CN109844514A

CN109844514A - 非编码rna的电化学传感器的制备方法及其应用

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Publication number: CN109844514A
Application number: CN201880003841.4A
Authority: CN
Inventors: 赵卉; 李灿鹏; 张亚平; 刘凤
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2038-06-21
Also published as: WO2019241948A1; CN109844514B

Abstract

一种非编码RNA的电化学传感器的制备方法，该方法通过一步法制备磺酸化杯[8]芳烃负载的还原氧化石墨烯，用湿热法合成了四氧化三铁纳米材料，并加入金纳米粒子分别合成Au@SCX8‑RGO及Au@Fe₃O₄复合材料；通过材料表征确认材料构建成功后，以甲苯胺蓝等物质为电信号物质用丝网印刷电极对目标物进行电化学检测。通过该方法制得的电化学生物传感器可实现了对由选择性多聚腺苷酸化（APA）现象所产生的不同长度的非编码区3'UTR转录本表达量的检测。

Description

非编码RNA的电化学传感器的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于电化学生物传感领域，具体涉及一种非编码RNA的电化学检测方法及其在选择性多聚腺苷酸化检测中的应用。

背景技术

超灵敏核酸检测技术在功能基因检测及其生物学功能评价、疾病诊断等领域应用广泛。如荧光定量PCR技术、滚环扩增技术等微量核酸检测技术基于聚合酶链式反应和荧光信号检测方法达到微量核酸定量或检测，但这些检测方法存在操作步骤复杂、光学信号探针昂贵、需要特定检测仪器等问题。电化学传感技术一直是应用最广泛的生物医学和化学分析检测平台，具有简单、便携式、低成本、高检测灵敏度等优势。电化学生物传感器在床旁即时诊断、微创检测、肿瘤分型、细胞分化等生物医学领域有广泛的应用前景。

选择性多聚腺苷酸化（Alternative cleavage and polyadenylation，APA）是指前体mRNA在成熟的过程中，由于环境的细微变化导致mRNA在不同的剪切位点上进行选择性剪切和多聚腺苷酸化的现象。APA在mRNA 3'非编码区（3'UTR）的形成过程中起着重要的作用，是转录后水平调控的重要组成部分。APA的形成过程主要包括poly(A)位点的选择和多聚腺苷酸化。选择性多聚腺苷酸化信号位点的不同是形成APA的关键。前体mRNA在多聚腺苷酸化信号位点的下游剪切掉10~30 nt，接下来，在多聚腺苷酸聚合酶的催化下，在3'端加入多聚腺苷酸poly(A)尾。经典的多聚腺苷酸化位点有AAUAAA，其他非经典的变体包括AUUAAA、AAGAAA 和 UAUAAA 等。研究表明，在不同的癌细胞和癌组织中，基因特别是原癌基因更倾向于使用带有短链3'UTR的mRNA亚型，而且这种亚型与肿瘤的诊断分型和预后密切相关，因此它可以作为一种新型的肿瘤生物标志物，对它们的检测具有良好的临床价值和应用前景。另外，APA还与细胞的分化、细胞定位、RNA的稳定、DNA甲基化、基因的表达与沉默、胚胎组织的发育等诸多的生理功能有密切的关系，因此APA在细胞和生物医学中行使非常重要的功能。目前，检测APA的典型方法主要有印迹杂交法、实时荧光定量PCR、基因芯片、高通量测序技术等方法，但这些方法中存在的一些缺点，如设备昂贵、维护成本高、样品处理繁琐、耗时、检测成本高、操作复杂、检测灵敏度不高、假阳性率高等，限制了它们的应用及普及。因此，发展一种无需PCR扩增、简单、快速、准确、低成本的APA检测方法，克服上述方法的不足之处就具有重要的科学与应用价值。

发明内容

本发明目的在于提供了一种简单、快速、准确、低成本的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其步骤如下：

（1）四氧化三铁纳米微球的制备

把三氯化铁水合物加入到乙二醇中形成澄清溶液，并加入乙酸钠和聚乙二醇，搅拌30~60分钟后，放入水热反应釜中加热反应，冷却到室温后得黑色沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀，干燥后得到Fe₃O₄纳米微球；

其中所述三氯化铁在乙二醇中的质量体积浓度为0.2%~0.5%，水热反应是在120~220℃下反应5~10小时，干燥是在60~100℃下处理6~10小时，乙酸钠与三氯化铁的质量比为3~6:1，聚乙二醇与三氯化铁的质量比为1:2~3:1；

（2）金纳米粒子负载四氧化三铁纳米复合物（Au@Fe₃O₄）的制备

将步骤（1）Fe₃O₄纳米微球分散于超纯水中，超声分散均匀后，依次加聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸和抗坏血酸，搅拌，用磁铁分离后得到黑色沉淀，用无水乙醇洗涤后得到Au@Fe₃O₄复合物；所述聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸、抗坏血酸的在超纯水中的浓度分别为0.10~0.25 mg/mL、1~5 mg/mL、2~6 mg/mL、1~6 mg/mL；

（3）金纳米粒子/磺酸化杯[8]芳烃/还原氧化石墨烯/电信号物质复合物的制备

将4-磺酸杯[8]芳烃水合物、氧化石墨烯分散到去离子水中，超声后调节pH值为7.0 ~12.0，回流反应后，离心，弃去上清液，固体用去离子水洗涤3~4次，得到还原的氧化石墨烯-SCX8复合物；将还原的氧化石墨烯-SCX8复合物分散于去离子水中，超声分散均匀后加入HAuCl₄，搅拌、离心分离后弃去上清液，固体用去离子水洗涤，得到Au@RGO-SCX8复合物；把Au@RGO-SCX8复合物超声分散于去离子水中，然后加入电信号物质，搅拌，离心分离得到沉淀，用去离子水洗涤沉淀，最后得到Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物；

