CN115144448B - 基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器、制备方法及应用 - Google Patents
基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器、制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器、制备方法及应用，该方法所制备的基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器的灵敏度远高于平面电极；检测下限低，在血清中的检测下限可达0.38fg/mL；检测范围宽,可在10fg/mL到1000ng/mL范围内保持良好的对数线性；采用空气等离子体处理，消除了热缩器件本身的疏水性，器件的一致性好；制备工艺简单且具备良好的重复性；传感器寿命可达25天。
Description
技术领域
本发明属于医学体外诊断技术领域，涉及电化学式生物检测领域，尤其涉及基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器、制备方法及应用。
背景技术
前列腺癌(PCa)已成为全世界男性第二高发癌症。前列腺癌早期诊断可以有效指导治疗方案提高患者的存活概率。随着前列腺癌特异性抗原(PSA)检测的临床引入，前列腺癌的死亡率大大下降。健康男性血清中的总PSA浓度一般低于4ng/mL。早期前列腺癌患者血清中PSA浓度常高于10ng/mL。因此检测前列腺癌特异性抗原至关重要。
迄今为止，临床上检测PSA的方法主要基于化学发光法及酶联免疫反应。这些传统方法价格昂贵，操作复杂，依赖于大型设备及有经验的操作人员。这些特点使得PSA检测只能在专业的实验室里，增加了治疗费用及时间。近年来，一种名为点护理(POC)检测方式吸引了业界的广泛关注。这种检测方式无需复杂的检测条件，可直接由小型实验室或病人自己居家检测。在众多检测方案中，电化学检测原理因其操作简单，易小型化，成本低等优点，被认为是最有希望实现POC检测方案。当待测抗原与电化学传感器表面修饰的抗体特异性结合后，导致传感器表面空间位阻增加。测量传感器在指示剂溶液中电化学反应电流或阻抗变化即可推算出待测抗原浓度。
然而，传统的电化学工作电极(如玻碳电极等)活性差，传感界面限制在一个平面，比表面积小。这使得传感器的灵敏度较低，检测范围窄。而PSA需要测量的范围较大。对于前列腺癌患者血清前列腺癌特异性抗原浓度可高达100ng/mL。而术后患者血清内PSA浓度极低，高于0.2ng/mL即认为前列腺癌复发。所以一种高灵敏度宽检测范围的PSA传感器亟待所求。提高传感器界面比表面积可有效增加抗原抗体的固定数量，增加传感器的灵敏度及测量范围。利用电极本身独特的结构可以在常规的表面修饰方案的基础上，进一步提升传感器的灵敏度。近年来一种名为热收缩工艺的加工工艺得到了学者们的广泛关注。这种工艺利用热收缩聚合物的收缩特性，减小传感器的尺寸，在传感器表面构建微纳米褶皱，可以显著提高传感器的比表面积。然而这种工艺尚未有电化学式蛋白类相关检测，且在具体应用过程中存在疏水问题，会导致传感界面的不稳定。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题和不足，本发明提供了一种基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器、制备方法及应用。使得所述传感器具有高灵敏度，宽动态范围，高亲水性等优点。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器制备方法，包括步骤如下：
步骤1，制备褶皱电极：在热收缩聚合物基底表面加电极掩膜版，沉积金膜，得到金膜电极；这种电极在加热温度高于热收缩聚合物基底的玻璃化温度后，可稳定收缩至一定的比例。加热过程容易出现收缩不平整和热收缩基底与底面粘连情况，这会导致传感器测试一致性差。在此需要将得到的金膜电极放在平面上并置于加热炉中加热，帮助平整收缩，且不会出现粘连情况，可大大提高传感器的一致性，直至收缩稳定得到热收缩电极及褶皱的表面，该电极尺寸小且具有高比表面积。热缩后的电极易产生疏水作用，在电极使用前需要利用气体等离子体处理热收缩电极表面，以消除褶皱形貌本身的疏水性，得到褶皱电极；该电极具有高亲水性，避免由于疏水作用，待测抗原无法进入褶皱内部而损失灵敏度。
