CN104267184A - 基于AuNPs@AgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器及其构建与应用 - Google Patents

基于AuNPs@AgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器及其构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器及其构建与应用方法。用石墨烯固定Ab1，PSA作为目标分析物，链霉亲和素标记的SA-AuNPsAgNCs容易与生物素修饰的单克隆抗体Ab2(biotin-Ab2)结合,通过抗原抗体的特异反应，用“三明治”夹心法制备PSA免疫传感器，分别将该传感器电催化还原沉积银和H2O2，可用于快速、灵敏、特异性好的检测乳腺癌患者血清中超低含量的PSA浓度，以及前列腺癌和前列腺增生患者血清中f-PSA和t-PSA的值，将对于前列腺癌诊断灰色区域中的识别和诊断具有重要意义。

Description

基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器及其构建与应用
技术领域
本发明属于电化学免疫分析技术领域，具体涉及一种基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器及其构建与应用方法。
背景技术
免疫分析通过结合高亲和性的抗原抗体，是特异性检测临床样本中癌症标记物的一种强大的分析工具。电化学免疫传感器因其使用仪器简单、快速响应和轻便而受到特别关注，信号放大方法已经广泛用于发展超灵敏的免疫传感器检测肿瘤标志物。基于纳米材料的多酶探针是最受欢迎的放大检测信号的方法，以过氧化物酶为最常见，但是酶易受温度、湿度和环境的影响，且容易失活、费时，制备和纯化过程昂贵，由于这些因素的影响，酶探针的实际应用受到限制。因此，开发稳定、经济和制备简单的探针对免疫传感器的实际应用非常重要。越来越大的研究者致力于模拟酶的研究，模拟酶比蛋白质稳定，制备更加经济划算，具有巨大的潜在应用价值，能够用作日常护理和一般体检的诊断试剂盒。磁性纳米粒子、氧化石墨烯、二氧化铈纳米粒子等许多纳米材料都具有类过氧化物酶的催化活性，已有文献报道一些免疫方法基于磁性纳米粒子或氧化石墨烯的过氧化物酶活性。然而，其动力学检测范围(0.1-100μg mL-1)并不能满足大多数蛋白质的检测，因为很多血清蛋白质的浓度小于1ngmL-1。因此，发展更灵敏的放大信号策略需要用模拟酶的方法并应用到实际样品中。最近，一些研究报道了寡聚核苷酸稳定的银纳米簇具有模拟过氧化物酶的活性，且能够催化过氧化氢(H2O2)还原。然而，该放大信号的方法因一个探针上仅仅只有一个银纳米簇而受到许多限制，如果能够获得一个纳米探针上有很多个银纳米簇，既能维持其固有的催化还原H2O2的类过氧化物酶活性，又能提高放大效率，将会大大提升该探针的应用效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的高灵敏度的、特异性好的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器及其构建与应用方法。
本发明的技术方案是：
一种基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的制备方法，以单链寡聚核苷酸为模板，合成寡聚核苷酸稳定的银纳米簇；带巯基的互补DNA单链通过Au-S键结合到金纳米粒子表面，再两条互补单链杂交，得到AuNPsAgNCs复合纳米杂化物；然后以石墨烯为基底固定PSA抗体1(Ab1)，PSA作为分析物，AuNPsAgNCs标记抗体2(Ab2)，由于抗原抗体之间的特异性结合，得到用于检测乳腺癌患者血清PSA的免疫传感器；
或者以石墨烯为基底固定PSA抗体1(Ab1)，free-PSA和total-PSA分别作为分析物，AuNPsAgNCs标记抗体2(Ab2)，由于抗原抗体之间的特异性结合，得到用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫传感器。
所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的制备方法具体包括以下步骤：
(1)DNA-AgNCs的制备：模板链S2和AgNO3溶液加入到磷酸缓冲液中，然后，NaBH4溶液加入到上述溶液中，得到的溶液震荡，然后放在4℃冰箱中于暗处过夜，得到S2/AgNCs；
(2)AuNPsAgNCs纳米复合材料的制备：DNA单链S1和链霉亲和素标记的金纳米粒子混合，震荡后，静置，得到的混合物离心，移去上层清液，加PBS(磷酸缓冲液)分散沉淀物，得到S1/SA-AuNPs；然后，将步骤(1)得到的S2/AgNCs加入到S1/SA-AuNPs溶液中加热，冷却至室温，即制得；
(3)AuNPsAgNCs纳米复合材料标记Ab2：AuNPsAgNCs纳米复合材料与生物素修饰的单克隆抗体Ab2混合反应，得到的AuNPsAgNCs/Ab2纳米复合材料溶液离心，用PBS缓冲溶液洗涤，备用；
(4)免疫传感器的制备：将裸玻碳电极抛光打磨至镜面，超声洗涤，吹干，用于电极修饰；将壳聚糖修饰的石墨烯纳米杂化片分散液滴于裸玻碳电极表面，自然烘干；再将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合液滴于裸玻碳电极表面，冲洗；然后，抗体Ab1滴于电极表面，37℃下密封培养后，冲洗；为了阻塞多余的活性基团及抗原与电极之间的非特异性结合，将电极进一步在BSA中于37℃下培养后,冲洗，不同浓度的PSA溶液分布滴加到电极表面，37℃下培养，冲洗掉未结合的PSA分子，将制备的AuNPsAgNCs/Ab2滴到电极表面，37℃培养后，冲洗，即可制得用于检测乳腺癌患者血清PSA的电极；
