CN109856213B - 一种间充质干细胞的检测方法 - Google Patents

Abstract

一种用于电化学检测的组合物，整合了电极的导电性特性与银纳米簇的电化学性质，通过抗体的免疫识别引入滚环扩增技术以及银纳米簇实现输出信号的放大，使得检测灵敏度高，特异性强，因而在临床诊断等领域(如：间充质干细胞)有广泛的应用前景。

Description

一种间充质干细胞的检测方法

技术领域

本发明涉及一种用于电化学传感方法检测物质的组合物，特别涉及一种以含有DNA为模板合成的银纳米簇的组合物，以及利用银纳米簇具有的电化学信号实施检测方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新、多向分化潜能和低免疫原性的干细胞。相关研究表明，MSCs可通过直接接触和旁分泌作用发挥免疫调节性能，从而抑制过度的免疫反应，维持局部微环境稳态，促进组织的修复，为炎症相关性疾病和自身免疫性疾病的治疗带来新的方向。而间充质干细胞的的灵敏检测可以为这些疾病的临床诊断和治疗提供许多重要的信息。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种组合物，以第一抗体和第二抗体作为抗体识别元件，通过两步免疫识别捕获待测物质(如：间充质干细胞)后借助滚环扩增反应提高银纳米簇在电极表面的聚集效果，从而实现了显著的信号放大效应。

本发明的另一个目的在于提供一种组合物，与样品共混后，通过产生银纳米簇的电化学响应信号，实现了对样品中待测物质(如：间充质干细胞)实施定性和定量的电化学分析。

本发明的再一个目的在于提供一种间充质干细胞的检测方法，通过分析电化学工作站输出的银纳米簇的电化学响应信号的强弱，实现对间充质干细胞的定性检测。

本发明的又一个目的在于提供一种间充质干细胞的检测方法，通过分析电化学工作站输出的银纳米簇的电化学响应信号的强弱，实现对间充质干细胞的定量检测。

由于干细胞表面表达量较高的蛋白质标志物有CD44和CD90。基于此，本发明以CD44和CD90作为抗体识别元件，通过两步免疫识别捕获间充质干细胞后借助滚环扩增反应提高银纳米簇在电极表面的聚集效果，从而实现了显著的信号放大效应。以此为基础获得了一种高灵敏、双识别的高特异性的间充质干细胞检测方法，可以在复杂环境中准确识别间充质干细胞。

本领域技术人员可以理解，抗原和抗体系免疫学上对两种分子的表述，本发明中应理解为是一对能够互相特异性结合的分子，具有识别性。

本发明所称的抗原是类似于在肌体中引起特异性(免疫)应答的物质。抗原进入机体后，可刺激肌体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。抗原的反应性取决于抗原决定簇(antigenic determinant)，亦称表位 (epitope)。一个抗原分子可带有不同的决定簇。此外，通过基因工程或化学连接的方式对表位进行拼接所取得分子形式，也包含与本发明所称抗原的范围内。

本发明所称的抗体，应当理解为具有识别抗原并与抗原结合的分子，尤其是聚合物，常见的抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。本发明中，抗体还包括具有识别抗原作用的分子，如：但不限于由Ig衍生而来的抗体 Fab段、单链抗体、单域抗体和纳米抗体等也应属于此范畴。

一种间充质干细胞的检测方法，首先通过预先修饰在ITO电极(掺锡氧化铟，IndiumTinOxide)表面的CD44抗体识别间充质干细胞表面的CD44蛋白将间充质干细胞捕获到ITO电极表面；然后，将CD90抗体与滚环扩增的引物交联(如：Suflo-SMCC) 并通过CD90抗体对预捕获的间充质干细胞的定向识别；最后，以与CD90相连的核酸进行滚环扩增，将滚环扩增的产物与合成的DNA-AgNCs进行互补作为放大的电化学信号输出，实现对于间充质干细胞的检测。

一方面，由于银纳米簇同时具有电化学性质，在电化学工作站中输出显著的电化学信号。另一方面，当检测体系中不存在间充质干细胞时，银纳米簇无法固定至电极表面，此时不能输出电化学信号。基于以上过程，本发明就可以通过分析电化学工作站输出的银纳米簇的电化学响应信号的强弱，实现对间充质干细胞的定性和定量检测。

