被后扫描获得的电容值与包被前扫描获得的电容值的变化率，具体计算方法为：电容变化率=（包被后扫描的电容值-包被前扫描的电容值）/包被前扫描的电容值×100%。电容变化率需控制在-50.0～150.0%，不在此范围内的芯片为不合格芯片，需要丢弃。特定阻抗扫描频率是通过包被前电容随频率变化的曲线和包被后电容随频率变化的曲线来确认的，具体的确认方法为：计算获得包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描的同一频率下的电容变化率，电容变化率（在此处若该值为负数，则取其绝对值）的最大值所对应的扫描频率值即为特定阻抗扫描频率。在本实施例中，具体是在频率50KHz（即特定阻抗扫描频率）下计算电容变化率，并控制特定阻抗扫描频率下的电容变化率在60.0～100.0%范围内，其中，特定阻抗扫描频率下的电容变化率又称为扫描前后最大电容变化率。由于芯片批次以及包被探针不一样会使得特定阻抗扫描频率存在差异，所以需要在包被前后进行阻抗扫描，获得特定阻抗扫描频率，在该特定阻抗扫描频率下的电容变化率需要维持在一定范围内（-50.0～150.0%），才能保证成品芯片的合格率。

另外，除了选择电容作为参数进行判断，选择阻抗、相位、电阻分量、电感分量等参数也可做判断。电容、阻抗、相位、电阻分量和电感分量均为芯片的特征参数，也称为电信号值。在特定阻抗扫描频率下的阻抗、相位、电阻分量和电感分量的变化率需要维持在一定范围内，才能保证最终产品的合格率，范围分别为：阻抗变化率-100～100%、相位变化率-30～30%、电阻分量变化率-40～40%、电感分量变化率-200～200%。其中，阻抗变化率=（包被后扫描的阻抗值-包被前扫描的阻抗值）/包被前扫描的阻抗值×100%；相位变化率=（包被后扫描的相位值-包被前扫描的相位值）/包被前扫描的相位值×100%；电阻分量变化率=（包被后扫描的电阻分量值-包被前扫描的电阻分量值）/包被前扫描的电阻分量值×100%；电感分量变化率=（包被后扫描的电感分量值-包被前扫描的电感分量值）/包被前扫描的电感分量值×100%。其中，对于电容、阻抗、相位、电阻分量、电感分量等参数，特定阻抗扫描频率存在差异，在使用不同参数对芯片进行表征的时候，特定阻抗扫描频率是指：计算获得包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描的同一频率下的电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率，电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率（在此处若该值为负数，则取其绝对值）的最大值所对应的扫描频率值即为该参数的特定阻抗扫描频率（即电容的特定阻抗扫描频率、阻抗的特定阻抗扫描频率、相位的特定阻抗扫描频率、相位的特定阻抗扫描频率、电阻分量的特定阻抗扫描频率，以及电感分量的特定阻抗扫描频率）。

接下来用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第三次镜检），判断方法同第一次镜检。

实验例1：成品芯片抗腐蚀效果研究

本实验例对实施例1的“5.芯片包被”和“6.封闭与干燥”中的缓冲液进行了研究，具体的方式是使用测试缓冲液代替实施例的硼酸缓冲液，并通过实施例的方法制备获得成品芯片。将刚制备完成的成品芯片置于干燥密封袋中（编号1-9的测试均使用10个成品芯片，均独自包装于干燥密封袋中），每日使用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面（主要是电极片），判断电极片是否出现腐蚀或者锈蚀的现象，如果出现，记载该现象出现的日期，并统计抗锈蚀时长，实验结果如表1所示。

表1：抗锈蚀时长测试结果（mean±SD，N=10）

编号	测试缓冲液类型	测试缓冲液配制方法	抗锈蚀时长（天）
				1	BBS	参见实施例1	67.00±3.74
2	BBS	在0.05M硼酸溶液中加入0.0125M四硼酸钠溶液，直至pH值为5.0	63.60±3.86
				3	BBS	在0.2M硼酸溶液中加入0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为8.0	63.20±4.42
4	BBS	在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为9	N/A
				5	BBS	在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为4	N/A
6	BBS	在0.3M硼酸溶液中加入0.1M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4	55.10±2.47*
				7	BBS	在0.02M硼酸溶液中加入0.005M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4	52.60±3.17*
8	PBS	参见PBS配方（pH7.4）	N/A
				9	碳酸缓冲液	在0.1M碳酸氢钠溶液中滴加0.1M碳酸钠溶液，直至pH值为9.0。	N/A
10	硼酸溶液	0.1M硼酸溶液	N/A
				11	四硼酸钠溶液	0.025M四硼酸钠溶液	N/A