制备用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫传感器时，将2支同样经过上述处理的裸玻碳电极表面分别滴加不同浓度的free-PSA和total-PSA溶液，37℃下培养，冲洗掉未结合的free-PSA和total-PSA分子,将制备的AuNPsAgNCs/Ab2滴到电极表面，37℃培养后，冲洗，即可。
DNA-AgNCs的制备具体过程：40-60μL 100μM的模板链S2：3’-ACG CAT GCC GGC CCCTAA CTC CCC-5’和0.6-1.0μL 50mM AgNO3溶液加入到pH＝7.0-8.0磷酸缓冲液中，使得Ag+：S2＝7-9，然后0.6-1.0μL 50mM新制的NaBH4溶液加入到上述溶液中，得到的溶液强烈震荡至少1min，得到的S2/AgNCs放在4℃冰箱中于暗处过夜。
AuNPsAgNCs纳米复合材料的制备具体过程：20-30μL 40μM DNA单链S1：3’-SH-TTTTT GCC GGC ATG CGT-5’和20-30μL链霉亲和素标记的金纳米粒子混合，震荡至少1h后，静置至少24h，得到的混合物以6000-8000r/min离心至少10min，移去上层清液，加PBS分散沉淀物，再次离心，如此重复至少两次，最后将沉淀物分散在PBS中，得到S1/SA-AuNPs；然后，40-60μL 20μM S2/AgNCs加入到40-60μL 20μM S1/SA-AuNPs溶液中，混合液在85-95℃下加热至少5min，慢慢冷却至室温，即可。
AuNPsAgNCs纳米复合材料标记Ab2的制备具体过程：20-30μL 10μM AuNPsAgNCs纳米复合材料与20-30μL 25μg mL-1生物素修饰的单克隆抗体Ab2混合，混合物在室温下反应至少4h，得到的AuNPsAgNCs/Ab2纳米复合材料以10000-14000r/min离心至少10min，再分散于PH＝7.5的PBS中，重复洗涤至少三次，储存在4℃冰箱中，备用。
免疫传感器的制备的具体过程：将裸玻碳电极用0.4-0.6μm Al2O3粉抛光打磨至镜面，分别用乙醇和蒸馏水超声洗涤至少3min，再用N2吹干，用于电极修饰；将壳聚糖修饰的石墨烯纳米杂化片分散液滴于裸玻碳电极表面，自然烘干；将新制的EDC和NHS混合液滴于裸玻碳电极上，冲洗；然后再将Ab1滴于电极表面，37℃下密封培养至少1h，冲洗；为了阻塞多余的活性基团及抗原与电极之间的非特异性结合，将电极进一步用BSA(牛血清蛋白)封闭,冲洗之后，不同浓度的PSA溶液分别滴加到电极表面，37℃下培养至少1h，冲洗掉未结合的PSA分子，将制备的AuNPsAgNCs/Ab2滴到电极表面，37℃培养后，冲洗，即可制得用于检测乳腺癌患者血清PSA的电极；
制备用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫传感器时，将2支同样经过上述处理的裸玻碳电极表面分别滴加不同浓度的free-PSA和total-PSA溶液，37℃下培养至少1h，冲洗掉未结合的free-PSA和total-PSA分子,将制备的AuNPsAgNCs/Ab2滴到电极表面，37℃培养后，冲洗，即可。
上述免疫传感器的制备的具体过程中：将5-10mL0.5mg/mL的壳聚糖修饰的石墨烯纳米杂化片分散液滴于裸玻碳电极表面，自然烘干；将10-20μL新制的400mM EDC和100mM NHS滴于裸玻碳电极上，30min后冲洗；然后，5-10μL 25μg mL-1的Ab1滴于电极表面，37℃下密封培养至少1h，冲洗；将电极进一步用BSA封闭,冲洗之后，不同浓度的PSA溶液，或者free-PSA和total-PSA溶液，冲洗掉未结合的PSA分子或者未结合的free-PSA和total-PSA分子后，滴加浓度为10μM的AuNPsAgNCs/Ab2到电极表面，37℃培养至少1h。
本发明石墨烯纳米片(GS)通过热剥脱的方法制得，取4mL 0.5mg/mL氧化石墨烯(GO)加入到烧杯中，然后加入30μL浓氨水。搅拌均匀后，加入20μL水合肼，于60℃水浴下加热反应3.5小时。冷却至室温，离心得到石墨烯纳米片(GS)。在超声辅助下，该纳米片能重新分散于水中。将1mL 1mg/mL的石墨烯溶液与1mL 1％的壳聚糖(Chi)溶液混合，超声分散1小时，得到壳聚糖修饰的石墨烯纳米杂化片(Chi-GS)。
一种基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器，是由上述的方法制备而成的。
所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的应用方法，
用于检测乳腺癌患者血清PSA时，用阳极溶出伏安法检测AuNPsAgNCs对银离子的催化效果，通过Ag+的还原信号值反应PSA的浓度变化；
用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA时，利用AuNPsAgNCs对H2O2的电化学催化，通过双通道同时检测出free-PSA和total-PSA，得到f/t-PSA的值。
所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的应用方法具体为：
用于检测乳腺癌患者血清PSA时，包含AgNO3和抗坏血酸的银沉积溶液滴到所制备的电极上，避光培养3-10分钟，待银沉积后，用PBS冲洗电极，将修饰电极用线性扫描伏安法在1.0M的KCl溶液中扫出Ag+的还原峰，扫描范围是-0.15到0.25V，扫速为50mV s-1。
用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA时，两支分别用free-PSA和total-PSA修饰的电极放入装有4mL 0.1M，pH为7.5的N2饱和的PBS，同时含有5mM的H2O2的电解池中，电化学测试通过双通道线性扫描伏安法从0V到-0.6V完成，扫速为100mV s-1。
本发明采用不同浓度的PSA溶液，或者free-PSA和total-PSA溶液进行上述电化学测试制作标准曲线，然后电化学测试待测样品，根据标准曲线获得样品的数据。