一种组合物，用于间充质干细胞的电化学检测，其包括：

DNA链，其包括序列5′-TCAGAACTCACCTGTTAGCCCACCCAC-3′的多聚核苷酸单链；

金属银，其附着于DNA链，形成多聚核苷酸-Ag纳米簇(记为：DNA-AgNCs)；

第一抗体，其结合于电极上；

第二抗体，其与与包含序列为5′-SH-TCACAGCTGAGGATAGGACAT-3′的多聚核苷酸链交联；

DNA环状模板，多聚核苷酸链包含序列5′-p-CTCAGCGTGTAACAACATGAAGA TTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATCGCTTATTATGTCCTATC -3′；

T4连接酶，

T4缓冲液，

DNA聚合酶，以及

dNTP。

本发明的DNA链为单链DNA，以此为模板形成DNA-AgNCs，制备银纳米簇。

本发明的组合物，第一抗体为CD44抗体，第二抗体为CD90抗体。

一种间充质干细胞的电化学检测方法，具体如下：

先将包含待测的间充质干细胞的样品溶液与具有第一抗体(即包含CD44抗体)的电极相互作用，使得间充质干细胞在电极表面的捕获；

然后，将所得到的捕获有间充质干细胞的电极与第二抗体(即CD90与序列为 5′-SH-TCACAGCTGAGGATAGGACAT-3′的多聚核苷酸链交联的复合物)共混，使得第二抗体与间充质干细胞的识别结合；

接着，使用T4连接酶，T4缓冲液，DNA环状模板、DNA聚合酶和dNTP进行滚环扩增，得到滚环扩增产物与DNA-AgNCs混合反应，使得DNA-AgNCs附着于电极上；

最后，将连接了DNA-AgNCs的电极置于含有1～1.5M KCl的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，用线性扫描伏安法进行电化学表征，采集电化学信号。

另一种间充质干细胞的电化学检测方法，具体如下：

先将包含待测的间充质干细胞的样品溶液与具有第一抗体(即CD44抗体)的电极相互作用；反应时间为1～2小时，反应温度为30～40℃，使得间充质干细胞在电极表面的捕获；

然后，将所得到的捕获有间充质干细胞的电极与第二抗体(即CD90与序列为 5′-SH-TCACAGCTGAGGATAGGACAT-3′的多聚核苷酸链交联的复合物)共混，于 30～40℃反应1～2小时，使得第二抗体与间充质干细胞的识别结合；

接着，分别取T4连接酶，T4缓冲液，DNA环状模板以及固定了间充质干细胞的电极于30～40℃共反应1～2小时；加入BSA、DNA聚合酶Phi29、Phi29缓冲液和dNTP反应2～3小时，反应温度为30℃，得到的滚环扩增产物，再与DNA-AgNCs混合反应2～3 小时，反应温度为30～40℃；

最后，将连接了DNA-AgNCs的电极置于含有1～1.5M KC1的PBS，用线性扫描伏安法进行电化学表征，采集电化学信号。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明的组合物，以第一抗体和第二抗体作为抗体识别元件，通过两步免疫识别捕获待测物质后借助滚环扩增反应提高银纳米簇在电极表面的聚集效果，从而实现了显著的信号放大效应。使用的抗体可以根据不同检测的具体需求而更改，因此具有设计的灵活性和通用性，可以在除间充质干细胞以外的其它能被抗体识别的分析靶标中推广应用，具有很好的技术借鉴和指导价值。

本发明的组合物应用于间充质干细胞的定量电化学检测，整合了ITO电极的导电性特性与银纳米簇的电化学性质，通过抗体的免疫识别引入滚环扩增技术以及银纳米簇实现输出信号的放大，使得检测灵敏度高，特异性强，因而在临床诊断等领域有广泛的应用前景。

本发明的组合物应用于间充质干细胞的定量电化学检测中，银纳米簇还具有荧光信号，可以通过不同信号输出方式，与电化学检测相互补充，提供更为全面的细胞定位和蛋白表达信息。

附图说明

图1为本发明建立的基于银纳米电化学信号的间充质干细胞的检测方法的原理图；

图2为电极处于不同表面状态时的电化学交流阻抗图谱；其中，曲线a为anti-CD44功能化电极，曲线b和c为对应于anti-CD44功能化电极依次与间充质干细胞以及与anti-CD90结合后滚环扩增产物与DNA-AgNCs的交联作用后的状态；

