CN111380933B - 一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器及其检测方法 - Google Patents

一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器及其检测方法。本发明以十一巯基十一烷酸/β‑巯基乙醇混合自组装膜修饰金电极，用于固载BmNPV多角体蛋白抗体，利用抗原和抗体的特异性结合，完成对BmNPV多角体蛋白的捕获，基于混合自组装膜的电催化作用实现家蚕核型多角体病毒的超灵敏检测。本检测方法具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，线性范围为0.0001‑100ng/mL，检出限为14.54fg/mL，适宜于家蚕核型多角体病的早期快速诊断和预防。

Description

一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器及其检测 方法
技术领域
本发明涉及一种电化学免疫传感器，特别是涉及一种基于混合自组装膜的电化学免疫传感器，属于病毒疫病诊断技术领域。
背景技术
家蚕核型多角体病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)、杆状病毒属(Baculovirus)、蚕核型多角体病毒种(Bombyx moriNuclear Polyhedrosis Virus)，简称BmNPV，因侵入寄生在蚕血球、脂肪真皮、气管等细胞核，形成病毒多角体而得名。其多角体是一种内部包被有长杆状病毒粒子的蛋白质结晶，大小一般在2-6μm之间，平均3.2μm，可在光学显微镜下观察。多角体蛋白Polh作为多角体结晶基质的主要蛋白，是一种杆状病毒的高效表达蛋白质，感染后期在细胞中的累积可高达30％～50％。由BmNPV引起的家蚕核型多角体病是蚕业生产中危害最为严重的病害，该病传染性极强，难以控制。每年全国蚕桑生产因蚕病的损失占到总产量的30％，其中70％是由核型多角体病毒引起的。目前尚无有效的治疗方法，在感染发生初期及早检测出感染病原的个体，及时采取有效的防控措施，防止二次感染，是防止群体内蚕病大流行或避免蚕病爆发造成经济损失的有效途径。
目前，家蚕核型多角体病的检测方法主要包括症状观察、显微镜检、血清学方法和分子生物学技术。常规的症状观察、显微镜检和血清学方法主要依靠经验，对病毒的需要量大，检测周期长，难以对病毒潜伏期及早期病毒感染进行诊断，无法达到对蚕病早发现、早预防和及时切断病原传播以及二次感染途径的目的。分子生物学诊断技术虽然具有较高的特异性和灵敏性，但对检测设备和操作人员的要求较高，操作繁琐，检测成本相对较高，不适于在生产中推广应用。因此急需研究建立一种快速、特异、简便的高灵敏BmNPV检测技术。
电化学免疫传感器是一种结合免疫分析和电化学传感技术的新型生物传感器，具有特异性好，灵敏度高，检测时间短，可追踪和痕量检测免疫原等优点，近年来被广泛应用于临床医学与生物监测、食品工业、环境监测与处理等领域。
发明内容
针对上述现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器。本发明的电化学免疫传感器可以实现对家蚕核型多角体病毒的快速、灵敏和特异性检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器，包括：工作电极、参比电极和辅助电极；
所述工作电极按如下方法制备：
(1)将预处理后的金电极浸入十一巯基十一烷酸/β-巯基乙醇混合溶液中，在金电极表面形成混合自组装膜，得到MUA/ME/Au；
(2)将所述MUA/ME/Au浸入EDC-NHS混合溶液中反应，得到表面羧基活化的MUA/ME/Au；
(3)将所述表面羧基活化的MUA/ME/Au与BmNPV多角体蛋白抗体结合，得到抗体修饰的MUA/ME/Au；
(4)将所述抗体修饰的MUA/ME/Au用BSA封闭非特异性活性位点，即制备得到工作电极。
优选的，金电极预处理的方法为：将金电极放入新配制的piranha溶液中浸泡10-15min，取出电极用超纯水冲洗，吹干，在抛光布上，用氧化铝粉将电极抛光至镜面后，用双蒸水清洗电极表面污物，再依次用超纯水、无水乙醇和超纯水进行超声洗涤，在0.5mol/L的硫酸中，-0.2-1.5V范围内对电极进行扫描，共循环扫描二十圈，然后用超纯水淋洗，干燥。
更优选的，所述piranha溶液是由浓硫酸和30％的双氧水按体积比3:1配制而成。
优选的，所述十一巯基十一烷酸/β-巯基乙醇混合溶液是由8mmol/L的十一巯基十一烷酸和8mmol/L的β-巯基乙醇按体积比8:2混合而成。