本发明所用的PSA抗体1(Ab1)指针对分析物抗原的抗体，抗体2(Ab2)是指针对分析物抗原的二抗。由于抗原抗体的特异性结合构成Ab1-分析物-Ab2的夹心结构。
本发明的S2/AgNCs与S1/SA-AuNPs通过DNA杂交连接在一起，从而AgNCs均匀地分布在AuNPs表面，得到的AuNPsAgNCs纳米杂化材料尺寸均匀，稳定性好。由于链霉亲和素与生物素的特异性结合，AuNPsAgNCs容易与生物素修饰的单克隆抗体2(biotin-Ab2)结合，得到AuNPsAgNCs标记的Ab2。
本发明的免疫传感器以石墨烯作为免疫反应的平台固定Ab1，PSA作为分析物，通过抗原抗体的特异性反应，AuNPsAgNCs-Ab2作为电化学标签能够轻易地结合PSA。壳聚糖修饰的石墨烯固定在电极表面，不仅加速了电子传递，而且提供了生物相容的微环境固定Ab1，在三明治形式的免疫反应之后，AuNPsAgNCs-Ab2纳米杂化材料能够组装到电极表面，目标分析物PSA能够通过AgNCs的电化学溶出伏安法被检测出来。为了进一步提高该方法的灵敏度，发展了一种超灵敏的方法，即AuNPsAgNCs催化银沉积。该电化学免疫传感器对PSA的响应展示出宽的线性范围(1fg mL-1-1ng mL-1)和低的检出限(0.2fg mL-1)，并成功用于乳腺癌患者血清的PSA的检测，得到满意的结果。
而且，由于AuNPsAgNCs纳米复合材料对H2O2表现出有效的催化还原性能,本发明分别制备了f-PSA和t-PSA免疫传感器，能够同时检测出f-PSA和t-PSA的值，结果表明，展示了宽的线性范围(1pg mL-1-10ng mL-1)，得到f-PSA和t-PSA的检出限分别为0.2pg mL-1和0.3pg mL-1。计算出的f/t-PSA比值，得到的结果与标准的ELISA一致，这将对于前列腺癌诊断灰色区域中的识别和诊断具有重要意义。
总之，本发明具有高度识别能力、高灵敏度、好的重现性和稳定性。
附图说明
图1为f-PSA和f-PSA免疫传感器的构建原理图；
图2为AuNPs(a)、AgNCs(b)和AuNPsAgNCs(c)的紫外-可见光谱图；
图3(A)AgNCs的最大激发和发射光谱；(B)AgNCs在紫外灯照射下的照片；(C)AgNCs和AuNPsAgNCs的荧光光谱图；
图4AuNPsAgNCs纳米杂化物的TEM图；
图5AuNPsAgNCs纳米杂化物中Au元素(左)和Ag元素(右)的XPS图；
图6AuNPsAgNCs(a)和AuNPs(b)在N2饱和的0.1M H2SO4中的循环伏安图；扫速为100mV s-1；
图7Ab1/GN/GCE(a)、Ab2-AuNPsAgNCs/Ab1/GN/GCE(b)和GN/GCE(c)的阻抗谱图；
图8不同浓度PSA(1fg mL-1-1ng mL-1)的LSV图和标准曲线；
图9(A)AuNPs修饰的免疫传感器对不同浓度PSA(10fg mL-1-1ng mL-1)的LSV图；(B)AuNPsAgNCs和AuNPs修饰的免疫传感器对不同浓度PSA的响应的标准曲线；(C)AuNPs(a)和AuNPsAgNCs(b)修饰的免疫传感器在PSA浓度为10fg mL-1时的LSV比较；
图10正常人和乳腺癌病人血清中PSA的表达水平；
图11(A)不同浓度PSA免疫传感器在不含H2O2的N2饱和的PBS(a)和含5mM H2O2的N2饱和的PBS中的CV图：(b)0.01ng mL-1,(c)0.05ng mL-1,(d)0.1ng mL-1,(e)0.5ng mL-1,(f)1ng mL-1PSA，扫速为50mV s-1；(B)AuNPs(a)和AuNPsAgNCs(b)作为探针在5mM H2O2的N2饱和的PBS中的CV图；(C)AuNPsAgNCs(a)和AuNPs(b)作为探针在HNO3中溶解后的阳极溶出方波伏安图(SWV)
图12免疫传感器对f-PSA(A)和t-PSA(B)的LSV图:从1pg mL-1到10ng mL-1；该免疫传感器对不同f-PSA(C)和t-PSA(D)浓度的标准曲线；
图13(A)AuNPs修饰的免疫传感器对不同浓度PSA(10pg mL-1-10ng mL-1)的LSV图；(B)AuNPsAgNCs(b)和AuNPs(a)修饰的免疫传感器对不同浓度PSA的响应的标准曲线；(C)AuNPs(a)和AuNPsAgNCs(b)修饰的免疫传感器在PSA浓度为10fg mL-1时的LSV比较；
图14f-PSA与f-PSA Ab1结合(a)和t-PSA与f-PSA Ab1结合(b)的LSV图。
具体实施方式
下面结合具有实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
本发明免疫电化学传感器的构建及免疫分析示意如图1：
(1)DNA-AgNCs的制备：50μL 100μM的模板链S2：3’-ACG CAT GCC GGC CCC TAA CTCCCC-5’和0.8μL 50mM的AgNO3溶液加入到50μL 20mM的磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.0)中，使得Ag+：S2＝8。然后，0.8μL 50mM新制的NaBH4溶液在0℃下加入到上述溶液中，得到的溶液强烈震荡1min，将S2/AgNCs放在4℃冰箱中于暗处过夜。
(2)AuNPsAgNCs纳米复合材料的制备：25μL 40μM的DNA单链S1：3’-SH-TTT TT GCCGGC ATG CGT-5’和25μL链霉亲和素标记的金纳米粒子(SA-AuNPs，sigma购买)混合，震荡1h后，静置24h，得到的混合物以7000r/min离心10min，移去上层清液，加PBS分散沉淀物，再次离心，如此重复两次，最后将沉淀物分散在PBS中，得到S1/SA-AuNPs。然后，50μL 20μM的S2/AgNCs加入到50μL 20μM S1/SA-AuNPs溶液中，混合液在90℃下加热5min，慢慢冷却至室温。制得AuNPsAgNCs纳米杂化材料。
