CN112986556B - 一种用于快速检测的芯片及其加工方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物分子快速检测领域，公开了一种用于快速检测的芯片的加工方法，包括芯片活化、芯片成膜、芯片交联、芯片包被和封闭与干燥五个步骤，在芯片活化步骤中，使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗，得到活化后的芯片；在芯片成膜步骤中，在活化后的芯片上覆盖APTES膜；在芯片交联步骤中，醛基化修饰所述APTES膜；在芯片包被步骤中，将包被分子固定在醛基化修饰的APTES膜上；在封闭与干燥步骤中，将芯片上的非特异性位点封闭。本发明中，APTES膜经醛基化修饰后，能够将包被分子稳定地固定在芯片上，且同一批次生产的成品芯片，其上固定的生物分子量差异小，从而使得同一批次生产的成品芯片的质量更加稳定。

Description

一种用于快速检测的芯片及其加工方法

技术领域

本发明涉及生物分子快速检测领域，具体涉及一种用于快速检测的芯片及其加工方法。

背景技术

中国专利CN104965081B公开了一种基于移动设备的抗体抗原检测方法，该方法利用了交流电电热效应（AC electro-thermal effect，ACET），主动控制免疫反应以及亲合反应涉及的分子之间的结合反应，使得检测过程更为可控和快捷。该方案中使用到了一种特殊的、铺设有电极片的芯片，通过在电极片上施加一定电压以及频率的交流电来实现对分子运动的控制。为实现检测目的，电极片上需要固定包被分子（抗原或者抗体，也可以称作探针），这需要对芯片进行一系列的加工。由于传统的芯片是以硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等作为固相递质，而基于上述电加速的芯片是以电极片作为固相递质，包被分子固定在电极片上具有难度，且如何使得每片芯片上固定的包被分子量趋于相同从而保证成品芯片质量的稳定性也是亟待解决的一大问题。

发明内容

本发明意在提供一种用于快速检测的芯片的加工方法，以解决包被分子如何固定于电极片上的问题。

为达到上述目的，本发明提供了一种用于快速检测的芯片的加工方法，包括以下步骤：

S1、芯片活化步骤：使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗，获得活化后的芯片；

S2、芯片成膜步骤：在活化后的芯片上覆盖APTES膜；

S3、芯片交联步骤：醛基化修饰所述APTES膜；

S4、芯片包被步骤：将包被分子固定在醛基化修饰的APTES膜上，所述包被分子为抗原或者抗体；

S5、封闭与干燥步骤：将芯片上的非特异性位点封闭。

本发明还提供了一种采用上述加工方法制成的一种用于快速检测的芯片，所述芯片包括检测板，检测板上铺设有电极片，经过等离子处理的所述电极片上覆盖有APTES膜，APTES膜上固定有包被分子。

本方案的原理及优点是：在芯片活化步骤中，使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗，使得芯片的电极片上修饰上-OH、-C=O、-COOH、-NH₂等基团，以便后续在芯片成膜步骤中，芯片的电极片上能够形成稳定的、均一的APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）膜，而APTES膜在芯片交联步骤中，经醛基化修饰后，再与包被分子结合，从而将包被分子稳定地固定在芯片上。并且，本方案中，APTES膜经醛基化修饰后，在APTES膜上能够稳定地结合一定数量的醛基，更有助于后续结合一定量的包被分子，从而解决了包被分子如何固定于电极片上问题，并控制芯片包被批内差变异系数在11.2～13.0%范围内，使得同一批次生产的成品芯片上固定的生物分子量的差异减小，从而使得同一批次生产的成品芯片的质量更加稳定，提高成品芯片的质量的稳定性。

优选的，作为一种改进，芯片包被步骤包括阻抗检测质控：固定有包被分子的电极片相对于未固定包被分子的电极片，在特定阻抗扫描频率下，电容变化率为-50～150%，或者阻抗变化率为-100～100%，或者相位变化率为-30～30%，或者电阻分量变化率为-40～40%，或者电感分量变化率为-200～200%。