步骤2，制备敏感材料：将步骤1得到的褶皱电极在聚赖氨酸溶液B中孵育，在电极表面修饰氨基，用以固定抗体；去离子水冲洗吹干后，在前列腺癌特异性抗原单克隆抗体溶液中室温孵育，利用聚赖氨酸的氨基与抗体的羧基相结合来固定抗体，孵育完成后，用1倍磷酸盐缓冲液(1x PBS)冲洗吹干，以避免去离子水的酸性环境破坏抗原抗体的结合。然后在牛血清蛋白(BSA)中孵育用以屏蔽血清中非特异性蛋白的结合。孵育完成后用1倍磷酸盐缓冲液冲洗吹干后，即得前列腺癌特异性抗原传感器。
进一步地，步骤1所述热收缩聚合物指的是在加热后可稳定收缩至一定比例的聚合物，包括聚苯乙烯、聚烯烃、聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种。优选热收缩聚合物为聚苯乙烯。
进一步地，步骤1所述沉积金膜方式为真空溅射、蒸镀、丝网印刷中的一种。优选沉积金膜方式为真空溅射。
进一步地，步骤1所述沉积金膜厚度为大于60nm，在此范围内传感器灵敏度才会相比平面电极有所提高，其他范围不会出现这种效果。优选厚度为200nm。
进一步地，步骤1所述加热温度为90～160℃，加热温度越高收缩速度越快。优选加热温度为160℃。
进一步地，步骤1所述平面涂覆聚四氟乙烯涂层。该涂层表面能较大，加热过程不易粘连，可有效提高器件一致性。
进一步地，优选步骤1所述气体等离子体处理，采用空气等离子体处理热收缩电极表面，至起辉后3min。
进一步地，步骤2所述将步骤1得到的褶皱电极先进行石墨烯修饰，再进行聚赖氨酸溶液B中孵育；所述石墨烯修饰具体为：将步骤1得到的褶皱电极在聚赖氨酸溶液A中室温孵育，使其表面带有正电荷的氨基，去离子水冲洗吹干后，在石墨烯溶液中孵育，去离子水冲洗吹干。
进一步地，步骤2所述聚赖氨酸溶液A的浓度范围为0.01～100mg/mL；优选聚赖氨酸溶液A的浓度范围为0.1～10mg/mL；再优选聚赖氨酸溶液A的浓度为1mg/mL。聚赖氨酸溶液B的浓度范围为0.1～10mg/mL。优选聚赖氨酸溶液B的浓度为1mg/mL。
进一步地，步骤2所述石墨烯溶液浓度范围为0.2-5mg/mL。优选石墨烯溶液浓度为2mg/mL，单层石墨烯。
进一步地，步骤2所述前列腺癌特异性抗原单克隆抗体溶液的浓度范围为1～100μg/mL。优选前列腺癌特异性抗原单克隆抗体溶液的浓度为10μg/mL。
进一步地，步骤2所述牛血清蛋白浓度范围为1～80mg/mL。优选牛血清蛋白浓度为30mg/mL。
上述方法制备得到的传感器在检测前列腺癌特异性抗原的应用，包括步骤如下：
步骤1，制备指示剂溶液，溶液成分为5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾及1xPBS的混合溶液；
步骤2，传感器先在指示剂溶液中做差分脉冲伏安法测试，得到初始的峰电流I0；
步骤3，将步骤2的传感器用1xPBS冲洗吹干后，用待测样本在37℃下孵育，再用1xPBS冲洗吹干后，在指示剂溶液测试峰电流I1；
步骤4，根据峰电流变化的绝对值|I0-I1|，对比标准曲线，得到待测血清中的浓度。
本发明的有益效果为，在相同投影面积下，本发明所制备的热收缩电极传感器的灵敏度远高于平面电极；检测下限低，在血清中的检测下限可达0.38fg/mL,；检测范围宽,可在10fg/mL到1000ng/mL范围内保持良好的对数线性；消除了热缩器件本身的疏水性，器件的一致性好；制备工艺简单且具备良好的重复性；传感器寿命可达25天。
附图说明
图1为热收缩电极加工工艺流程图。
图2为实施例3电极表面修饰加工流程图。
图3为实施例1(A)不同厚度热收缩电极与平面电极对前列腺癌特异性抗原响应对比及其(B)灵敏度对比。
图4为实施例2平面电极下不同浓度聚赖氨酸对前列腺癌特异性抗原响应灵敏度对比图。
图5为实施例3结合最优修饰(optimization)及热收缩电极后传感器灵敏度变化。
图6为实施例3优化的修饰条件结合200nm热收缩电极和平面3mm电极在0到8ng/mLPSA的测试效果对比:(A)峰电流变化对比(B)绝对灵敏度和相对灵敏度对比。
图7为实施例3优化的修饰条件结合200nm热收缩电极在胎牛血清环境下测量10fg/mL到1000ng/mLPSA的峰电流数据及线性拟合曲线。
图8为实施例3优化的修饰条件结合200nm热收缩电极传感器在10ng/mL PSA中测试25天峰电流变化。
图9为本发明基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器示意图及检测原理。
具体实施方式
为了使本发明例的目的、技术方案和优点更加清楚，以下将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行完整描述，显然，所描述的实施例只是针对于该方案在某一种条件下的实施案例，并不是所有的实施案例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器制备方法，包括步骤如下：