(3)AuNPsAgNCs标记Ab2的制备：25μL 10μM的SA-AuNPsAgNCs与25μL 25μg mL-1的biotin-Ab2混合，混合物在室温下反应4h，得到的AuNPsAgNCs/Ab2纳米杂化材料以12000r/min离心10min，再分散于PBS中，重复洗涤三次。AuNPsAgNCs/Ab2纳米杂化材料储存在4℃冰箱中，备用。
(4)石墨烯纳米片(GS)通过热剥脱的方法制得，取4mL 0.5mg/mL氧化石墨烯(GO)加入到烧杯中，然后加入30μL浓氨水。搅拌均匀后，加入20μL水合肼，于60℃水浴下加热反应3.5小时。冷却至室温，离心得到石墨烯纳米片(GS)。在超声辅助下，该纳米片能重新分散于水中。将1mL 1mg/mL的石墨烯溶液与1mL 1％的壳聚糖(Chi)溶液混合，超声分散1小时，得到壳聚糖修饰的石墨烯纳米杂化片(Chi-GS)。
(5)免疫传感器的制备：将裸玻碳电极(GCE，直径为3mm)用0.5μm Al2O3粉抛光打磨至镜面，分别用乙醇和蒸馏水超声洗涤3min，再用N2吹干，用于电极修饰。将5mL壳聚糖修饰的石墨烯纳米杂化片Chi-GS(0.5mg/mL)分散液滴于裸玻碳电极表面，自然烘干。将10μL新制的400mM EDC和100mM NHS混合液滴于GN-Chi/GCE上，30min后冲洗。然后，5μL 25μg mL-1的Ab1滴于电极表面，37℃下密封培养1h，冲洗；为了阻塞多余的活性基团及抗原与电极之间的非特异性结合，将电极进一步在1wt％的BSA中于37℃下培养40min,冲洗之后，不同浓度的PSA溶液滴加到电极表面，37℃下培养1h，冲洗掉未结合的PSA分子；最后，将制备的AuNPsAgNCs/Ab2(10μM)滴到电极表面，37℃中培养1h，冲洗之后，制备的电极可用于电化学测试。
用于检测前列腺癌患者血清PSA时：将2支同样经过上述处理的裸玻碳电极表面分别滴加不同浓度的free-PSA和total-PSA溶液，37℃下培养1h，冲洗掉未结合的free-PSA和total-PSA分子；最后，制备的AuNPsAgNCs/Ab2(10μM)滴到电极表面，37℃中培养1小时，冲洗之后，制备的电极可用于电化学测试。
(6)检测乳腺癌患者血清PSA时，15μL银沉积溶液(包含0.50mM的AgNO3和0.25mM的抗坏血酸AA)滴到所制备的电极上，避光培养4分钟，待银沉积后，用PBS冲洗电极。将修饰电极用线性扫描伏安法在1.0M的KCl溶液中扫出Ag+的还原峰，扫描范围是-0.15到0.25V扫速为50mV s-1。
检测前列腺癌患者血清PSA时，两支分别用free-PSA和total-PSA修饰的电极放入一个电解池中，该电解池装有4mL 0.1M pH为7.0的N2饱和的PBS，同时含有5mM的H2O2。电化学测试通过双通道线性扫描伏安法(LSV)从0V到-0.6V完成，扫速为100mV s-1。LSV信号响应与分析物的浓度成正比，电流强度随f-PSA和t-PSA浓度的增大而增大。
本实施例采用的抗体均购于上海领潮生物有限公司。
本发明的试验结果：
本发明得到的AuNPsAgNCs纳米复合材料的表征和分析
1、紫外-可见分光光谱和荧光光谱表征
由于银纳米簇和金纳米粒子在紫外可见光区都有特征吸收峰，因此紫外可见吸收光谱可用于监控该复合物的合成情况。将所得到的AgNCs、AuNPs和AuNPsAgNCs分别用紫外分光光度计表征，如图2所示。AuNPs在521nm左右有吸收峰(如图2中的曲线a所示)。如图2中的曲线b所示，银纳米簇在518nm处有很强的特征吸收峰，而在420左右没有吸收，表明银纳米簇成功合成出来。AuNPsAgNCs纳米复合物在520nm左右有一个很大的宽峰，由于厚度的增加，银纳米簇的吸收峰发生红移(如图2中的曲线c所示)，表明银纳米簇作为壳成功地包裹着AuNPs。
由于银纳米簇具有荧光性，因此荧光光谱可用来监控AgNCs和AuNPsAgNCs的合成情况。如图3(A)所示，AgNCs的最大激发波长为570nm；在570nm的激发下，AgNCs的最大吸收波长为640nm。在紫外灯的照射下，银纳米簇发强列的红光，如图3(B)。图3(C)是AgNCs和AuNPsAgNCs的荧光光谱图，在最大激发波长570nm的激发下，AuNPsAgNCs的最大吸收波长为640nm，表明AuNPsAgNCs的成功合成。
2、透射电子显微镜表征
为了表征AuNPsAgNCs纳米复合材料的形貌，对其进行透射电子显微镜分析。如图4所示，AuNPsAgNCs纳米杂化物均匀地分布在碳膜上，AuNPs周围有一层黑色的环包围着，这可能是由于AgNCs均匀地分布在AuNPs表面。在组装过程中，Au核和AgNCs是通过DNA双链连接起来的，DNA双链为AgNCs和AuNPs提供一个支架，空间上允许AgNCs能够很好的分散在AuNPs表面。
3、X射线光电子能谱表征
为了进一步表征AuNPsAgNCs的组成元素，对其进行X射线光电子能谱(XPS)分析，图5为纳米杂化物中Au元素和Ag元素的XPS谱图，由图可知Au元素的4f峰分别位于83.6eV和87.2eV处，374eV和368eV处的峰分别由Ag元素3d3/2和3d5/2轨道激发。由此可知，AgNCs已经成功固定在AuNPs上。
4、电化学性能
AuNPsAgNCs纳米杂化物和AuNPs分别修饰在裸玻碳电极上，电极浸没与N2饱和的0.1M的H2SO4中，电位在-0.2-1.4V以100mV s-1的扫速扫描，得到循环伏安图。如图6所示，AuNPs表现出一定的活性；与AuNPs相比较，AuNPsAgNCs的循环伏安图既展示出与AuNPs相类似的特征，又展示出银的氧化峰，表明AgNCs成功地包覆着AuNPs。析氢区域反映电化学活性位点的存在，AuNPsAgNCs在0.65V左右有析氢反应发生，表明该纳米复合材料表面存在电化学活性位点，是一种电催化应用方面有潜力的纳米材料。
本发明制备的用于检测乳腺癌患者血清PSA的免疫传感器的表征
1、阻抗谱监控免疫传感器的制备