在芯片的加工方法中，通过阻抗检测质控实现对芯片的质检，在芯片的电极片上固定包被分子的前后，分别使用阻抗仪对芯片进行扫描，绘制出芯片的电容随交流电频率变化的曲线。分析前后两组数据，获得特定阻抗扫描频率，计算在该特定阻抗扫描频率下电容的变化率。计算方法为：电容变化率=（包被后扫描的电容值-包被前扫描的电容值）/包被前扫描的电容值×100%。该电容变化率需要保证在-50～150%，检测结果不在上述范围内的芯片均需要丢弃。实验证明在后控过程中，将电容变化率维持在本范围内，可以有效控制芯片质量，保证芯片的稳定性、均质性以及较高的合格率。

在芯片加工的过程中发明人发现，按照芯片活化、芯片成膜、芯片交联、芯片包被和封闭与干燥的过程，将包被分子固定在芯片的电极片上，如果不加入一定的质控方式，最终获得的成品芯片的质量稳定性非常不理想，会出现较多的不合格芯片。为克服上述问题，发明人在芯片制作过程中引入了质控过程。然而芯片制作的流程比较长，技术点锁碎而繁多，在哪个步骤进行质控以及进行怎样的质控，这是现有技术中尚未见报道的。发明人最先尝试在每个步骤严格检测芯片是否出现损坏和污染，丢弃出现破损和污染的芯片，成品芯片的合格率以及稳定性虽然得到了一定的改善，但效果仍不是非常理想。通过大量研究发现，电极片在固定包被分子前后的电容变化率是影响芯片质量的关键（特定阻抗扫描频率下），如果能够将电容变化率的上限和下限设置成-50%和150%，弃用电容变化率超过上述范围的芯片，那么获得的成品芯片的合格率从及稳定性会具有显著提升。

另外，除了选择电容作为参数进行判断，选择阻抗、相位、电阻分量、电感分量等参数也可做判断。电容、阻抗、相位、电阻分量和电感分量均为芯片的特征参数，也称为电信号值。在特定阻抗扫描频率下的阻抗、相位、电阻分量和电感分量的变化率需要维持在一定范围内，才能保证最终产品的合格率。

综上所述，在芯片包被步骤中，引入阻抗检测质控步骤，检测并计算在特定阻抗扫描频率下的电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率，并舍弃在规定范围之外的芯片，可以有效排除不合格芯片，提升获得的成品芯片的质量。

优选的，作为一种改进，在阻抗检测质控步骤中，特定阻抗扫描频率为100Hz～1MHz，电压为1mV～100mV。经大量实验检测发现，不同的芯片（电极片材质不同、包被分子不同等）的特定阻抗扫描频率的变化范围在100Hz～1MHz，适于进行阻抗扫描的电压为1mV～100mV。

优选的，作为一种改进，在芯片成膜步骤中，将活化后的芯片浸泡至1～10wt%APTES的乙醇溶液中，获得覆盖有APTES膜的芯片。经实验发现，APTES的浓度为1-10wt%时，芯片成膜效果更好，使得同一批次生产的成品芯片的质量更稳定。

优选的，作为一种改进，在芯片交联步骤中，将成膜后的芯片加热固化，冷却后滴加1～10wt%戊二醛纯水溶液，获得交联后的芯片。利用戊二醛纯水溶液对成膜后的芯片进行醛基化修饰，以便后续能够结合交联对应的包被分子。

优选的，作为一种改进，在芯片包被步骤中，使用硼酸缓冲液作为溶剂配制包被分子溶液。在对芯片包被步骤中，要在芯片上经醛基化修饰后的PATES膜上结合上包被分子，通常为保证上述结合过程的顺利进行，以及保证包被分子的活性，需要将包被分子的分散和溶解在缓冲液中。发明人最开始使用了最常用的磷酸盐缓冲液（PBS），发现磷酸盐缓冲液虽然能够一定程度上保证包被效果，但是最后获得的成品芯片的电极片很容易产生腐蚀现象，而腐蚀的芯片只能弃用。发明人通过大量实验研究了腐蚀现象的成因，最终发现缓冲液的选用是一个非常关键的因素。发明人使用了大量的不同类型的缓冲液进行测试，发现本案的硼酸缓冲液（BBS）的抗腐蚀效果最佳。在芯片的加工过程中，使用到本方案的硼酸缓冲液，可以克服金属材质的电极片容易出现腐蚀现象的技术难题，可延长芯片的保存期，提升芯片的品质。

