CN110361433B - 电化学检测细胞的方法及其组合物 - Google Patents
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Abstract
一种检测细胞的组合物，以SEQ ID No 2～5所示四条寡DNA自组装形成的DNA组装体为模板合成银纳米簇，细胞表面经TCEP处理后，经迈克尔加成反应将5’端具有马来酰亚胺基团的寡DNA链连接到细胞表面，并通过碱基互补配对原则与含有银纳米簇的DNA组装体相结合。在电极上修饰的抗体用于捕获目标细胞，银纳米簇固定于目标细胞上，并通过在硝酸溶液中溶出金属银离子实现目标间充质干细胞的定量检测。本发明的检测组合物，采用DNA组装体模板化银纳米簇作为电化学信号，点击化学介导的信号放大体系，实现对样本中目标细胞进行定性和定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物传感检测方法，尤其涉及一种基于温和化学反应指导的普适性高灵敏检测细胞的电化学传感方法，以及实施该方法的组合物。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是在血管周围发现的纤维母细胞样细胞的异质群体，类似于周细胞，它们集中在骨髓和脂肪组织中并具有多种潜能，易于分离和培养，体外扩增潜能高，是一种极具吸引力的治疗工具。由于它们的分化潜能、向创面的趋向性，以及产生促进愈合、血管生成、生长和细胞募集以及抑制炎症的可溶性因子，它们具有修复病变或受损组织和再生原生组织的潜力。临床上对间充质干细胞的灵敏检测可以为骨损伤、软骨损伤,成骨不全症,肺损伤、肾病、糖尿病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等疾病的临床诊断和治疗提供许多重要的信息。
金属纳米簇作为一种新型纳米材料具有尺寸小、比表面积大、稳定性高、生物相容性好等优点,已被广泛地应用于分析化学领域。近年来，以DNA为模板合成的银纳米簇由于良好的电化学信号响应和稳定的荧光信号，在生物传感检测领域也引起极大的兴趣。目前，DNA模板化的银纳米簇已经广泛应用于蛋白质、DNA、RNA等生物分子的检测。然而，由于灵敏度不足等原因，该方法在临床应用方面受到了限制。本发明基于马来酰亚胺能与巯基发生迈克尔加成反应的原理提出了以DNA组装体模板化银纳米簇为主要信号来源结合表面温和化学连接方法从而检测间充质干细胞的电化学新方法研究思路。本方法具有反应条件温和、操作简便以及普适性强的特点，可以根据间充质干细胞甚至其他不同种类细胞的特定检测需求而量身定制，满足不同检测的实际需求，具有良好的临床应用潜能。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种组合物，含有金属粒子，其在0.216V下具有电化学响应信号的特性，用于对细胞实施定性检测。
本发明的另一个目的在于提供一种组合物，含有金属粒子，其在0.216V下具有电化学响应信号的特性，且细胞浓度的对数值与在0.216V下的电流值具有呈良好的线性关系，用于对细胞实施定量检测。
本发明的再一个目的在于提供一种检测细胞的方法，实现对样本中目标细胞的定性检测。
本发明的又一个目的在于提供一种检测细胞的方法，实现对样本中目标细胞的定量检测。
本发明的目标细胞，系对样本中含有的拟检测的细胞总称，比如：体细胞、干细胞和癌细胞等。
一种组合物，包括：
寡核苷酸，其5’端具有马来酰亚胺基团；
金属银，其附着于DNA组装体，形成DNA组装体-Ag纳米簇；
抗体，其通过杯[4]芳烃偶联于金电极，用于与所述的目标细胞结合；
本发明的组合物，还包括硝酸，其作用于桥联DNA模板化AgNCs，溶出银离子。
本发明的DNA组装体为多聚DNA链，以此为模板形成DNA组装体-银纳米簇，制备银纳米簇。
本发明的组合物，寡核苷酸其序列如SEQ ID No 1所示。
本发明的组合物，由四条SEQ ID No 2～5所示的寡DNA序列自组装形成的DNA组装体。
本发明的组合物，所定性或定量检测的目标细胞为间充质干细胞，抗体为CD44抗体。
本发明组合物用于对目标细胞进行定性检测，其检测方法如下：