阻抗谱图包括一段半圆形的部分和一段线性部分，在较高频率下的半圆形部分对应于电子转移限定过程，在较低频率下的线性部分对应于传质过程，半圆直径对应于电子转移阻力。图7表示GN/GCE、Ab1/GN/GCE和Ab2-AuNPsAgNCs/Ab1/GN/GCE的电子阻抗谱图。石墨烯修饰的电极表现出较低的电阻，表明高导电性的石墨烯能够在电极和分析物之间形成良好的电子和离子传导途径。此外，Ab1/GN/GC电极表面具有最大的半圆直径，表明1抗层形成了障碍，进而阻碍氧化还原探针的电子传递到电极表面。Ab2-AuNPsAgNCs键合到电极表面之后，直径比Ab1/GN/GCE的减小很多，这是由于AuNPsAgNCs的导电性所致。结果与AFM表征的结果一致。
2、免疫传感器的性能
在最优的条件下，PSA免疫传感器用电化学方法表征。图8表示线性扫描伏安法测定不同浓度PSA的信号，免疫传感器上的AgNCs通过阳极溶出伏安分析法能够轻易被测定，而且在+0.057V处展示出明显的阳极溶出峰。沉积在免疫传感器上的AgNPs的溶出峰电流与分析物(PSA)的量成正比例，PSA浓度在1fg mL-1-1ng mL-1范围内，峰电流与PSA浓度呈线性关系(R＝0.999)，基于信噪比为3，PSA的检出限为0.2fg mL-1。得到的动力学范围比基于AuNPs的免疫传感器测定PSA的线性范围(0.05ng mL-1-80ng mL-1)和基于碳纳米管的PSA免疫传感器的线性范围(0.2ng mL-1-40ng mL-1)宽，检出限也低于碳纳米管放大信号的免疫反应测定PSA的检出限(20pg mL-1)、基于金纳米粒子的免疫传感器检测PSA的检出限(10ng mL-1)、基于EIS微流体的免疫传感器检测PSA的检出限(1ng mL-1)和酶联免疫法检测PSA的检出限(3.2ng mL-1)。优异的电化学性能包括非常低的检出限和跨越3个数量级的宽的线性范围，这对于该免疫传感器的实际应用具有重要的意义。在该传感器中，石墨烯提供一种与蛋白质在其固有系统中相似的微环境，且允许蛋白质分子更自由取向，这为1抗的固定提供空间结合位点和一个理想而有效的平台。与此同时，石墨烯和金纳米粒子能够加速电子传递，有效地加强溶出峰的电流，提高检测的灵敏度。高比表面积的AuNPs允许大量的AgNCs固载在AuNPs表面上，因此，AuNPs也对催化沉积的银有一定的贡献，这进一步增大溶出信号和提高检测灵敏度。
电化学信号比较实验通过分别基于AuNPsAgNCs纳米复合物和单独AuNPs的免疫传感器实现，AuNPsAgNCs纳米复合物的LSV图在+0.057V的催化电流远远大于单独AuNPs催化电流。如图9A所示，用AuNPs作为探针标记Ab2构建免疫传感器，得到PSA的检测下限为10fgmL-1，比AuNPsAgNCs作为信号标签的检测下限大10倍；线性范围为10fg mL-1，比AuNPsAgNCs的窄，比较了两者的标准曲线(图9B)，可以明显看出AuNPsAgNCs的线性和催化活性均比AuNPs的好。同时还进一步比较了AuNPsAgNCs和AuNPs对沉积银的电催化性能，如图9C所示，当PSA浓度为10fg mL-1时，AuNPs和AuNPsAgNCs均对沉积银便显出明显的催化活性，但是AuNPsAgNCs对沉积银的催化电流远远大于AuNPs，从而证实了AuNPsAgNCs对沉积银的电催化效应是AuNPs和AgNCs的协同效应所引起的，表明AuNPsAgNCs纳米复合材料对沉积银具有更好的电催化活性。小尺寸的AgNCs作为壳、AuNPs作为核，通过DNA杂交形成核-壳结构，AuNPs作为一种高导电性能的优质纳米材料，AgNCs大的比表面积和高的电子传递效率，可以为沉积银在电极表面的还原提供电子传递的能力。由于电子导体AuNPsAgNCs均匀分散在传感膜中，以及导电性优良的石墨烯作为基质而形成了三维电子导电网络，从而加速了膜中的电荷传递，使得银离子在电极表面的还原得到增强。同时这些纳米探针AuNPsAgNCs能够进一步有效地提供电子传递路径，并在电极与分析物之间加速电子传递时起到纳米微电极的作用，从而使得AuNPsAgNCs修饰的电极上时，对银离子的电催化还原能力比AuNPs显著增大。
为了测定该PSA免疫传感器的重现性，制备5个平行包含1ng mL-1的PSA免疫传感器，5个新制的PSA免疫传感的相对标准偏差是7.6％，表明该免疫传感器具有良好的精密度和重现性。此外，当免疫传感器储存在4℃的干燥条件下两周后，响应信号减少为开始信号的92％，这些结果表明该免疫传感器具有好的可靠性和稳定性，适合于蛋白质标志物的临床诊断。
3、免疫传感器的应用
为了证明该传感器能够用于临床样本，将其用于健康女性质控样本和乳腺癌患者血清中t-PSA的检测。健康女性中的血清PSA浓度约为1pg mL-1，用目前已有的方法无法检测，因此，不同浓度的PSA加入到健康女性质控样本中并分析检测，由该免疫传感器测定上述血清样本中的PSA，得到的回收率在99.2％到106.9％之间(表1所示)，表明该免疫传感器在血清样本中的分析精确性和可靠性是可以接受的。进而，用该免疫传感器检测三个乳腺癌患者中t-PSA的表达水平。图10为乳腺癌患者血清中PSA的表达水平，可以明显看出健康女性和乳腺癌患者的区别，乳腺癌患者血清中的溶出信号值远远大于健康女性质控样本中的溶出信号，与文献报道相符合。如表2所示，乳腺癌患者中PSA的表达水平大约在0.04ng mL-1左右，与荧光免疫分析法和电致化学发光免疫分析法的结果相似。这些结果表明该制备的免疫传感器能够识别乳腺癌患者中血清PSA的微小改变，有望应用到乳腺癌的早期识别和诊断。
表1 PSA回收率的测定
表2 检测乳腺癌患者血清中PSA的结果与ELISA的结果比较
在本发明中，纳米复合材料以金纳米粒子作为核、银纳米簇作为介孔壳通过DNA杂交过程成功地合成出来，DNA双链在金纳米粒子和银纳米簇之间提供一个介电支架，空间上允许单个银纳米簇能够结合在金纳米粒子的表面。这一新颖的纳米复合材料被用作电化学信号放大探针，并应用到乳腺癌的诊断平台。该免疫传感器对PSA的响应展示出宽的线性范围(1fgmL-1-1ng mL-1)和低的检出限(0.2fg mL-1)。实验结果表明，该免疫传感器可以应用到乳腺癌患者血清中检测PSA的浓度，希望在不久的将来，对乳腺癌的早期识别和诊断有帮助。
本发明制备的用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫传感器的表征