优选的，作为一种改进，所述硼酸缓冲液的配制方法为：在0.05～0.2M的硼酸溶液中加入0.0125～0.05M的四硼酸钠溶液，直至pH值为5～8。在本方案中，通过在硼酸溶液中逐渐滴加四硼酸钠溶液，进而将整个缓冲液的pH值调整至5～8，最终获得可以用于芯片加工的缓冲液。现有技术中的硼酸缓冲液的配制方法不同于本方案，现有的方法大致为：使用0.2M的硼酸溶液和0.05M的四硼酸钠溶液按照一定比例混合，即可获得一定pH值的缓冲液。例如，现有技术中配制pH值为7.4的硼酸缓冲液，是将0.2M的硼酸溶液和0.05M的四硼酸钠溶液按照9:1的比例混合；现有技术中配制pH值为8的硼酸缓冲液，是将0.2M的硼酸溶液和0.05M的四硼酸钠溶液按照7:3的比例混合。而本方案采用的是在硼酸溶液中逐渐滴加四硼酸钠溶液的方案，使得pH值的调控更加的灵活。

优选的，作为一种改进，在芯片包被步骤中，在交联后的芯片上滴加所述包被分子溶液，于18～25℃孵育2～24h，得到包被后的芯片。在芯片包被步骤中，包被分子与醛基化修饰后的芯片结合，从而将包被分子稳定地固定在芯片上。

优选的，作为一种改进，还包括镜检质控步骤：在金相显微镜下视检电极片，舍弃不合格芯片，不合格芯片的判断标准为：电极片存在断条或者连条，或电极片的叉指部位存在粒径或者长度大于0.5μm的异物。本方案中，对芯片进行镜检，将不合格的芯片及时剔除，避免做无用功。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1

一种用于快速检测的芯片的加工方法，包括预处理、芯片活化、芯片成膜、芯片交联、芯片包被和封闭与干燥六个步骤，还包括阻抗检测质控步骤和镜检质控步骤。采用上述加工方法加工而得的一种用于快速检测的芯片，该芯片包括检测板，检测板上铺设有电极片，检测板带有电极片的一面覆盖有APTES膜，APTES膜上固定有包被分子。本实施例中，铺设有电极片的检测板的结构可以参见发明人在先发表论文（Development of an ACelectrokinetics-based immunoassay system for on-site serodiagnosis ofinfectious diseases，Xiaozhu Liu，Sensors and Actuators A， 171 (2011) 406–413，Fig. 3.（b））。通常反应腔和检测板为硅制材料（si），电极片均为金属材质（铝、金或铜，本实施为铝材质）。

本实施例中，是在未固定包被分子（包被分子为抗原或者抗体，当包被分子为抗原时，用以检测样品中是否含有与该抗原特异性结合的抗体，当包被分子为抗体时，用以检测样品中是否含有与该抗体特异性结合的抗原）的芯片上进行加工获得固定上包被分子的成品芯片。

上述用于快速检测的芯片的加工方法的步骤具体如下：

1）预处理步骤

对芯片进行第一次镜检（属于镜检质控步骤），利用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，取无断条、无连条、无粘附杂质的芯片，剔除不合格芯片。不合格芯片的判断标准为：电极片存在断条或者连条，或在电极片叉指部位（即电极片之间的间隙）存在大于0.5μm的斑点、颗粒、赃物和尘埃粒子。

2）芯片活化步骤

使用空气作为清洗介质，利用现有技术中的等离子清洗机对芯片进行等离子清洗，其中，等离子清洗机的真空度为0.5mbar（可选择范围0.3～0.5mbar），功率为50w（可选择范围50～200w），清洗时长为10min（可选择范围5～15min），得到活化后的芯片。该步骤的目的是对芯片表面进行表面清洗和修饰，使用空气中氧气，通过氧化反应，在表面生成-OH、-C=O、-COOH等基团；并使用空气中氮气，在芯片表面生成-NH₂基团。

3）芯片成膜步骤

将活化后的芯片全部浸泡（芯片的接线除外）至10wt%APTES的乙醇溶液中（将APTES溶于无水乙醇中，APTES的质量分数为10%，APTES即为3-氨丙基三乙氧基硅烷），常温（常温指18～25℃）浸泡30min（可选择范围5～60min），然后使用无水乙醇冲洗每片芯片30s，然后氮气吹干，获得成膜后的芯片。