1L PBS配方（pH7.4）：磷酸二氢钾0.24g；磷酸氢二钠1.44g；氯化钠8g；氯化钾0.2g；加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。表1中*表示该实验组与编号1的数据相比具有显著差异（T检验，p＜0.05）。N/A表示在芯片加工过程中电极片已经大量发生锈蚀（通过镜检发现），属于不合格芯片，使用编号4、5和8-11的缓冲液（溶液），不能有效获得合格的成品芯片。

由实验结果可知，采用本方案的硼酸缓冲液制备的成品芯片，可获得较长的保质期，但是如果硼酸缓冲液中的硼酸或者四硼酸钠的浓度过高或者过低，缓冲液的pH值过高或者过低，都不利于抗氧化膜的形成，获得的成品芯片的抗腐蚀效果差。如果换用其他缓冲液或者是单用硼酸溶液或者是单用四硼酸钠溶液，均不能获得理想的抗腐蚀效果。

实验例2：未加工芯片抗腐蚀效果研究

将未固定包被分子的芯片（即实施例中1.预处理步骤中最初获得的芯片）置于测试缓冲液中（浸泡），每日使用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面（主要是电极片），判断电极片是否出现腐蚀或者锈蚀的现象，如果出现，记载该现象出现的日期，并统计抗锈蚀时长（每组实验使用一片未经过本方案加工的芯片）。本实验例也对测试缓冲液对于不同材质电极片的作用进行了研究，实验结果如表2所示。

表2：抗锈蚀时长测试结果

编号	电极片材质	测试缓冲液	测试缓冲液配制方法	锈蚀时间
					1	铝	BBS	参见实施例1	3天
2	铝	BBS	在0.05M硼酸溶液中加入0.0125M四硼酸钠溶液，直至pH值为5.0	3天
					3	铝	BBS	在0.2M硼酸溶液中加入0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为8.0	3天
4	铝	BBS	在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为9	1天
					5	铝	BBS	在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为4	1天
6	铝	BBS	在0.3M硼酸溶液中加入0.1M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4	1天
					7	铝	BBS	在0.02M硼酸溶液中加入0.005M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4	1天
8	铝	PBS	参见PBS配方（pH7.4）	1天
					9	铝	碳酸缓冲液	在0.1M碳酸氢钠溶液中滴加0.1M碳酸钠溶液，直至pH值为9.0	1天

由实验结果可知，采用本方案的硼酸缓冲液，对电极片均有较好的抗腐蚀作用。缓冲液的pH值过高或者过低，都不利于抗氧化膜的形成，使得电极片的抗腐蚀效果差。如果换用其他缓冲液，均不能获得理想的抗腐蚀效果。

实验例3：质控和表征条件研究

采用实施例2的芯片制备方法制备芯片100个，并选取其中20个芯片进行合格率检测（表3中的编号1）。为了测试质控表征方法的效果，在本实验例中设置了对比实验，具体设置情况如下：编号2在实施例2的基础上，对电容变化率的限定范围调整为-50～50%，超出该范围的芯片需要舍弃；编号3在实施例2的基础上，对电容变化率的限定范围调整为80～150%，超出该范围的芯片需要舍弃；编号4在实施例2的基础上，对电容变化率的限定范围调整为-50～150%，超出该范围的芯片需要舍弃；编号5在实施例2的基础上，去掉了镜检质控的过程；编号6在实施例2的基础上，去掉了阻抗检测质控的过程；编号7在实施例2的基础上，去掉了镜检质控和阻抗检测质控的过程；编号8-10在实施例2的基础上，对电容变化率的限定范围进行了调整，超出表格中所示范围的芯片需要舍弃；编号11和12在实施例2的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对阻抗变化率的控制，并限定了具体的阻抗变化率范围；编号13和14在实施例2的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对相位变化率的控制，并限定了具体的相位变化率范围；编号15和16在实施例2的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对电阻分量变化率的控制，并限定了具体的电阻分量变化率范围；编号17和18在实施例2的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对电感分量变化率的控制，并限定了具体的电感分量变化率范围。

检测的标准样品为布鲁氏病血清企业标准参考品（每份标准参考品用量10μl，包括10份布病抗体阳性血清参考品，10份布病阴性血清参考品）。其中，10个芯片用于检测10份抗体阳性血清参考品，10个芯片用于检测10份抗体阳性血清参考品。10份布病抗体阳性血清参考品的抗体效价为200000IU。检测后统计合格率，标准参考品的检测的方法如下：

在芯片上加入标准样品后，用阻抗仪对芯片施加交流电并同时检测电极片的电容变化。在固定频率下，用固定电压进行60s的连续测量。同时计算这60s电容的平均变化率，即为检测结果。分别检测10份企业阴性参考品和10份企业阳性参考品，对照检测结果和阈值判定芯片是否合格。检测阈值设定为20，检测结果的数值大于20为阴性，检测结果的数值小于20为阳性。10份阳性质控品的检测结果应该全部小于20，10份阴性质控品的检测结果应该全部大于20，不符合上述，则判定为该芯片不合格。合格率计算方法为：合格率=合格的芯片数量/20×100%。实验结果参见表3。