如图11A所示，曲线b和a分别是制备的免疫传感器在含有H2O2和不存在H2O2的N2饱和的PBS中的循环伏安图。在H2O2的存在下，修饰电极对H2O2还原有显著的催化作用，其催化电位发生在-0.1V处；其催化还原电流随着免疫反应中抗原浓度的增大而增大，能够用于免疫分析。电化学信号比较实验通过分别基于AuNPsAgNCs纳米复合物和单独AuNPs的免疫传感器实现，AuNPsAgNCs纳米复合物的循环伏安图的催化电流远远大于单独AuNPs催化电流(如图11B所示)。AgNCs组装在传感器表面的数量进一步通过电化学溶出沉积的AgNCs来测定，如图11C所示，0.25V处的特有的方波伏安峰归咎于组装在传感器表面的AgNCs溶解于HNO3中的Ag+阳极溶出峰。加入AuNPsAgNCs纳米复合物和AuNPs修饰的抗体探针，完成免疫反应后，基于AuNPs探针的SWV几乎没有溶出峰，而基于AuNPsAgNCs纳米复合物探针的SWV峰电流很明显。这些结果均证实AuNPsAgNCs纳米复合物修饰的传感器表面含有高含量的AgNCs，也表明因更多具有内在过氧化物酶活性的AgNCs连接到AuNPs表面，免疫传感器的性能能够被进一步放大。
1、f-PSA和t-PSA免疫传感器的电化学响应
两支分别由f-PSA和t-PSA修饰的传感电极用双通道线性扫描伏安(LSV)法在同一电解质中同时测定。在最优的条件下，免疫传感器对H2O2还原的电化学响应在传感器制备完成之后被测定。图12为线性扫描伏安对f-PSA和t-PSA的响应曲线，LSV信号响应与分析物的浓度成正比，电流强度随f-PSA和t-PSA浓度的增大而增大，并在1pg mL-1到10ng mL-1之间展现出线性关系，在信噪比为3的条件下得到f-PSA和t-PSA的检出限分别为0.2pg mL-1和0.3pg mL-1。该免疫传感器的检测范围基于碳纳米管信号放大的PSA免疫传感器的检测范围(0.2-0.4ng mL-1)和基于金纳米粒子放大信号的PSA免疫传感器的检测范围(0.05-80ngmL-1)宽，检出限比文献报道的基于金纳米粒子的免疫传感器的检出限(10ng mL-1)、基于碳纳米管的免疫传感器的检出限(20pg mL-1)、酶联免疫法的检出限(3.2ng mL-1)和基于二茂铁的免疫传感器的检出限(2pg mL-1)低。分别用1.0ng mL-1f-PSA和1.0ng mL-1t-PSA修饰5支平行电极制备免疫传感器，相同条件下测定得到相对标准偏差(RSD)分别为4.2％和3.7％，表明该免疫传感器的重现性良好。
低的检出限和跨越3个数量级的宽的线性范围等优异的分析性能对该免疫传感器的实际应用非常重要。低检出限主要有三个因素：(1)石墨烯和金纳米粒子因其优异的导电性有效地加速电子传递；(2)石墨烯提供了与蛋白质固有体系相似的微环境，允许蛋白质分子自由取向，这为固定Ab1提供了空间结合位点和理想而有效的平台；(3)高比表面的金纳米粒子允许更多的银纳米簇结合，有效地加强了H2O2的催化还原和检测灵敏度。
电化学信号比较实验通过分别基于AuNPsAgNCs纳米复合物和单独AuNPs的免疫传感器实现，AuNPsAgNCs纳米复合物的LSV图在-0.6V的催化电流远远大于单独AuNPs催化电流。如图13A所示，用AuNPs作为探针标记Ab2构建免疫传感器，得到PSA的检测下限为10pg mL-1，比AuNPsAgNCs作为信号标签的检测下限大10倍；线性范围为10pg mL-1-10ng mL-1，比AuNPsAgNCs的窄，比较了两者的标准曲线(图13B)，可以明显看出AuNPsAgNCs的线性和催化活性均比AuNPs的好。同时还进一步比较了AuNPsAgNCs和AuNPs对H2O2的电催化还原性能，如图13C所示，当PSA浓度为10pg mL-1时，AuNPs和AuNPsAgNCs均对H2O2显出明显的催化活性，但是AuNPsAgNCs对H2O2的催化还原电流远远大于AuNPs，从而证实了AuNPsAgNCs对H2O2的电催化效应是AuNPs和AgNCs的协同效应所引起的，表明AuNPsAgNCs纳米复合材料对H2O2具有更好的电催化活性。小尺寸的AgNCs作为壳、AuNPs作为核，通过DNA杂交形成核-壳结构，AuNPs作为一种高导电性能的优质纳米材料，AgNCs大的比表面积和高的电子传递效率，可以为H2O2在电极表面的还原提供电子传递的能力。由于电子导体AuNPsAgNCs均匀分散在传感膜中，以及导电性优良的石墨烯作为基质而形成了三维电子导电网络，从而加速了膜中的电荷传递，使得H2O2在电极表面的还原得到增强。同时这些纳米探针AuNPsAgNCs能够进一步有效地提供电子传递路径，并在电极与分析物之间加速电子传递时起到纳米微电极的作用，从而使得AuNPsAgNCs修饰的电极上时，对H2O2的电催化还原能力比AuNPs显著增大。
2、特异性的测定
为了评估该免疫传感器对可能存在的干扰物质的抗干扰性，测定了人血清蛋白(HSA)、人类免疫球蛋白G(IgG)、和人类凝血因子(TB)等其他蛋白质与PSA共存下的LSV的响应信号。发现干扰物质以10倍PSA浓度加入到PSA后，两者的电化学信号无明显变化(信号变化在5％以下)，表明HSA、IgG和TB的存在并不干扰PSA的检测。
为了进一步调查基于AuNPsAgNCs纳米复合物的f-PSA和t-PSA传感器的特异性，两支电极均先用f-PSA抗体修饰，再分别加上相同浓度的f-PSA和t-PSA，最好均加入同浓度的Ab2-AuNPsAgNCs，得到两种不同夹心传感器，即f-PSA Ab1/f-PSA/Ab2和f-PSA Ab1/t-PSA/Ab2。如图14所示，修饰f-PSA的传感器的响应电流(曲线a)明显大于修饰t-PSA的传感器的响应电流(曲线b)，这是由于t-PSA中的PSA-ACT与f-PSA Ab1的相互作用很弱及可忽略的生物识别。表明f-PSA Ab1与其自己相对应的抗原具有高度特异性。这种高度特异性归因于f-PSAAb1只有一个结合位点，只能允许其特异的抗原与之结合。这些结果表明f-PSA和t-PSA两种传感器均有高度特异性，对实际血样中的f-PSA和t-PSA分析具有潜在应用价值。