图3为检测每毫升10⁵个间充质干细胞及对照实验中所得到的线性扫描伏安扫描图谱；其中a表示对照组，样品中含有每毫升10⁵个间充质干细胞但检测体系中未加入银纳米簇；b表示对照组，样品中加入银纳米簇，但无细胞加入；c表示实验组，样品中含有每毫升10⁵个间充质干细胞并且加入银纳米簇；

图4为检测不同浓度间充质干细胞时得到的线性扫描伏安扫描图谱，由a至f分别为每毫升 0、10、10²、10³、10⁴和10⁵个间充质干细胞，其中右下的插入图显示了图谱所得的间充质干细胞的线性关系；

图5为检测不同细胞时得到的线性扫描伏安扫描峰电流值。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1间充质干细胞电化学检测

本实施例如下的基于银纳米电化学信号的间充质干细胞的检测原理参见图1所示，具体方法如下：

(a)设计并合成一条5′端修饰巯基(SH)的引物链DNA-SH，其序列为：5′-SH-T(20)-CACAGCTGAGGATAGGACAT-3′，设计能够进行滚环扩增的DNA环： 5′-p-CTCAGCGTGTAACAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAAC TGTGAAGATCGCTTATTATGTCCTATC-3′。

(b)通过Suflo-SMCC的交联作用将DNA-SH与anti-CD90交联，后续进行以环状 DNA为模板，DNA-SH为引物的滚环扩增并产生大量的DNA重复序列，其能够与合成银纳米簇后的DNA进行互补配对，进而滚环扩增的DNA产物上结合大量的银纳米簇作为放大的信号输出。具体步骤为：分别取一定量的anti-CD90和Suflo-SMCC于微量管中，用PBS稀释到适合的浓度；所使用的anti-CD90的浓度为1～1.3μM，体积分别为1.2～2μL；所使用的稀释溶液为PBS(pH＝7.0)，体积为100～150μL；反应温度为20～30℃；反应时间为2～3小时。反应完全之后用超滤离心管除去未结合的Sulfo-SMCC，并复溶于 100～150μL的PBS中，加入DNA-SH引物，继续置于25℃环境下反应2～3小时。重复离心步骤，后将沉淀物复溶于100～150μL PBS中待用。

(c)设计能够合成银纳米簇的DNA模板，其序列为：5′-TCAGAACTCACCTGTTAGCCCACCCAC-3′。合成DNA-AgNCs：分别取95～120μL浓度20～40mM的 NH₄AC，100～150μL浓度为100～150μM的AgNO₃，5～10μL浓度为100～150pM合成银纳米簇的DNA模板，反应时间为20～30min，反应温度为4℃，随后加入5～10μL浓度为1～5 mM的NaBH₄，在4℃条件下反应2～3小时。

(d)制备能够特异性捕获间充质干细胞的anti-CD44功能化的ITO电极。具体步骤为：将预处理过的ITO电极置于含有浓度为0.5～1μM的anti-CD44缓冲液中，于20～30℃进行功能化反应，再置于浓度为1～5mM的BSA水溶液中30～40℃避光处理1～2小时，用超纯水冲洗、吹干。

ITO电极的预处理方法为：依次用丙酮超声20～30min，乙醇超声15～20min，超纯水超声30～40min，所用超声溶液体积均为500～800μL。随后，用含有5％APTES的乙醇溶液过夜进行ITO电极表面的氨基活化。活化后的ITO电极用乙醇冲洗3次，转移至 80～90℃的水中较热10～15min，滴加戊二醛在30～40℃下反应1.5～3小时，用PBS清洗干净电极待用。

(e)将100～150μL包含待测的间充质干细胞的样品溶液与步骤(d)所得的 anti-CD44功能化的电极相互作用，通过靶细胞与anti-CD44间的特异性免疫识别，实现目标间充质干细胞在电极表面的捕获；反应时间为1～2小时，反应温度为30～40℃。

(f)将步骤(e)所得到的捕获有目标间充质干细胞的电极与步骤(b)所制备得到的anti-CD90与DNA-SH的交联复合物于30～40℃反应1～2小时，以实现anti-CD90与 DNA-AgNCs的交联复合物对于间充质干细胞的识别结合。