表3：质控方式对于合格率的影响

编号	质控方式	特征参数	特征参数变化率	合格芯片数量	合格率
						1	阻抗检测质控+镜检质控	电容	60～100%	20	100.0%
2	阻抗检测质控+镜检质控	电容	-50～50%	20	100.0%
						3	阻抗检测质控+镜检质控	电容	80～150%	19	95.0%
4	阻抗检测质控+镜检质控	电容	-50～150%	18	90.0%
						5	阻抗检测质控	电容	60～100%	15	75.0%
6	镜检质控	N/A	N/A	13	65.0%
						7	N/A	N/A	N/A	8	40.0%
8	阻抗检测质控+镜检质控	电容	-100～200%	15	75.0%
						9	阻抗检测质控+镜检质控	电容	100～250%	15	75.0%
10	阻抗检测质控+镜检质控	电容	-150～50%	16	80.0%
						11	阻抗检测质控+镜检质控	阻抗	-100～100%	20	100.0%
12	阻抗检测质控+镜检质控	阻抗	-150～150%	16	80.0%
						13	阻抗检测质控+镜检质控	相位	-30～30%	20	100.0%
14	阻抗检测质控+镜检质控	相位	-50～50%	17	85.0%
						15	阻抗检测质控+镜检质控	电阻分量	-40～40%	20	100.0%
16	阻抗检测质控+镜检质控	电阻分量	-60～60%	17	85.0%
						17	阻抗检测质控+镜检质控	电感分量	-200～200%	20	100.0%
18	阻抗检测质控+镜检质控	电感分量	-300～300%	17	85.0%

根据表3的结果可知，采用阻抗检测质控和镜检质控的双重质控方式，并将电容变化率控制在-50～150%，可以获得较为理想的成品芯片合格率。而采用单一的质检方式或者不质检（参见编号6和7的实验数据），会导致最后的成品芯片的合格率降低。在阻抗检测质控过程中，在特定频率下的电容变化率是否维持在一定范围内对于合格率的提升非常关键。如果电容变化率不在-50～150%内（参见编号8-10的实验数据），则成品芯片的合格率大幅下降。使用阻抗变化率、相位变化率、电阻分量变化率和电感分量变化率来对芯片进行表征，并选取符合范围要求的芯片，舍弃超范围芯片，均可以获得理想的合格率（参见编号11-18的实验数据）。

发明人在制作芯片的过程中发现，按照预处理、芯片活化、芯片成膜、芯片交联、芯片包被和封闭与干燥的过程，将包被分子固定在芯片的电极片上，如果不加入一定的质控方式，最终获得的成品芯片的质量稳定性非常不理想，会出现较多的不合格芯片。为克服上述问题，发明人在芯片制作过程中引入了质控过程，即本方案的表征方法。然而芯片制作的流程比较长，技术点锁碎而繁多，在哪个步骤进行质控以及进行怎样的质控，这是现有技术中尚未见报道的。发明人最先尝试在每个步骤严格检测芯片是否出现损坏和污染，丢弃出现破损和污染的芯片，成品芯片的合格率以及稳定性虽然得到了一定的改善，但效果仍不是非常理想。通过大量研究发现，电极片在固定包被分子前后的电容变化率是影响芯片质量的关键（特定阻抗扫描频率下），如果能够将电容变化率的上限和下限设置成-50%和150%，弃用电容变化等超过上述泛围的芯片。那么获得的成品芯片的合格率从及稳定性会具有显著提升。

另外，除了选择电容作为参数进行判断，选择阻抗、相位、电阻分量、电感分量等参数也可做判断。电容、阻抗、相位、电阻分量和电感分量均为芯片的特征参数，也称为电信号值。在特定阻抗扫描频率下的阻抗、相位、电阻分量和电感分量的变化率需要维持在一定范围内，才能保证最终产品的合格率。

综上所述，在芯片包被的过程中，检测并计算在特定阻抗扫描频率下的电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率，并舍弃在规定范围之外的芯片，可以有效排除不合格芯片，提升获得的成品芯片的质量。

实验例4：芯片活化和芯片成膜条件研究

本实验例对芯片活化和芯片成膜条件进行了研究。编号1为实施例2中制备的芯片；编号2为APTES浓度为5%，其他条件和处理方式同实施例2；编号3为APTES浓度为1%，其他条件和处理方式同实施例2；编号4使用氮气代替空气作为芯片活化步骤中介质，其他条件和处理方式同实施例2；编号5使用氧气代替空气作为芯片活化步骤中介质，其他条件和处理方式同实施例2；编号6使不采用“2.芯片活化”，直接进行“3.芯片成膜”，其他条件和处理方式同实施例2；编号7使不采用“3.芯片成膜”，在“2.芯片活化”后直接进行“4.芯片交联”，其他条件和处理方式同实施例2。每组各选取10片成品芯片进行检测