首先将四组寡DNA序列(SEQ ID No 2～5)在90～95℃条件下反应5～10分钟，经3～5小时自然冷却恢复至室温后得到DNA组装体，再将DNA组装体与硝酸银(AgNO3)、醋酸铵(NH4Ac)和硼氢化钠溶液混合，4℃反应2～3小时得到DNA组装体模板化的银纳米簇。未修饰的金电极经4-磺酰杯[4]芳烃化合物(简称：杯[4]芳烃)水溶液在4℃±0.5℃反应8～10小时修饰后，在4℃条件下与一抗偶联2～3小时得到抗体功能化电极。收集的细胞悬液在37℃±0.5℃条件下经三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理20～30分钟后将电极置于细胞悬液中，37℃±0.5℃反应2～3小时使金电极捕获细胞；
将捕获细胞后的金电极置于DNA组装体模板化银纳米簇溶液中，37℃±0.5℃条件下结合0.5～1小时。
然后将捕获细胞后的金电极置入0.5M稀硝酸溶液在25℃±0.5℃条件下反应1～2小时以溶出银离子，使用差分脉冲伏安法检测Ag电化学信号，实现目标细胞进行定性检测。
本发明组合物用于对目标细胞进行定量检测，其检测方法如下：
首先未修饰的金电极经杯[4]芳烃在4℃±0.5℃反应8～10小时修饰后，在4℃条件下与一抗偶联2～3小时得到抗体功能化电极。收集的细胞悬液在37℃±0.5℃条件下经三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理20～30分钟后将电极置于细胞悬液中，37℃±0.5℃反应2～3小时使金电极捕获细胞；
将捕获细胞后的金电极置于桥联DNA模板化银纳米颗粒溶液中，37℃±0.5℃条件下结合0.5～1小时。
然后将金电极置入0.5M稀HNO3溶液在25℃±0.5℃条件下反应1～2小时以溶出银离子，使用差分脉冲伏安法检测Ag电化学信号，实现目标细胞进行定量检测。
当目标细胞为间充质干细胞时，细胞浓度的对数值与检测体系在0.216V处的电流值之间呈良好的线性关系。线性方程为Y＝1.07034lgC间充质干细胞-1.22915，R2＝0.989，检测限为30个细胞。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明的检测组合物，采用DNA组装体模板化银纳米簇作为电化学信号，点击化学介导的信号放大体系，实现对样本中目标细胞进行定性和定量检测。通过细胞表面的点击化学反应将金属纳米颗粒组合物连接到细胞表面，利用金属的电化学特性，建立电化学信号与目标细胞之间的关联性，实现对样本中目标细胞进行定性和定量检测。
本发明的检测组合物，可以根据检测的需要选择抗体，通过选取具有特征性的抗体，该组合物可以应用于不同靶标细胞的分析检测，因而具有良好的普适性。
基于本发明的组合物，构建DNA组装体模板化银纳米簇的间充质干细胞的电化学检测方法具有很好的灵敏性和特异性，实验操作方便，可以普遍应用于临床诊断和疾病监测等领域。
附图说明
图1为本发明组合物用于检测细胞的原理示意图；
图2为本发明的DNA组装体模板化银纳米簇的定性电化学信号；
图3为检测不同浓度间充质干细胞(从下至上分别为空白、1×102个细胞、1×103个细胞、1×104个细胞、1×105个细胞1×106个细胞)时得到的电流响应值；
图4为最终检测体系中银纳米簇与间充质干细胞浓度间的关系图，以及间充质干细胞浓度在102个细胞～106个细胞范围内时电流响应值值与间充质干细胞对数浓度之间的线性关系图；
图5为检测各种对照细胞时得到的最终检测体系电流响应值。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
实施例1：金电极修饰及捕获细胞，具体步骤如下：金电极分别用3000目和5000目的砂纸打磨后，在颗粒大小为1.0μm、0.3μm铝粉的麂皮上抛光，然后将电极分别在无水乙醇和超纯水中超声3～5min，然后用配制好的水虎鱼，即浓硫酸：过氧化氢＝3:1的体积比的混合液，每根电极滴40μL，净化金电极，去除残留的杂质；最后经过0.5M的H2SO4活化。将活化后的金电极置于100～150μL的1mM杯[4]芳烃水溶液中，在4℃条件下修饰8～10小时；4℃条件下与100～150μL的CD44抗体溶液偶联2～3小时得到抗体功能化电极。收集的细胞悬液在37℃±0.5℃条件下经0.5～1mL的1mMTCEP处理20～30分钟后将电极置于细胞悬液中，37℃±0.5℃反应2～3小时使金电极捕获细胞；