(g)分别取0.5～1μL的T4连接酶，4～5μL的T4缓冲液，6～8μL的DNA环状模板以及(f)中固定细胞的ITO电极于30～40℃共反应1～2小时。加入2～4μL的Phi29缓冲液、 55～70μL的Phi9缓冲溶液、1～3μL的BSA和dNTP于微量试管中反应2～3小时，反应温度为30℃，得到的滚环扩增产物与50～150μL(c)中的DNA-AgNCs混合反应2～3小时，反应温度为30～40℃。

(h)将连接了DNA-AgNCs的ITO电极置于含有1～1.5M KCl的PBS，用线性扫描伏安法进行电化学表征，采集电化学信号。比如：使用CHI660c电化学工作站，线性扫描伏安法的扫描起始电位为-0.2V，扫描终止电位为0.3V。

实施例2银纳米簇的合成和表征

分别取95～120μL浓度为20～40mM的NH₄AC，100～150μL浓度为100-150μM的AgNO₃，5～10μL浓度为100～150μM合成银纳米簇的DNA模板，反应时间为20～30min，反应温度为4℃，随后加入5～10μL浓度1～5mM的NaBH₄，在4℃条件下反应2～3小时。电化学交流阻抗测定所用仪器是CHI660c电化学工作站，初始电位为0.224V，频率范围为0.1Hz～100000Hz。

电化学交流阻抗表征结果如图2所示。从图中可以看出，当在电极表面固定了anti-CD44链后，产生了一个明显的半圆(曲线a)这说明此时电极界面电荷转移阻力增大，而这是由于anti-CD44在电极表面形成负电荷界面，和溶液中同样为负电性的电化学探针(铁氰化钾)发生静电排斥；当目标间充质干细胞存在时，间充质干细胞可以被被捕获至电极表面，从而对于铁氰化钾与电极之间的电荷转移产生明显的位阻效应，引起交流阻抗图谱中半圆直径的进一步增大(曲线b)。最后，当电极表面细胞与 anti-CD90结合后促发滚环扩增反应并结合DNA-AgNCs，所得到的交流阻抗图谱中半圆直径进一步增大(曲线c)，这证明了DNA-AgNCs与滚环扩增产物的结合以及通过双靶标能够定向识别电极表面捕获的间充质干细胞的选择性。

实施例3间充质干细胞的定量检测

取100μL包含不同浓度间充质干细胞(每毫升10、10²、10³、10⁴和10⁵个细胞)的待测样品溶液与anti-CD44功能化ITO电极在30～40℃条件下反应1～2小时，通过靶细胞与anti-CD44间的特异性分子识别，实现目标间充质干细胞在电极表面的捕获。随后，将电极进一步与100μL的anti-CD90与DNA-SH的交联复合物在30～40℃条件下反应1～2 小时，以实现其对于间充质干细胞的定向识别；以固定在细胞表面的DNA为引物，加入体积是0.5～1μL的T4连接酶、4～5μL的T4缓冲液和6～8μL的DNA环状模板，在30～40℃反应1～2小时进行环状模板连接。随后，加入2～4μL的Phi29和1～3μL的BSA在扩增缓冲液中反应2～3小时。滚环扩增产物与DNA-AgNCs混合，体积为50～150μL，反应温度为 30～40℃，反应2～3小时。反应结束后，使用PBS将电极冲洗干净，使电化学工作站记录银纳米簇的电化学响应图谱，并根据电化学响应强度实现对目标间充质干细胞的检测。

本实施例中所采用的DNA模板序列与实施例一中相同，电化学工作站为CHI660c电化学工作站，所使用的电化学扫描技术为线性扫描伏安法，扫描起始电位为-0.2V，扫描终止电位为0.3V。

图3显示了本发明建立的电化学传感方法检测每毫升10⁵个间充质干细胞及对照实验中所得到的线性扫描伏安扫描图谱。当检测体系中存在每毫升10⁵个间充质干细胞但未加入多DNA-AgNCs时，线性扫描伏安图谱在0.06V附近的电化学响应峰强度与空白对照组基本相同(图3，a柱)；而当存在每毫升10⁵个间充质干细胞时，线性伏安图谱在0.06V附近存在一个归属于银纳米簇的很强的电化学响应峰(图3，c柱)；此外，如图3中b柱所示，当体系中不含间充质干细胞，线性扫描伏安图谱中只有一个很小的背景信号峰。