在每片芯片的特定阻抗扫描频率下，计算每片芯片包被后扫描获得的电容值与包被前扫描获得的电容值的变化率，继而计算芯片的电容变化率的平均值和标准差，计算得到芯片包被批内差变异系数CV，芯片包被批内差变异系数CV的计算公式为：变异系数（CV）＝（标准差SD/平均值X）100％，芯片包被批内差变异系数CV如表4所示。

表4：芯片活化和芯片成膜条件研究的实验分组和结果

编号	1	2	3	4	5	6	7
								CV（%）	10.8	11.7	12.6	25.9	27.1	36.2	61.3

由表4可知，编号1-3的芯片包被批内差变异系数CV仅为远低于编号7，在芯片上形成APTES膜明显有助于包被分子稳定地固定在芯片上，且包被分子不易脱落，从而使得同一批次生产的成品芯片上固定的包被分子量更趋于相同，保证同一批次生产的成品芯片的质量的稳定性。编号1-3的芯片包被批内差变异系数CV仅为远低于编号6，未进行芯片活化步骤而制得的成品芯片，即使是同一批次内生产的，其上固定的包被分子量差异较大，导致同一批次生产的成品芯片的质量不稳定。编号1-3与编号4和5相比，这说明在芯片活化步骤中，对于清洗介质的选择，将会影响后续的芯片加工步骤。本发明中，选择空气作为清洗介质时，能够有效减小芯片包被批内差，提高成品芯片的质量的稳定性。

综上所述，本发明中，使用空气作为等离子清洗的清洗介质，并在芯片上形成APTES膜，且将芯片成膜步骤中的APTES的浓度限制在1～10%范围内，减小芯片包被批内差变异系数，使得同批次内生产的成品芯片上固定的包被分子量更趋于相同，提高同一批次内成品芯片的质量的稳定性。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (7)

1.一种缓冲液在芯片加工上的应用，其特征在于，所述缓冲液的原料包括0.1M的硼酸溶液和0.025M的四硼酸钠溶液，且pH值为7.4；所述芯片加工包括用于将包被分子结合在芯片的电极片上的芯片包被步骤；在所述芯片包被步骤中，使用所述缓冲液作为溶剂配制包被分子溶液；所述电极片的材质为铝；

在所述芯片包被步骤中，在抗原包被在芯片上的前后，在特定阻抗扫描频率下的电容变化率为-50～150%；或者在特定阻抗扫描频率下的阻抗变化率-100～100%；或者在特定阻抗扫描频率下的相位变化率-30～30%；或者在特定阻抗扫描频率下的电阻分量变化率-40～40%；或者在特定阻抗扫描频率下的电感分量变化率-200～200%；

所述特定阻抗扫描频率是指：计算获得包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描的同一频率下的电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率，电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率的最大值所对应的扫描频率值即为该参数的特定阻抗扫描频率；

所述芯片包被步骤之前设有芯片活化步骤；在芯片活化步骤中，使用等离子清洗机处理芯片表面，参数设置为：使用空气作为等离子清洗介质，真空度0.3～0.5mbar,功率50～200W，处理芯片5～15min，获得活化后的芯片。

2.根据权利要求1所述的一种缓冲液在芯片加工上的应用，其特征在于，所述缓冲液由如下方法配制：在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4。

3.根据权利要求2所述的一种缓冲液在芯片加工上的应用，其特征在于，在芯片包被步骤之后包括封闭与干燥步骤；在封闭与干燥步骤中，使用所述缓冲液作为溶剂配制封闭液，所述封闭液用于封闭电极片上的非包被分子结合位点。

4.根据权利要求3所述的一种缓冲液在芯片加工上的应用，其特征在于，在使用封闭液封闭电极片上的非包被分子结合位点之前以及之后，分别使用所述缓冲液冲洗所述电极片。

5.根据权利要求4所述的一种缓冲液在芯片加工上的应用，其特征在于，在所述芯片包被步骤中，通过使用所述包被分子溶液浸泡所述电极片，将所述包被分子结合在所述电极片上，浸泡的时长为2～24h。

6.根据权利要求5所述的一种缓冲液在芯片加工上的应用，其特征在于，所述电极片的表面上有醛基化修饰。

7.根据权利要求6所述的一种缓冲液在芯片加工上的应用，其特征在于，在封闭与干燥步骤中，通过使用所述封闭液浸泡结合有包被分子的电极片，将电极片上的非包被分子结合位点封闭，浸泡的时长为0.5～2.0h。