实施例2：DNA组装体银纳米簇合成及寡核苷酸与银纳米簇与细胞结合
以如下S2-S5为模板合成DNA组装体，分别取2.5μL、100μM的SEQ ID No S2～S5所示序列的溶液混匀后在95℃±0.5℃水浴条件下反应5min～10min，然后自然冷却待用。取10～20μLDNA组装体溶液与100μL～150μL、100μM～150μM的硝酸银(AgNO3)、95～145μL、20～50mM的醋酸铵(NH4Ac)混合，4℃反应20min～30min；加入3μL～5μL、1mM～2mM的硼氢化钠，剧烈震荡1min～2min后，4℃反应2小时～3小时；使用30K离心柱14,000r/min、10分钟～15分钟过滤离心DNA组装体-Ag纳米簇(DNA-AgNCs)，收集上清备用。
在37℃±0.5℃条件下将捕获细胞后的金电极置于100μL～150μL的1μM马来酰亚胺修饰的寡核苷酸溶液中，使马来酰亚胺-DNA连接到细胞表面。
接着，加入100μL～200μLDNA组装体模板化的银纳米簇溶液，在37℃±0.5℃条件下反应1～2h，使银纳米簇固定在细胞膜上。
加入100μL～150μL浓度为0.5M～1M的硝酸溶解银纳米簇，25℃反应2小时～3小时；使用差分脉冲伏安法检测Ag信号。
相关寡核苷酸DNA链序列如下：
S1：5'-tcctcctcctcctcctccaccttcgctcacccg-3'，其在5’端具有马来酰亚胺基团。
DNA组装体由4条多聚DNA链组成，其序列如下：
S2:5'-ttcttcttcttcttcagccggctaggtttgcgcgggtgagcgaaggt-3'。
S3:5'-ttcttcttcttcttcagcaaacctagccggcacttcttcttcttctt-3'。
S4:5'-gaagaagaagaagaacccccccccccccccc-3'。
S5:5'-ccccccccccccccccaagaagaagaagaag-3'。
实施例3间充质干细胞的定性检测
按实例2中的方法加入100μL～150μL间充质干细胞悬液进行电化学检测。图2显示了在0.216V处有Ag的特征性电化学响应信号。
实施例4间充质干细胞的定量检测
按实例2中的方法，在体系中中分别加入100μL含有不同浓度的间充质干细胞(1×102个细胞、1×103个细胞、1×104个细胞、1×105个细胞、1×106个细胞)溶液进行电化学检测。图3显示了检测体系中银纳米簇在的电化学响应信号值随间充质干细胞浓度改变的情况。随着间充质干细胞浓度的提高，Ag的电化学响应信号值随之增加，这说明随着细胞浓度的增加，越来越多的银离子结合到细胞表面。图4说明了电流绝对值与间充质干细胞浓度的关系，其中内嵌图显示了间充质干细胞在1×102到1×106个细胞的范围内其浓度的对数值与峰值电流绝对值之间的线性关系。该方法对间充质干细胞检测的线性范围为102～106个细胞。线性方程为Y＝1.07034lgC间充质干细胞-1.22915，R2＝0.989，检测限为30个细胞。
实施例5检测体系特异性研究
用CD44低表达的细胞(HepG2和L02)作为对照，按照上述方法，分别对浓度为105个细胞进行差分脉冲伏安法检测。从图5中可以看出，在无细胞存在的空白对照组，最终反应体系的电流值较弱；当检测CD44高表达的间充质干细胞时，反应体系所得到的电流值有明显的提升，而对于CD44低表达的非特异性细胞，最终反应体系的电流值与在空白对照中得到的结果基本相同。以上结果有效的证明，本实施例构建的基于温和化学指导的DNA组装体模板化银纳米簇的间充质干细胞电化学检测方法具有特异性。
由此，选择各种细胞表面的特异性抗原，本实施例的方案还能应用到其它细胞的检测中。
序列表
<110> 章毅
中国干细胞集团上海生物科技有限公司
重庆市干细胞技术有限公司
中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司
上海市干细胞技术有限公司
陕西省干细胞技术有限公司
苏州市干细胞技术有限公司
三亚市干细胞技术有限公司