对成膜后的芯片进行第二次镜检（属于镜检质控步骤），利用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染，则舍弃该芯片，判断标准同第一次镜检。

4）芯片交联步骤

将成膜后的芯片加热固化，固化温度为63℃（可选择范围50～100℃），固化时间为60min（可选择范围30～120min）。自然冷却后，向芯片的反应腔滴加10μL 2.5wt%（可U型安泽范围1～10wt%）戊二醛溶液（纯水配制），戊二醛溶液覆盖电极片，再将芯片放入保湿盒中22℃（可选择范围18～25℃）下放置1h（可选择范围0.5～2.0h），保湿盒的湿度为40%（可选择范围40～60%）。然后，超纯水冲洗芯片10s，氮气吹干，获得交联后的芯片。

5）芯片包被步骤

在交联后的芯片上滴加生物分子溶液，于22℃（可选择范围18～25℃）孵育20h（可选择范围2～24h），得到包被后的芯片。本实施例中，在交联后的芯片上滴加10μL 10μg/mL商业化的布鲁氏omp抗原，其中，使用硼酸缓冲液（BBS）作为溶剂分散和溶解上述抗原，硼酸缓冲液的配制方法为：在0.05-0.2M硼酸溶液中加入0.0125-0.05四硼酸钠溶液，直至pH值为5-8。本实施例中，硼酸缓冲液（即100mM BBS）的配制方法为：在0.1M硼酸溶液中加入0.025四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4。需要说明的是，本实施例中，可根据实际需要检测的生物分子的情况，选择不同的抗原。

在芯片包被步骤中，引入阻抗检测质控步骤，在芯片孵育5min后，使用阻抗仪对芯片进行阻抗检测，具体地，使用组抗议连接于电极片的接线端进行阻抗频率扫描测量和分析，扫描频率范围为1MHz到100Hz，激励电压为5mV（可选择范围1mV～100mV），采样点数201点，测量时间为3s，保存各芯片阻抗频率扫描数据（称为包被前阻抗扫描，获得在不同扫描频率下的电极片各响应参数，如阻抗、相位、电阻分量、电容分量、电感分量等，作图获得包被前上述参数随频率变化的曲线）。

在包被前阻抗扫描结束后，将芯片放在保湿盒中，于22℃（可选择范围18～25℃）孵育20h（可选择范围2～24h），获得包被后的芯片。包被结束后，从保湿盒中取出芯片，然后用阻抗仪对包被后的芯片进行阻抗检测，同样地，扫描频率范围为1MHz到100Hz，激励电压为5mV（可选择范围1mV～100mV），采样点数201点，测量时间为3s，保存各芯片阻抗频率扫描数据（称为包被后阻抗扫描，获得在不同扫描频率下的电极片各响应参数，如阻抗、相位、电阻分量、电容分量、电感分量等，作图获得包被前上述参数随频率变化的曲线）。

对比包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描结果，判定芯片是否合格，判定方法为：在上述阻抗扫描频率下，计算包被后扫描获得的电容值与包被前扫描获得的电容值的变化率，具体计算方法为：电容变化率=（包被后扫描的电容值-包被前扫描的电容值）/包被前扫描的电容值×100%。电容变化率需控制在-50.0～150.0%范围内，不在此范围内的芯片为不合格芯片，需要丢弃。特定阻抗扫描频率是通过包被前电容随频率变化的曲线和包被后电容随频率变化的曲线来确认的，具体的确认方法为：计算获得包被前扫描和包被后扫描的同一频率下的电容变化率，电容变化率（在此处若该值为负数，则取其绝对值）最大值所对应的扫描频率值即为特定阻抗扫描频率。在本实施例中，具体是在频率50KHz（即特定阻抗扫描频率）下计算电容变化率，并控制特定阻抗扫描频率下的电容变化率在60.0～100.0%范围内，其中，特定阻抗扫描频率下的电容变化率又称为扫描前后最大电容变化率。由于芯片批次以及包被的生物分子不一样会使得特定阻抗扫描频率存在差异，所以需要在包被前后进行阻抗扫描，获得特定阻抗扫描频率，在该特定阻抗扫描频率下的电容变化率需要维持在一定范围内，才能保证成品芯片的合格率。