十一巯基十一烷酸/β-巯基乙醇混合溶液是为了在金电极表面形成自组装膜，以实现固载抗体。混合溶液中长链巯基化合物(十一巯基十一烷酸)与短链巯基化合物(β-巯基乙醇)的比例会影响所形成的自组装膜的结构以及抗体的固载效果，研究发现，将8mmol/L的十一巯基十一烷酸和8mmol/L的β-巯基乙醇按体积比8:2混合，可形成凹凸不平的岛状结构，使得固定的抗体具有良好的空间分布和定向性，减小抗体之间较大的空间位阻，显著增加抗体固载量。
优选的，在金电极表面形成混合自组装膜的条件为：室温条件下组装24h。
优选的，所述EDC-NHS混合溶液是由0.1mol/L的EDC和0.02mol/L的NHS混合而成。
本发明利用特定组成EDC-NHS混合溶液对MUA/ME/Au进行表面羧基活化处理，可以形成活性酯中间体，从而更加有效的固定抗体。
优选的，所述参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极。
本发明的第二方面，提供上述电化学免疫传感器在制备检测家蚕核型多角体病毒的产品中的应用。
本发明的第三方面，提供利用上述电化学免疫传感器检测家蚕核型多角体病毒的方法，包括如下步骤：
(1)使用电化学工作站在10mmol/L[Fe(CN)6]4/3-+0.1mol/L KCl的PBS(pH 7.4)溶液中，100mHz至100kHz的频率范围内以10mV的扰动幅度测定电化学免疫传感器的工作电极的阻抗值；
(2)将系列不同浓度的BmNPV多角体蛋白抗原溶液滴加在电化学免疫传感器的工作电极表面，孵育，PBS清洗后晾干，分别测定工作电极的电化学阻抗值，根据步骤(1)和步骤(2)所测得的电化学阻抗值的变化绘制标准工作曲线；
(3)将电化学传感器的工作电极与待测样品进行孵育，测定电化学阻抗谱，根据所述标准工作曲线确定待测样品中家蚕核型多角体病毒的浓度。
优选的，步骤(2)和步骤(3)中，所述孵育均为：37℃条件下孵育30min。
本发明的有益效果：
(1)本发明将十一巯基十一烷酸/β-巯基乙醇/金电极(MUA/ME/Au)混合自组装膜引入到电化学免疫传感器的制备中，增加了检测抗原的固载量，进而提高了电化学免疫传感器的灵敏度和生物相容性。
(2)本发明制备的电化学免疫传感器由于其基底材料的制备过程简单、方便和电化学性质稳定，抗体与基底材料结合牢固。虽然在酸性条件下，抗体与抗原解离，而抗体与基底材料的结合不受太大影响，因此具有优良的稳定性、重现性和再生性。
(3)本发明所构建的电化学免疫传感器易保存，可在4℃冰箱中放置一个月左右，有利于基层实验室和养殖户随时开展检测工作，实用性更强。
(4)本方法制备的电化学免疫传感器由于利用抗体抗原之间的特异性结合，具有良好的特异性，其制备过程简单、检测步骤较少，检测速度较快，便于实现大量推广。
(5)本发明对于BmNPV的快速诊断耗时短，单个样品仅需30分钟即可完成，比常规PCR节约2-3个小时。
(6)本发明的检测方法具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，线性范围为0.0001-100ng/mL，检出限为14.54fg/ml，适宜于家蚕核型多角体病的早期快速诊断和预防。
附图说明
图1：电化学免疫传感器在不同组装过程的阻抗图谱；其中，a为裸金电极，b为MUA/ME修饰后的金电极，c为NHS/EDC活化后MUA/ME/Au，d为抗体修饰的MUA/ME/Au，e为BSA封闭后得到的工作电极，f为结合抗原后的工作电极。
图2：本发明的电化学免疫传感器在检测家蚕核型多角体病毒时得到的阻抗值差值与浓度对数的线性关系。
图3：电化学免疫传感器检测家蚕核型多角体病毒的特异性测试结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明中所提及的“室温”是指温度为15-30℃。
正如背景技术部分所介绍的，目前对于家蚕核型多角体病的检测方法存在病毒需要量大、检测周期长、检测成本高、不适合在生产中推广应用等缺点。
基于此，本发明开发了一种检测家蚕核型多角体病毒BmNPV的电化学免疫传感器。本发明的电化学免疫传感器是以十一巯基十一烷酸/β-巯基乙醇(MUA/ME)混合自组装膜修饰金电极(Au)，用于固载BmNPV多角体蛋白抗体，利用抗原和抗体的特异性结合，完成对核型多角体病毒抗原的捕获，基于混合自组装膜的电催化作用实现了对家蚕核型多角体病毒的超灵敏检测。