<120> 电化学检测细胞的方法及其组合物
<141> 2019-07-03
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tcctcctcct cctcctccac cttcgctcac ccg 33
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ttcttcttct tcttcagccg gctaggtttg cgcgggtgag cgaaggt 47
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ttcttcttct tcttcagcaa acctagccgg cacttcttct tcttctt 47
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gaagaagaag aagaaccccc cccccccccc c 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cccccccccc ccccccaaga agaagaagaa g 31
Claims (4)
1.一种检测细胞的方法，其特征在于包括：
抗体功能化的金电极与三(2-羧乙基)膦处理后的目标细胞悬液于37℃±0.5℃反应1~2小时使目标细胞连接到金电极上；
加入马来酰亚胺基团修饰的寡核苷酸溶液，于37℃±0.5℃反应0.5~1小时，使得马来酰亚胺基团修饰的寡核苷酸连接到细胞表面；
加入DNA组装体模板化的银纳米簇，于37℃±0.5℃反应0.5~1小时，使得银纳米簇与寡核苷酸连接，从而将银纳米簇固定在细胞表面；
然后加入稀硝酸以溶出银离子，于25℃±0.5℃反应2~3小时后，在-0.1V-0.5V的电势下，并在0.216V处显示金属银的电化学信号峰，实现目标细胞进行定性检测；
将活化的所述金电极置于100~150µL的1mM杯[4]芳烃水溶液中，在4℃条件下修饰8~10小时；4℃条件下与100~150µL的CD44抗体溶液偶联2~3小时得到所述的抗体功能化的金电极；
分别取2.5µL、100µM的SEQ ID No 2~5所示序列的溶液混匀后在95℃±0.5℃水浴条件下反应5min~10min，然后自然冷却得到所述的DNA组装体。
2.一种检测细胞的方法，其特征在于包括：
抗体功能化的金电极与三(2-羧乙基)膦处理后的目标细胞悬液于37℃±0.5℃反应1~2小时使目标细胞连接到金电极上；
加入马来酰亚胺基团修饰的寡核苷酸溶液，于37℃±0.5℃反应0.5~1小时，使得马来酰亚胺基团修饰的寡核苷酸连接到细胞表面；
加入DNA组装体模板化的银纳米簇，于37℃±0.5℃反应0.5~1小时，使得银纳米簇与寡核苷酸连接，从而将银纳米簇固定在细胞表面；
然后加入稀硝酸以溶出银离子，于25℃±0.5℃反应2~3小时后，在-0.1V-0.5V的电势下，并在0.216V处显示金属银的电化学信号峰，实现目标细胞进行定量检测；
将活化的所述金电极置于100~150µL的1mM杯[4]芳烃水溶液中，在4℃条件下修饰8~10小时；4℃条件下与100~150µL的CD44抗体溶液偶联2~3小时得到所述的抗体功能化的金电极；
分别取2.5µL、100µM的SEQ ID No 2~5所示序列的溶液混匀后在95℃±0.5℃水浴条件下反应5min~10min，然后自然冷却得到所述的DNA组装体。
3.根据权利要求1或2所述的检测细胞的方法，其特征在于所述的目标细胞为间充质干细胞时，细胞浓度的对数值与检测体系0.216V处的电化学信号值之间呈良好的线性关系，线性方程为Y=1.07034 lgC间充质干细胞-1.22915，R2=0.989，检测限为30个细胞。
4.根据权利要求1或2所述的检测细胞的方法，其特征在于所述的寡核苷酸其序列如SEQ ID No 1所示。
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| GR01 | Patent grant | ||
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