另外，除了选择电容作为参数进行判断，选择阻抗、相位、电阻分量、电感分量等参数也可做判断。电容、阻抗、相位、电阻分量和电感分量均为芯片的特征参数，也称为电信号值。在特定阻抗扫描频率下的阻抗、相位、电阻分量和电感分量的变化率需要维持在一定范围内，才能保证最终产品的合格率，范围分别为：阻抗变化率-100～100%、相位变化率-30～30%、电阻分量变化率-40～40%、电感分量变化率-200～200%。其中，阻抗变化率=（包被后扫描的阻抗值-包被前扫描的阻抗值）/包被前扫描的阻抗值×100%；相位变化率=（包被后扫描的相位值-包被前扫描的相位值）/包被前扫描的相位值×100%；电阻分量变化率=（包被后扫描的电阻分量值-包被前扫描的电阻分量值）/包被前扫描的电阻分量值×100%；电感分量变化率=（包被后扫描的电感分量值-包被前扫描的电感分量值）/包被前扫描的电感分量值×100%。其中，对于电容、阻抗、相位、电阻分量、电感分量等参数，特定阻抗扫描频率存在差异，在使用不同参数对芯片进行表征的时候，特定阻抗扫描频率是指：计算获得包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描的同一频率下的电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率，电容变化率、阻抗变化率、相位变化率、相位变化率、电阻分量变化率或者电感分量变化率（在此处若该值为负数，则取其绝对值）的最大值所对应的扫描频率值即为该参数的特定阻抗扫描频率（即电容的特定阻抗扫描频率、阻抗的特定阻抗扫描频率、相位的特定阻抗扫描频率、相位的特定阻抗扫描频率、电阻分量的特定阻抗扫描频率，以及电感分量的特定阻抗扫描频率）。

接下来用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第三次镜检），判断方法同第一次镜检。

6）封闭与干燥

每片包被后的芯片用200μL移液器加入20μL的100mM BBS,然后用氮气吹干，重复1次。每片芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第四次镜检），判断方法同第一次镜检。用10μL移液器滴加10μL 10%牛血清白蛋白封闭液（溶剂为 100mM BBS)，于室温中封闭0.5h。每片芯片用200μL移液器加入20μL 100nM BBS,然后用氨气吹干，重复1次，获得成品芯片。

每片成品芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第五次镜检），判断方法同第一次镜检。

实施例2-实施例4、对比例1-对比例3基本同实施例1，不同点如表1所示。表1中，对比例3中的“N/A”表示未进行芯片活化步骤，对比例4中的“N/A”表示未进行芯片成膜步骤。

表1 各实施例与各对比例中工艺步骤和参数的设置

	芯片活化步骤中介质选择	APTES浓度（%）
			实施例1	压缩空气	10
实施例2	压缩空气	5
			实施例3	压缩空气	1
实施例4	压缩空气	15
			对比例1	氮气	10
对比例2	氧气	10
			对比例3	N/A	10
对比例4	压缩空气	N/A

实验一

对于实施例1-实施例4以及对比例1-对比例3，每个实施例和每个对比例中，选取成品芯片20片，在每片芯片的特定阻抗扫描频率下，计算每片芯片包被后扫描获得的电容值与包被前扫描获得的电容值的变化率，继而计算得到每个实施例和对比例中，芯片的电容变化率的平均值和标准差，计算得到每个实施例和对比例的芯片包被批内差变异系数CV，芯片包被批内差变异系数CV的计算公式为：变异系数（CV）＝（标准差SD/平均值X）100％。各实施例和各对比例中，芯片包被批内差变异系数如表2所示。

表2 各实施例和各对比例的芯片包被批内差变异系数

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4
									芯片包被批内差变异系数CV（%）	11.2	12.4	13.0	17.5	27.4	22.3	32.8	58.4

由表2可知，实施例1的芯片包被批内差变异系数CV仅为11.2%，与对比例4的芯片包被批内差变异系数相比，可知，在芯片上形成APTES膜明显有助于包被分子稳定地固定在芯片上，且包被分子不易脱落，从而使得同一批次生产的成品芯片上固定的包被分子量更趋于相同，保证同一批次生产的成品芯片的质量的稳定性。

将实施例1与对比例3的芯片包被批内差变异系数相比，可知，未进行芯片活化步骤而制得的成品芯片，即使是同一批次内生产的，其上固定的包被分子量差异较大，导致同一批次生产的成品芯片的质量不稳定。