步骤1，如图1所示，制备褶皱电极：
在热收缩聚合物基底表面粘贴胶带掩膜版作为电极掩膜版，沉积不同厚度的金膜。热收缩聚合物指的是在加热后可稳定收缩至一定比例的聚合物，可选聚苯乙烯、聚烯烃、聚对苯二甲酸乙二醇酯等，本实施例选用聚苯乙烯。沉积金膜方式可选为真空溅射、蒸镀、丝网印刷等，本实施例为真空溅射。沉积金膜的厚度分别为60,100,150,200nm。
将得到的金膜电极在加热炉中加热，加热过程中需要放置在一表面能较大的平面上，加热直至收缩稳定。即加热至电极表面平坦且不再继续收缩为止。本实施例选用的平面表面涂覆聚四氟乙烯涂层。至此即可得到尺寸小及高比表面积的电极。加热炉选普通加热炉，加热温度为90到160℃，加热温度越高收缩速度越快，本实施例的加热温度为160℃，加热时间为3分钟。热缩后的电极易产生疏水作用，在电极使用前需要利用空气等离子体处理表面，起辉后处理3分钟。帮助待测抗原进入褶皱内部。
上述电极初始直径为7.89mm，在160℃收缩3min后，直径可收缩为3mm。
步骤2，根据图2所示，制备传感器敏感材料：
将褶皱电极在聚赖氨酸溶液浓度为0.1mg/mL中孵育时间为5分钟到2小时，本实施例时间为1小时，去离子水冲洗三次吹干后，可在电极表面修饰氨基，用以固定抗体。
在10μg/mL前列腺癌特异性抗原单克隆抗体溶液中室温孵育12小时，利用聚赖氨酸的氨基与抗体的羧基相结合来固定抗体，孵育完成后，用1倍磷酸盐缓冲液(1x PBS)溶液冲洗吹干后。
在30mg/mL牛血清蛋白(BSA)中孵育，孵育时间为5分钟到2小时，本实施例时间为1小时，用以屏蔽血清中非特异性蛋白的结合。孵育完成后用1xPBS冲洗吹干后，即可检测。
具体检测流程如下：
制备指示剂溶液，溶液成分为5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾及1xPBS的混合溶液。传感器先在指示剂溶液中做差分脉冲伏安法测试，得到初始的峰电流I0。1xPBS冲洗吹干后，用待测样品前列腺癌特异性抗原溶液(PSA)在37℃下孵育35分钟。1xPBS冲洗吹干后，在指示剂溶液测试峰电流I1。根据峰电流变化的绝对值(|I0-I1|)，对比标准曲线即可得到待测样本中的浓度。
测试不同电极在0.1ng/mL到100ng/mL的PSA溶液孵育后的电流响应。传感器灵敏度对比如图3所示。可以看出60nm～200nm的热收缩电极的响应灵敏度均高于平面3mm电极。其中200nm电极的响应灵敏度最高。
实施例2
为了评估聚赖氨酸溶液浓度的影响，在平面3mm电极上修饰不同浓度的聚赖氨酸溶液。
具体修饰步骤如下：
平面电极经空气等离子体处理，起辉后3min。
不同浓度聚赖氨酸溶液中孵育1小时，去离子水冲洗三次吹干后；
在10μg/mL前列腺癌特异性抗原单克隆抗体溶液中室温孵育12小时后，用1倍磷酸盐缓冲液(1x PBS)溶液冲洗吹干。
在30mg/mL牛血清蛋白(BSA)中孵育1小时,孵育完成后用1xPBS冲洗吹干后，即可检测。
根据图4所示，发现用0.1mg/mL～10mg/mL的聚赖氨酸溶液固定抗体的电极对PSA均有较好的响应。其中1mg/mL的聚赖氨酸溶液修饰的电极灵敏度最高。故选用1mg/mL的聚赖氨酸溶液作为最佳固定抗体浓度。将其应用于热收缩电极上效果一样显著，如下实施例3所述。
实施例3
基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器制备方法，包括步骤如下：
步骤1，制备褶皱电极：
在热收缩聚合物基体粘贴胶带掩膜版，表面沉积200nm厚度的金膜。热收缩聚合物选用聚苯乙烯。沉积金膜方式为真空溅射。将得到的金膜电极在加热炉中加热，加热过程中放置在表面涂覆聚四氟乙烯涂层的平面上，加热直至收缩稳定。加热炉选普通加热炉，加热温度为160℃，加热时间为3分钟。利用空气等离子体处理表面，起辉后处理3分钟。
上述电极初始直径为7.89mm，在160℃收缩3min后，直径可收缩为3mm。
步骤2，制备传感器敏感材料：
将褶皱电极在浓度为1mg/mL的聚赖氨酸溶液中室温孵育5分钟，去离子水冲洗三次吹干后，使其表面带有正电荷的氨基，用以固定石墨烯；
在石墨烯溶液浓度为2mg/mL中孵育5分钟，去离子水冲洗三次吹干后，修饰石墨烯，进一步提高传感器的比表面积。石墨烯为单层石墨烯。
在聚赖氨酸溶液浓度为1mg/mL中孵育时间为1小时，去离子水冲洗三次吹干后，可在电极表面修饰氨基，用以固定抗体。