图4显示了线性扫描伏安图谱中电化学响应峰随间充质干细胞浓度的变化情况。如图所示，随着间充质干细胞浓度的提高，线性扫描伏安图谱峰逐渐增大，这说明随着间充质干细胞浓度的增加，越来越多的DNA-AgNCs通过杂交定向结合在细胞表面，并产生逐渐增强的电化学响应。插入图是其线性关系。

实施例4间充质干细胞电化学传感方法的特异性确认

使用其他种细胞(肝细胞L0-2)作为对照细胞。检测结果如图5所示，当样品中存在每毫升10⁵个间充质干细胞时，线性扫描伏安扫描峰电流值约为110～120μA；而当样品中存在其他类型对照细胞时，线性扫描伏安扫描峰电流值与空白对照组相似，为 10～15μA。这说明本实施例建立的检测方法用于间充质干细胞检测具有良好的特异性。

上述实施例的结果表明，本发明建立的基于银纳米电化学信号的间充质干细胞的检测方法具有很好的灵敏性和特异性，在临床诊断等领域中有着很大的潜在应用价值。

序列表

<110> 章毅

中国干细胞集团上海生物科技有限公司

重庆市干细胞技术有限公司

中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司

上海市干细胞技术有限公司

陕西省干细胞技术有限公司

苏州市干细胞技术有限公司

三亚市干细胞技术有限公司

<120> 用于物质检测的组合物及其在间充质干细胞中的应用

<141> 2019-02-19

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> Atificial Synthesis

<400> 1

tcagaactca cctgttagcc cacccac 27

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Atificial Synthesis

<400> 2

tcacagctga ggataggaca t 21

<210> 3

<211> 79

<212> DNA

<213> Atificial Synthesis

<400> 3

ctcagcgtgt aacaacatga agattgtagg tcagaactca cctgttagaa actgtgaaga 60

tcgcttatta tgtcctatc 79

Claims (2)

1.一种间充质干细胞的检测方法，其特征在于包括：

先将包含待测的间充质干细胞的样品溶液与具有第一抗体的电极相互作用，使得间充质干细胞在电极表面的捕获；

然后，将所得到的捕获有间充质干细胞的电极与第二抗体共混，使得第二抗体与间充质干细胞的识别结合；

接着，使用T4连接酶，T4缓冲液，DNA环状模板、DNA聚合酶和dNTP进行滚环扩增，得到滚环扩增产物，再与DNA-AgNCs混合反应，使得DNA-AgNCs附着于电极上；

最后，将连接了DNA-AgNCs的电极置于含有1～1.5M的KCl的磷酸缓冲盐溶液，用线性扫描伏安法进行电化学表征，采集电化学信号；

所述的第一抗体包含CD44抗体；

所述的第二抗体系CD90抗体与序列为5'-SH-TCACAGCTGAGGATAGGACAT-3'的多聚核苷酸链交联的复合物。

2.一种间充质干细胞的检测方法，其特征在于包括：

先将包含待测的间充质干细胞的样品溶液与具有第一抗体的电极相互作用；反应时间为1～2小时，反应温度为30～40℃，使得间充质干细胞在电极表面的捕获；

然后，将所得到的捕获有间充质干细胞的电极与第二抗体共混，于30～40℃反应1～2小时，使得第二抗体与间充质干细胞的识别结合；

接着，分别取T4连接酶，T4缓冲液，DNA环状模板以及固定了间充质干细胞的电极于30～40℃共反应1～2小时；加入BSA、DNA聚合酶Phi29、Phi29缓冲液和dNTP反应2～3小时，反应温度为30℃，得到的滚环扩增产物，再与DNA-AgNCs混合反应2～3小时，反应温度为30～40℃；

最后，将连接了DNA-AgNCs的电极置于含有1～1.5M KCl的PBS，用线性扫描伏安法进行电化学表征，采集电化学信号；

所述的第一抗体包含CD44抗体；

所述的第二抗体系CD90抗体与序列为5'-SH-TCACAGCTGAGGATAGGACAT-3'的多聚核苷酸链交联的复合物。

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