将实施例1至实施例4与对比例1、对比例2相比，实施例1至实施例4的芯片包被批内差变异系数均小于对比例1和对比例2，这说明，在芯片活化步骤中，对于清洗介质的选择，将会影响后续的芯片加工步骤。本发明中，选择空气作为清洗介质时，能够有效减小芯片包被批内差，提高成品芯片的质量的稳定性。

而将实施例1至实施例4作内部比较，不难发现，芯片成膜步骤中，APTES的浓度也会对芯片包被批内差变异系数造成影响，经实验发现，APTES的浓度在1～10wt%范围内时，芯片包被批内差变异系数在11.2～13.0%范围内，芯片包被批内差变异系数较小，成品芯片的质量的稳定性较好。

综上所述，本发明中，使用空气作为等离子清洗的清洗介质，并在芯片上形成APTES膜，且将芯片成膜步骤中的APTES的浓度限制在1～10wt%范围内，减小芯片包被批内差变异系数，使得同批批次内生产的成品芯片上固定的包被分子量更趋于相同，提高同一批次内成品芯片的质量的稳定性。

实验二

实施例5-实施例10以及对比例5-对比例8基本同实施例1，不同点在于“5）芯片包被步骤”以及“6）封闭与干燥”中选择的缓冲液不同，具体不同点见表3。并且，将实施例5-实施例10以及对比例5-对比例8中制备的成品芯片置于干燥密封袋中（每个实施例和对比例中均使用10片成品芯片，均独自包装于干燥密封袋中），每日使用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面（主要是电极片），判断电极片是否出现腐蚀现象，如果出现，记载该现象出现的日期，并统计抗腐蚀时长，结果见表3。

表3 抗腐蚀时长测试结果（mean±SD，N=10）

	测试缓冲液类型	测试缓冲液配制方法	抗锈蚀时长（天）
				实施例1	BBS	参见实施例1	67.20±3.91
实施例5	BBS	在0.05M硼酸溶液中加入0.0125M四硼酸钠溶液，直至pH值为5.0	63.10±3.60
				实施例6	BBS	在0.2M硼酸溶液中加入0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为8.0	62.90±3.70
实施例7	BBS	在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为9	N/A
				实施例8	BBS	在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为4	N/A
实施例9	BBS	在0.3M硼酸溶液中加入0.1M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4	55.20±2.70*
				实施例10	BBS	在0.02M硼酸溶液中加入0.005M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4	52.70±3.13*
对比例5	PBS	参见PBS配方（pH7.4）	N/A
				对比例6	碳酸缓冲液	在0.1M碳酸氢钠溶液中滴加0.1M碳酸钠溶液，直至pH值为9.0。	N/A
对比例7	硼酸溶液	0.1M硼酸溶液	N/A
				对比例8	四硼酸钠溶液	0.025M四硼酸钠溶液	N/A

1L表3中的PBS（pH7.4）的配制方法：磷酸二氢钾0.24g；磷酸氢二钠1.44g；氯化钠8g；氯化钾0.2g；加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。

表3中，*表示该实验组与实施例1的数据相比具有显著差异（T检验，p＜0.05）。N/A表示在芯片加工过程中电极片已经大量发生腐蚀（通过镜检发现），属于不合格芯片，使用实施例7、实施例8和对比例5至对比例8的缓冲液（溶液），不能有效获得合格的成品芯片。

由表3可知，采用本方案的硼酸缓冲液制备的成品芯片，可获得较长的保质期，但是如果硼酸缓冲液中的硼酸或者四硼酸钠的浓度过高或者过低，缓冲液的pH值过高或者过低，都不利于抗氧化膜的形成，获得的成品芯片的抗腐蚀效果差。如果换用其他缓冲液或者是单用硼酸溶液或者是单用四硼酸钠溶液，均不能获得理想的抗腐蚀效果。

实验三

将未固定包被分子的芯片（即实施例中“1）预处理步骤”中获得的芯片）置于测试缓冲液中（浸泡），每日使用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面（主要是电极片），判断电极片是否出现腐蚀的现象，如果出现，记载该现象出现的日期，并统计抗锈蚀时长（每组实验使用一片未经过本发明加工的芯片），实验结果如表4所示。