在10μg/mL前列腺癌特异性抗原单克隆抗体溶液中室温孵育12小时，利用聚赖氨酸的氨基与抗体的羧基相结合来固定抗体，孵育完成后，用1倍磷酸盐缓冲液(1x PBS)溶液冲洗吹干后。
在30mg/mL牛血清蛋白(BSA)中孵育，本实施例时间为1小时，用以屏蔽血清中非特异性蛋白的结合。孵育完成后用1xPBS冲洗吹干后，即可检测。
具体检测流程如下：
制备指示剂溶液，溶液成分为5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾及1xPBS的混合溶液。传感器先在指示剂溶液中做差分脉冲伏安法测试，得到初始的峰电流I0。1xPBS冲洗吹干后，用待测样品前列腺癌特异性抗原溶液(PSA)在37℃下孵育35分钟。1xPBS冲洗吹干后，在指示剂溶液测试峰电流I1。根据峰电流变化的绝对值(|I0-I1|)，对比标准曲线即可得到待测样本中的浓度。
如图5所示，在同样的平面3mm电极的条件下，利用优化的修饰条件(Planar-3mmwith optimization)制备的电极，其灵敏度明显高于未优化的电极(Planar-3mm withoutoptimization)。而进一步结合200nm热缩电极后(shrink 200nm with optimization)，传感器的灵敏度可以进一步提升。所述优化的修饰条件为空气等离子体处理3min，石墨烯修饰1层，1mg/mL PLL溶液来固定抗体，10μg/mL前列腺癌特异性抗原单克隆抗体溶液中室温孵育12小时，30mg/mL牛血清蛋白(BSA)中孵育1小时。
如图6所示，所制备的200nm热缩电极(shrink 200nm with optimization)传感器，相对灵敏度和绝对灵敏度显著高于平面金电极。
如图7所示，所制备的200nm热缩电极(shrink 200nm with optimization)传感器可在胎牛血清中检测10fg/mL至1000ng/mL的PSA，检测下限可达0.38fg/mL,展现出超高的灵敏度。常规电化学电极如玻碳电极，碳电极等，均难以达到此指标。此外，本方案所提及的技术细节，完美地解决了热缩电极表面疏水问题，使得所制备的传感器表现出良好的一致性，如图8所示。用该传感器测量10ng/mL的PSA，间隔连续测量至25天，峰电流仍可保持92.5％，表现出良好的稳定性。使用寿命至少为25天。
Claims (6)
1.基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
步骤1，在热收缩聚合物基体表面加电极掩膜版，采用真空溅射的方式沉积金膜，得到金膜电极；所述沉积金膜厚度为60~200nm；将得到的金膜电极放在涂覆聚四氟乙烯涂层的平面上并置于加热炉中加热，加热温度为90~160℃，直至收缩稳定得到热收缩电极及褶皱的表面；之后用气体等离子体处理热收缩电极表面，以消除褶皱形貌本身的疏水性，得到褶皱电极；
步骤2，将步骤1得到的褶皱电极先进行石墨烯修饰，所述石墨烯修饰具体为：将步骤1得到的褶皱电极在浓度范围为0.01~100mg/mL的聚赖氨酸溶液A中室温孵育，使其表面带有正电荷的氨基，去离子水冲洗吹干后，在石墨烯溶液中孵育，去离子水冲洗吹干；再进行聚赖氨酸溶液B中孵育，所述聚赖氨酸溶液B的浓度范围为0.1~10 mg/mL；去离子水冲洗吹干后，在前列腺癌特异性抗原单克隆抗体溶液中室温孵育，孵育完成后，用1倍磷酸盐缓冲液冲洗吹干后，在牛血清蛋白中孵育，孵育完成后用1倍磷酸盐缓冲液冲洗吹干后，即得前列腺癌特异性抗原传感器。
2.根据权利要求1所述的基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器制备方法，其特征在于，步骤1所述热收缩聚合物为聚苯乙烯、聚烯烃、聚对苯二甲酸乙二醇酯中的一种。
3.根据权利要求1所述的基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器制备方法，其特征在于，步骤2所述石墨烯溶液浓度范围为0.2-5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器制备方法，其特征在于，步骤2所述前列腺癌特异性抗原单克隆抗体溶液的浓度为1~100μg/mL。
5.根据权利要求1所述的基于热收缩工艺的前列腺癌特异性抗原传感器制备方法，其特征在于，步骤2所述牛血清蛋白浓度范围为1~80mg/mL。
6.采用权利要求1-5任一项所述方法得到的前列腺癌特异性抗原传感器。
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