3、血清中f-PSA和t-PSA的同时检测
为了评估该免疫传感方法的分析可靠性和应用潜能，分别在8个前列腺疾病患者的血清中同时测定f-PSA和t-PSA的值，测定结果与标准的酶联免疫法(ELISA)相比较，如表3所示，该免疫传感器检测到的f-PSA和t-PSA的值与ELISA的结果相一致，每个血样中的f/t-PSA比值能够计算出来。许多研究发现，当t-PSA浓度在4-15ng mL-1之间时，f/t-PSA比值能够初步区别前列腺增生和前列腺癌，前列腺癌患者具有较低的血清中f/t-PSA比值，而前列腺增生患者具有较高的f/t-PSA比值。由于前列腺癌患者的细胞中ACT转录酶的存在，PSA-ACT的浓度会增加，从而t-PSA的浓度增加，使得f/t-PSA比值变小；而在前列腺增生患者中，缺乏ACT转录酶，PSA主要以游离的形式存在，所以f/t-PSA比值的较大。据文献报道，f/t-PSA比值小于0.13-0.19阈值时，患前列腺癌的概率较大，反之，患前列腺增生的概率较大。就这个目的，在PSA诊断灰色区域(4-15ng mL-1)中，我们用该免疫方法分别测定了患有前列腺增生和前列腺癌的病人的血清f/t-PSA比值。如表4所示，测得的前列腺增生患者的血清f/t-PSA比值为0.238，远远大于前列腺癌患者的f/t-PSA比值0.123，该结果与文献报道的结果相符合。此外，该结果与标准的ELISA方法相比较，误差是可以接受的。因此，该免疫传感器足够灵敏可以在诊断灰色区域同时检测血清中的f-PSA和t-PSA值，表明它是识别前列腺癌的一种潜在工具。
表3 用该免疫传感器和ELISA检测8个前列腺疾病病人血清PSA的结果
表4 前列腺癌和前列腺增生患者中f/t-PSA的免疫分析结果
在本发明中，我们开发了一种新的前列腺癌诊断平台，即“三明治”式的免疫分析同时测定f-PSA和t-PSA。一个超灵敏的电化学免疫传感器被构建，石墨烯用来固载Ab1，AuNPsAgNCs纳米复合物作为电化学信号放大标签标记Ab2，病人血清中的PSA作为目标分析物。DNA稳定的AgNCs与SH-DNA修饰的SA-AuNPs通过DNA杂交过程结合，SA-AuNPsAgNCs纳米复合物表现出均匀的尺寸分布和高度稳定性，通过链霉亲和素与生物素的特异性结合，能够轻易地标记生物素修饰的Ab2，在免疫反应完成后，AuNPsAgNCs-SA/Ab2纳米复合物能够组装到电极上，并对H2O2展示出有效的催化还原性能。AuNPsAgNCs纳米复合材料对H2O2的催化还原使得PSA免疫传感器超灵敏，抗原抗体固有的选择性赋予了免疫传感器高度识别能力。该免疫传感器对f-PSA和t-PSA均展示了宽的线性范围(1pg mL-1-10ng mL-1)、低的检出限(分别为0.2pg mL-1和0.3pg mL-1)、好的重现性和稳定性。此外，该免疫传感器被应用于前列腺疾病患者的血清中同时检测f-PSA和t-PSA的值，得到的结果与ELISA的结果相一致，从前列腺癌和前列腺增生患者血清中f-PSA和t-PSA的值计算得到的f/t-PSA比值与ELISA的结果相符合，这将对于前列腺癌诊断灰色区域中的识别和诊断具有重要意义。

Claims (10)

1.一种基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，以单链寡聚核苷酸为模板，合成寡聚核苷酸稳定的银纳米簇；带巯基的互补DNA单链通过Au-S键结合到金纳米粒子表面，再两条互补单链杂交，得到AuNPsAgNCs复合纳米杂化物；然后以石墨烯为基底固定PSA抗体1，PSA作为分析物，AuNPsAgNCs标记抗体2，由于抗原抗体之间的特异性结合，得到用于检测乳腺癌患者血清PSA的免疫传感器；
或者以石墨烯为基底固定PSA抗体1，free-PSA和total-PSA分别作为分析物，AuNPsAgNCs标记抗体2，由于抗原抗体之间的特异性结合，得到用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，
(1)DNA-AgNCs的制备：模板链S2和AgNO3溶液加入到磷酸缓冲液中，然后，NaBH4溶液加入到上述溶液中，得到的溶液震荡，然后放在4℃冰箱中于暗处过夜；
(2)AuNPsAgNCs纳米复合材料的制备：DNA单链S1和链霉亲和素标记的金纳米粒子混合，震荡后，静置，得到的混合物离心，移去上层清液，加PBS分散沉淀物，得到S1/SA-AuNPs；然后，将步骤(1)得到的S2/AgNCs加入到S1/SA-AuNPs溶液中加热，冷却至室温，即制得；
(3)AuNPsAgNCs纳米复合材料标记Ab2：AuNPsAgNCs纳米复合材料与生物素修饰的单克隆抗体Ab2混合反应，得到的AuNPsAgNCs/Ab2纳米复合材料溶液离心，用PBS缓冲溶液洗涤，备用；
(4)免疫传感器的制备：将裸玻碳电极抛光打磨至镜面，超声洗涤，吹干，用于电极修饰；将壳聚糖修饰的石墨烯纳米杂化片分散液滴于裸玻碳电极表面，自然烘干；再将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合液滴于裸玻碳电极表面，冲洗；然后，抗体Ab1滴于电极表面，37℃下密封培养后，冲洗；为了阻塞多余的活性基团及抗原与电极之间的非特异性结合，将电极进一步在BSA中于37℃下培养后,冲洗，不同浓度的PSA溶液分别滴加到电极表面，37℃下培养，冲洗掉未结合的PSA分子，将制备的AuNPsAgNCs/Ab2滴到电极表面，37℃培养后，冲洗，即可制得用于检测乳腺癌患者血清PSA的电极；
制备用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫传感器时，将2支同样经过上述处理的裸玻碳电极表面分别滴加不同浓度的free-PSA和total-PSA溶液，37℃下培养，冲洗掉未结合的free-PSA和total-PSA分子，将制备的AuNPsAgNCs/Ab2滴到电极表面，37℃培养后，冲洗，即可。
3.根据权利要求2所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，