目前虽然有基于自组装膜制备电化学免疫传感器的报道。但是，本发明在开发检测家蚕核型多角体病毒BmNPV的电化学免疫传感器的过程中发现：单组分自组装膜固定抗体时，会因反应界面功能基团的密度过大产生较大的空间位阻，导致固定抗体的效率下降，且容易引起较大的非特异性吸附。为有效的固定BmNPV多角体蛋白抗体，本发明首次采用MUA/ME在金电极上形成混合自组装膜以固载抗体，本发明通过适当比例的长链巯基化合物与短链巯基化合物混合可形成凹凸不平的岛状结构，使得固定的抗体具有良好的空间分布和定向性，减小抗体之间较大的空间位阻，增加抗体固载量；本发明中制备的MUA/ME混合自组装膜相较其他共混膜固定BmNPV多角体蛋白抗体的效果最好，检测灵敏度最高，且制备方法简单，材料成本低。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
电化学工作站，购自上海辰华有限公司；使用常规的三电极电化学池进行电化学测量，修饰的金电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为辅助电极。
BmNPV多角体蛋白可通过基因工程方法获得，或者患病家蚕蚕体组织以及病死蚕尸体分离制备获得；BmNPV多角体蛋白抗体可通过将多角体蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔获得。本实施例中的家蚕核型多角体病毒由山东农业大学提供；BmNPV多角体蛋白抗体由西南大学提供。
实施例1：检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器的制备
该电化学免疫传感器包括：工作电极、参比电极和辅助电极；其中，所述参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极；
所述工作电极按如下方法制备：
1.金电极预处理：
将金电极(d＝2mm)放入新配制的piranha溶液(浓H2SO4和30％(质量比)的双氧水体积比是3:1)中浸泡10min，取出电极用超纯水冲洗3次，洗耳球吹干，在抛光布上，先后用直径为0.3和0.05μm的氧化铝粉将电极抛光至镜面后，取适量双蒸水，清洗电极表面污物，再依次用超纯水、无水乙醇和超纯水进行超声洗涤，每次3min，在0.5mol/L的硫酸中，-0.2-1.5V范围内对电极进行扫描，共循环扫描二十圈，然后用超纯水淋洗，洗耳球吹干待用。
2.混合自组装膜的构建：
将预处理过的金电极放入8mmol/L MUA与8mmol/L ME(VMUA：VME＝8:2)的混合溶液中，室温条件下进行组装24h，在金电极表面形成混合自组装膜，标记为MUA/ME/Au，最后电化学阻抗进行表征。
3.电极表面羧基活化：
将MUA/ME/Au取出，进行清洗，并置入10mL EDC/NHS(0.1mol/L的EDC和0.02mol/L的NHS)的混合溶液中进行电极表面羧基活化，PBS清洗，洗耳球吹干。
4.修饰抗体：
滴加20μL稀释2000倍的BmNPV多角体蛋白抗体于表面羧基活化处理后的电极上，并在4℃下组装过夜，将电极表面未结合或结合不牢固的抗体用双蒸水清洗并晾干。
5.BSA封闭非特异性结合位点：
滴加20μL 1％的BSA溶液于修饰抗体后的电极上，在室温下放置1h，使得抗体上的非特异性结合位点被封闭，用PBS清洗电极表面，放在特定位置晾干。即制备得到工作电极。
工作电极在表面修饰的过程中分别采用电化学阻抗进行表征，将不同修饰过程电极均置于10mmol/L[Fe(CN)6]4/3-+0.1mol/L KCl的PBS溶液(pH 7.4)中，100mHz至100kHz的频率范围内以10mV的扰动幅度测定所制备工作电极的阻抗图谱；同时，在最终制备的工作电极表面滴加20μL 0.5ug/mL的多角体蛋白溶液，37℃孵育30min，PBS清洗后晾干，测定其阻抗图谱。结果见图1。
实施例2：利用电化学免疫传感器检测BmNPV
具体步骤如下：
(1)使用电化学工作站在10mmol/L[Fe(CN)6]4/3-+0.1mol/L KCl的PBS(pH 7.4)溶液中，100mHz至100kHz的频率范围内以10mV的扰动幅度测定实施例1所制备的工作电极的阻抗值。
(2)将一系列不同浓度的BmNPV多角体蛋白抗原溶液滴加在实施例1制备的工作电极表面，37℃孵育30min，PBS清洗后晾干，分别测定电化学阻抗谱，根据步骤(1)与步骤(2)中所测得的电化学阻抗值的变化绘制标准工作曲线。
(3)将待测样品滴加到实施例1制备的工作电极表面，37℃孵育30min，测定电化学阻抗谱，根据所述标准工作曲线确定待测样品中病原的浓度。
实施例3：电化学免疫传感器的灵敏度检测
在实施例1构建成功的电化学免疫传感器的工作电极上分别滴加20μL浓度为0.0001ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、100ng/mL的BmNPV多角体蛋白溶液，37℃孵育30min，PBS清洗后晾干。将结合抗原前后的电极均置于10mmol/L[Fe(CN)6]4/3-+0.1mol/L KCl的PBS溶液(pH 7.4)中，100mHz至100kHz的频率范围内以10mV的扰动幅度测定所制备工作电极的阻抗值，根据所得阻抗值差值与BmNPV抗原浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；测定结果表明BmNPV抗原浓度在0.0001-100ng/mL线性范围内，检出限为：14.54fg/ml(S/N＝3)，线性相关系数平方(R2)为0.9922(图2)。