表4 抗腐蚀时长测试结果

编号	测试缓冲液	测试缓冲液配制方法	锈蚀时间
				1	BBS	参见实施例1	3天
2	BBS	在0.05M硼酸溶液中加入0.0125M四硼酸钠溶液，直至pH值为5.0	3天
				3	BBS	在0.2M硼酸溶液中加入0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为8.0	3天
4	BBS	在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为9	1天
				5	BBS	在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为4	1天
6	BBS	在0.3M硼酸溶液中加入0.1M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4	1天
				7	BBS	在0.02M硼酸溶液中加入0.005M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4	1天
8	PBS	参见PBS配方（pH7.4）	1天
				9	碳酸缓冲液	在0.1M碳酸氢钠溶液中滴加0.1M碳酸钠溶液，直至pH值为9.0	1天

由表4可知，采用本发明的硼酸缓冲液，对电极片均有较好的抗腐蚀作用。缓冲液的pH值过高或者过低，都不利于抗氧化膜的形成，使得电极片的抗腐蚀效果差。如果换用其他缓冲液，均不能获得理想的抗腐蚀效果。

实验四

采用实施例1的芯片加工方法制备芯片100片，并选取其中20片芯片进行合格率检测（表5中的编号1）。为了测试质控表征方法的效果，在本实验例中设置了对比实验，具体设置情况如下：编号2在实施例1的基础上，对电容变化率的限定范围调整为-50～50%，超出该范围的芯片需要舍弃；编号3在实施例1的基础上，对电容变化率的限定范围调整为80～150%，超出该范围的芯片需要舍弃；编号4在实施例1的基础上，对电容变化率的限定范围调整为-50～150%，超出该范围的芯片需要舍弃；编号5在实施例1的基础上，去掉了镜检质控的过程；编号6在实施例1的基础上，去掉了阻抗检测质控的过程；编号7在实施例1的基础上，去掉了镜检质控和阻抗检测质控的过程；编号8-10在实施例1的基础上，对电容变化率的限定范围进行了调整，超出表格中所示范围的芯片需要舍弃；编号11和12在实施例1的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对阻抗变化率的控制，并限定了具体的阻抗变化率范围；编号13和14在实施例1的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对相位变化率的控制，并限定了具体的相位变化率范围；编号15和16在实施例1的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对电阻分量变化率的控制，并限定了具体的电阻分量变化率范围；编号17和18在实施例1的基础上，将阻抗检测质控中对电容变化率的控制变成了对电感分量变化率的控制，并限定了具体的电感分量变化率范围。

检测的标准样品为布鲁氏病血清企业标准参考品（每份标准参考品用量10μl，包括10份布病抗体阳性血清参考品，10份布病阴性血清参考品）。其中，10片芯片用于检测10份抗体阳性血清参考品，10片芯片用于检测10份抗体阳性血清参考品。10份布病抗体阳性血清参考品的抗体效价为200000IU。检测后统计合格率，标准参考品的检测的方法如下：

在芯片上加入标准样品后，用阻抗仪对芯片施加交流电并同时检测电极片的电容变化。在固定频率下，用固定电压进行60s的连续测量。同时计算这60s电容的平均变化率，即为检测结果。分别检测10份企业阴性参考品和10份企业阳性参考品，对照检测结果和阈值判定芯片是否合格。检测阈值设定为20，检测结果的数值大于20为阴性，检测结果的数值小于20为阳性。10份阳性质控品的检测结果应该全部小于20，10份阴性质控品的检测结果应该全部大于20，不符合上述，则判定为该芯片不合格。合格率计算方法为：合格率=合格的芯片数量/20×100%。实验结果参见表5。