DNA-AgNCs的制备具体过程：40-60μL 100μM的模板链S2：3’-ACG CAT GCC GGC CCCTAA CTC CCC-5’和0.6-1.0μL 50mM AgNO3溶液加入到pH＝7.0-8.0磷酸缓冲液中，使得Ag+：S2＝7-9,然后，0.6-1.0μL 50mM新制的NaBH4溶液加入到上述溶液中，得到的溶液强烈震荡至少1min，得到的S2/AgNCs放在4℃冰箱中于暗处过夜。
4.根据权利要求2所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，
AuNPsAgNCs纳米复合材料的制备具体过程：20-30μL 40μM DNA单链S1：3’-SH-TTTTT GCC GGC ATG CGT-5’和20-30μL链霉亲和素标记的金纳米粒子混合，震荡至少1h后，静置至少24h，得到的混合物以6000-8000r/min离心至少10min，移去上层清液，加PBS分散沉淀物，再次离心，如此重复至少两次，最后将沉淀物分散在PBS中，得到S1/SA-AuNPs；然后，40-60μL 20μM S2/AgNCs加入到40-60μL 20μM S1/SA-AuNPs溶液中，混合液在85-95℃下加热至少5min，慢慢冷却至室温，即可。
5.根据权利要求2所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，
AuNPsAgNCs纳米复合材料标记Ab2的制备具体过程：20-30μL 10μM AuNPsAgNCs纳米复合材料与20-30μL 25μg mL-1生物素修饰的单克隆抗体Ab2混合，混合物在室温下反应至少4h，得到的AuNPsAgNCs/Ab2纳米复合材料以10000-14000r/min离心至少10min，再分散于pH＝7.5的PBS中，重复洗涤至少三次，储存在4℃冰箱中，备用。
6.根据权利要求2所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，
免疫传感器的制备的具体过程：将裸玻碳电极用0.4-0.6μm Al2O3粉抛光打磨至镜面，分别用乙醇和蒸馏水超声洗涤至少3min，再用N2吹干，用于电极修饰；将壳聚糖修饰的石墨烯纳米杂化片分散液滴于裸玻碳电极表面，自然烘干；将新制的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合液滴于裸玻碳电极上，冲洗；然后再将Ab1滴于电极表面，37℃下密封培养至少1h，冲洗；为了阻塞多余的活性基团及抗原与电极之间的非特异性结合，将电极进一步用BSA封闭,冲洗之后，不同浓度的PSA溶液分别滴加到电极表面，37℃下培养至少1h，冲洗掉未结合的PSA分子，将制备的AuNPsAgNCs/Ab2滴到电极表面，37℃培养后，冲洗，即可制得用于检测乳腺癌患者血清PSA的电极；
制备用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫传感器时，将2支同样经过上述处理的裸玻碳电极表面分别滴加不同浓度的free-PSA和total-PSA溶液，37℃下培养至少1h，冲洗掉未结合的free-PSA和total-PSA分子,将制备的AuNPsAgNCs/Ab2滴到电极表面，37℃培养后，冲洗，即可。
7.根据权利要求6所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的制备方法，其特征在于，
将5-10mL0.5mg/mL的壳聚糖修饰的石墨烯纳米杂化片分散液滴于裸玻碳电极表面，自然烘干；将10-20μL新制的400mM1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和100mM N-羟基琥珀酰亚胺混合液滴于裸玻碳电极上，30min后冲洗；然后，5-10μL 25μg mL-1的Ab1滴于电极表面，37℃下密封培养至少1h，冲洗；将电极进一步用BSA封闭,冲洗之后，不同浓度的PSA溶液，或者free-PSA和total-PSA溶液，冲洗掉未结合的PSA分子或者未结合的free-PSA和total-PSA分子后，滴加浓度为10μM的AuNPsAgNCs/Ab2到电极表面，37℃培养至少1h。
8.一种基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器，其特征在于，是由权利要求1-7任一项所述的方法制备而成的。
9.权利要求8所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的应用方法，其特征在于，
用于检测乳腺癌患者血清PSA时，用阳极溶出伏安法检测AuNPsAgNCs对银离子的催化效果，通过Ag+的还原信号值反应PSA的浓度变化；
用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA时，利用AuNPsAgNCs对H2O2的电化学催化，通过双通道同时检测出free-PSA和total-PSA，得到f/t-PSA的值。
10.权利要求8所述的基于AuNPsAgNCs纳米复合材料的免疫电化学传感器的应用方法，其特征在于，
用于检测乳腺癌患者血清PSA时，包含AgNO3和抗坏血酸的银沉积溶液滴到所制备的电极上，避光培养3-10分钟，待银沉积后，用PBS冲洗电极，将修饰电极用线性扫描伏安法在1.0M的KCl溶液中扫出Ag+的还原峰，扫描范围是-0.15到0.25V，扫速为50mV s-1。
用于检测前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA时，两支分别用free-PSA和total-PSA修饰的电极放入装有4mL 0.1M，pH为7.0的N2饱和的PBS，同时含有5mM的H2O2的电解池中，电化学测试通过双通道线性扫描伏安法从0V到-0.6V完成，扫速为100mV s-1。
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