实施例4：电化学免疫传感器的特异性检测
在实施例1构建成功的电化学免疫传感器的工作电极上分别滴加20μL正常蚕血(Normal silkworm blood)、PBS、球孢白僵菌蛋白(Beauveria bassiana)、苏云金芽孢杆菌蛋白(Bacillus thuringiensi，Bt)、家蚕质型多角体病毒蛋白(BmCPV)、正常蚕血与BmNPV多角体蛋白混合溶液(Normal silkworm blood+BmNPV)以及BmNPV多角体蛋白(BmNPV)，采用交流阻抗测定，结果表明干扰物质的阻抗值变化值远远低于BmNPV相应值，说明传感器的特异性好，抗干扰能力强(图3)。
实施例5：电化学免疫传感器的重复性检测
将本发明的5个电化学免疫传感器用于检测同一浓度BmNPV，其相对标准偏差为1.623％，表明此传感器有良好的重现性。
实施例6：电化学免疫传感器的再生性
将本发明用于检测同一浓度BmNPV后，放入0.2mol/L甘氨酸+0.2mol/L HCL(pH＝2.4)解离液中润洗30min后取出，用超纯水小心冲洗之后重复上述步骤，结果表明该免疫传感器可重复5次，表明此传感器由于材料的稳定、抗体与材料的牢固结合具有良好的再生性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器，其特征在于，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、参比电极和辅助电极；其中，所述参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极；
所述工作电极按如下方法制备：
（1）金电极预处理：
将d=2mm的金电极放入新配制的piranha溶液中浸泡10min，所述piranha溶液是由浓H2SO4和质量比30%的双氧水按体积比3:1配制而成；取出电极用超纯水冲洗3次，洗耳球吹干，在抛光布上，先后用直径为0.3和0.05 μm的氧化铝粉将电极抛光至镜面后，取适量双蒸水，清洗电极表面污物，再依次用超纯水、无水乙醇和超纯水进行超声洗涤，每次3min，在0.5mol/L的硫酸中，-0.2-1.5V范围内对电极进行扫描，共循环扫描二十圈，然后用超纯水淋洗，洗耳球吹干待用；
（2）混合自组装膜的构建：
将预处理过的金电极放入 8mmol/L MUA与8mmol/L ME按体积比8:2混合的混合溶液中，室温条件下进行组装24h，在金电极表面形成混合自组装膜，标记为MUA/ME/Au，最后电化学阻抗进行表征；
（3）电极表面羧基活化：
将MUA/ME/Au取出，进行清洗，并置入10mL EDC/NHS的混合溶液中进行电极表面羧基活化，所述混合溶液中含有0.1 mol/L的EDC和0.02 mol/L的NHS；PBS清洗，洗耳球吹干；
（4）修饰抗体：
滴加 20 μL 稀释2000倍的BmNPV多角体蛋白抗体于表面羧基活化处理后的电极上，并在4℃下组装过夜，将电极表面未结合或结合不牢固的抗体用双蒸水清洗并晾干；
（5）BSA封闭非特异性结合位点：
滴加20μL 1%的BSA溶液于修饰抗体后的电极上，在室温下放置1h，使得抗体上的非特异性结合位点被封闭，用PBS清洗电极表面，晾干；即制备得到工作电极。
2.权利要求1所述的电化学免疫传感器在制备检测家蚕核型多角体病毒的产品中的应用。
3.利用权利要求1所述的电化学免疫传感器检测家蚕核型多角体病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）使用电化学工作站在10mmol/L [Fe(CN)6]4/3- + 0.1 mol/L KCl的PBS溶液中，PBS溶液的pH 7.4；100mHz至100kHz的频率范围内以10mV的扰动幅度测定权利要求1的工作电极的阻抗值；
（2）将一系列不同浓度的BmNPV多角体蛋白抗原溶液滴加在权利要求1的工作电极表面，37℃孵育30min，PBS清洗后晾干，分别测定电化学阻抗谱，根据步骤（1）与步骤（2）中所测得的电化学阻抗值的变化绘制标准工作曲线；
（3）将待测样品滴加到权利要求1的工作电极表面，37℃孵育30min，测定电化学阻抗谱，根据所述标准工作曲线确定待测样品中病原的浓度。
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