表5：质控方式对于合格率的影响

编号	质控方式	特征参数	特征参数变化率	合格芯片数量	合格率
						1	阻抗检测质控+镜检质控	电容	60～100%	20	100.0%
2	阻抗检测质控+镜检质控	电容	-50～50%	20	100.0%
						3	阻抗检测质控+镜检质控	电容	80～150%	19	95.0%
4	阻抗检测质控+镜检质控	电容	-50～150%	18	90.0%
						5	阻抗检测质控	电容	60～100%	15	75.0%
6	镜检质控	N/A	N/A	13	65.0%
						7	N/A	N/A	N/A	8	40.0%
8	阻抗检测质控+镜检质控	电容	-100～200%	15	75.0%
						9	阻抗检测质控+镜检质控	电容	100～250%	15	75.0%
10	阻抗检测质控+镜检质控	电容	-150～50%	16	80.0%
						11	阻抗检测质控+镜检质控	阻抗	-100～100%	20	100.0%
12	阻抗检测质控+镜检质控	阻抗	-150～150%	16	80.0%
						13	阻抗检测质控+镜检质控	相位	-30～30%	20	100.0%
14	阻抗检测质控+镜检质控	相位	-50～50%	17	85.0%
						15	阻抗检测质控+镜检质控	电阻分量	-40～40%	20	100.0%
16	阻抗检测质控+镜检质控	电阻分量	-60～60%	17	85.0%
						17	阻抗检测质控+镜检质控	电感分量	-200～200%	20	100.0%
18	阻抗检测质控+镜检质控	电感分量	-300～300%	17	85.0%

根据表5的结果可知，采用阻抗检测质控和镜检质控的双重质控方式，并将电容变化率控制在-50～150%，可以获得较为理想的成品芯片合格率。而采用单一的质检方式或者不质检（参见编号6和7的实验数据），会导致最后的成品芯片的合格率降低。在阻抗检测质控过程中，在特定频率下的电容变化率是否维持在一定范围内对于合格率的提升非常关键。如果电容变化率不在-50～150%内（参见编号8-10的实验数据），则成品芯片的合格率大幅下降。使用阻抗变化率、相位变化率、电阻分量变化率和电感分量变化率来对芯片进行表征，并选取符合范围要求的芯片，舍弃超范围芯片，均可以获得理想的合格率（参见编号11-18的实验数据。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (7)

1.一种用于快速检测的芯片的加工方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、芯片活化步骤：使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗，获得活化后的芯片；

S2、芯片成膜步骤：在活化后的芯片上覆盖APTES膜；

S3、芯片交联步骤：醛基化修饰所述APTES膜；

S4、芯片包被步骤：将包被分子固定在醛基化修饰的APTES膜上，所述包被分子为抗原或者抗体；

S5、封闭与干燥步骤：将芯片上的非特异性位点封闭；

所述芯片包括检测板，检测板上铺设有电极片，所述电极片经等离子处理后覆盖有APTES膜；所述电极片的材质为铝；

在S1中，等离子清洗的真空度为0.3～0.5mbar，功率为50～200w，清洗时长为5～15min；

在芯片包被步骤中，使用硼酸缓冲液作为溶剂配制包被分子溶液；

所述硼酸缓冲液的配制方法为：在0.05～0.2M的硼酸溶液中加入0.0125～0.05M的四硼酸钠溶液，直至pH值为5～8；

芯片包被步骤包括阻抗检测质控：固定有包被分子的电极片相对于未固定包被分子的电极片，在特定阻抗扫描频率下，电容变化率为-50～150%，或者阻抗变化率为-100～100%，或者相位变化率为-30～30%，或者电阻分量变化率为-40～40%，或者电感分量变化率为-200～200%。

2.根据权利要求1所述的用于快速检测的芯片的加工方法，其特征在于：在阻抗检测质控步骤中，特定阻抗扫描频率为100Hz～1MHz，电压为1mV～100mV。

3.根据权利要求2所述的用于快速检测的芯片的加工方法，其特征在于：在芯片成膜步骤中，将活化后的芯片浸泡至1～10wt%APTES的乙醇溶液中，获得覆盖有APTES膜的芯片。

4.根据权利要求3所述的用于快速检测的芯片的加工方法，其特征在于：在芯片交联步骤中，将成膜后的芯片加热固化，冷却后滴加1～10wt%戊二醛纯水溶液，获得交联后的芯片。

5.根据权利要求4所述的用于快速检测的芯片的加工方法，其特征在于：在芯片包被步骤中，在交联后的芯片上滴加所述包被分子溶液，于18～25℃孵育2～24h，得到包被后的芯片。

6.根据权利要求5所述的用于快速检测的芯片的加工方法，其特征在于：还包括镜检质控步骤：在金相显微镜下视检电极片，舍弃不合格芯片，不合格芯片的判断标准为：电极片存在断条或者连条，或电极片的叉指部位存在粒径或者长度大于0.5μm的异物。

7.一种用于快速检测的芯片，所述芯片包括检测板，检测板上铺设有电极片，其特征在于：所述电极片采用权利要求1的方法加工而成。