所述4-磺酸杯[8]芳烃水合物和氧化石墨在去离子水中的质量浓度均为0.1%~0.5%；HAuCl₄在还原的氧化石墨烯-SCX8复合物分散液中的质量浓度为1%~5%；

所述电信号物质为能被4-磺酸杯[8]芳烃水合物识别的电活性物质，每1 mL Au@RGO-SCX8复合物分散液中添加0.2 mg~1mg电信号物质；电信号物质为甲苯胺蓝、亚甲基蓝或二茂铁。

（4）电化学传感器的构建

将Au@Fe₃O₄复合物超声分散在缓冲液Ⅰ中，Au@Fe₃O₄复合物在缓冲液Ⅰ中的浓度为0.5~3mg/mL，并加入捕获探针，捕获探针在缓冲液Ⅰ中浓度为0.5~10 μmol/L，在4℃的条件下放置5~20小时，磁铁分离；然后在固体加入缓冲液Ⅰ和己硫醇，固体在缓冲液Ⅰ中的浓度为0.5~3mg/mL，己硫醇在缓冲液Ⅰ中浓度为1~5 mmol/L，己硫醇用来封闭非特异性位点，室温放置10~40 min后，用磁铁分离，在分离后固体中加入缓冲液Ⅱ和浓度范围在10^-18 ~10^-9 mol/L的目标RNA，分离后固体在缓冲液Ⅱ中的浓度是0.5~5 mg/mL；室温下放置1~2小时后磁铁分离，在分离的固体中依次加入信号探针、辅助探针和Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液，室温下放置1~2小时后磁铁分离，将固体分散在磷酸缓冲液中，取分散液滴于丝网印刷电极表面，并在电化学工作站上用示差脉冲伏安法、循环伏安法或交流伏安法确定目标RNA的浓度和峰电流的关系，并获得电流强度与RNA浓度的标准曲线，进而完成电化学传感器的构建；

其中所述信号探针和辅助探针的初始浓度均为10~20 μmol/L，每1 mg分离的固体中各添加100~150 μL的信号探针和辅助探针；Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液（去离子水分散液）的浓度为1~5 mg/mL，每1 mg分离的固体中添加1~1.5 mL的Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液，探针用水稀释。

所述每0.1 mg固体添加2~10 μL浓度范围在10^-18 ~10^-9 mol/L的目标RNA。

所述缓冲液Ⅰ为含有10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、300 mmol/L NaCl、1mmol/L MgCl₂的溶液；缓冲液Ⅱ为含有10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/LEDTA、300 mmol/LNaCl、1 mmol/LTCEP的溶液。

所述磷酸缓冲液pH为7。

其中目标基因由于APA作用可产生带有不同长度3’UTR的转录本，从这些3’UTR序列中选取长约40 nt序列作为目标序列（target sequences），并在NCBI数据（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上检测探针的特异性；然后取5’端20nt序列作为模板，根据碱基配对反向互补原理，获得捕获探针（Capture probe，CP）识别序列；信号探针（Label probe，LP）序列由两部分组成：3’端20 nt序列来自于目标序列3’端的20 nt序列的反向互补，5’端15 nt序列是任意的长约15 nt的核酸序列；辅助探针（Auxiliary probe，AP）由两部分组成：5’端的15 nt来自于信号探针LP的5’端15 nt序列的反向互补，3’端的序列来自于LP的3’端20 nt序列的反向互补。捕获探针CP和信号探针LP序列的3’端用巯基修饰，这样可以通过配位结合作用，让两个探针分别连接到Au@Fe3O4复合物和Au@RGO-SCX8复合物上。

本发明另一目的是将上述方法制得电化学传感器在选择性多聚腺苷酸化检测中的应用，用电化学法检测由APA现象所产生的不同长度的3’UTR转录本表达量。

根据上述步骤（4）中得到的标准曲线计算待测样品中非编码RNA（目标RNA）的浓度或者细胞中非编码RNA的浓度，并根据该结果来评价APA与癌症的关系，并用于床旁即时诊断、微创检测等领域。

本发明通过所设计的捕获探针与信号探针、目标RNA和Au@SCX8-RGO-TB形成超分子纳米复合物，制备成用于检测RNA的生物传感器。

与现有技术相比，本发明具有如下特点：

1、本发明无需核酸的PCR扩增等过程，可以有效的节省样品前处理的时间；

2、本发明无需复杂的标记和固定DNA探针分子操作过程，其主要利用捕获探针分子末端修饰的巯基与纳米材料表面的金纳米粒子配位形成稳定的探针；

3、本发明对DNA探针的碱基序列无特殊要求，因此具有普遍适用性；

4、本发明中电化学传感器中所使用的电信号富集材料为对甲苯胺蓝等识别能力较强的4-磺酸杯[8]芳烃水合物，因此具有较好的电信号放大效果；同时，4-磺酸杯[8]芳烃水合物有较好的化学稳定性，有利于产品的稳定和产业化开发；

5、本发明中电化学传感器所检测的目标RNA是通过特异性较强的DNA捕获探针来识别的，有较强的特异性；

6、本发明中由于电化学传感器具有四氧化三铁的催化效应、4-磺酸杯[8]芳烃水合物的富集效应和金纳米粒子的导电效应，可以有效的放大信号从而有较低的检出限，达到了单细胞检测水平（1.76×10^-19 mol/L）；

7、本发明中的方法具有简单可控、检出限低和信号易于采集等优点，可快速检测待测样品的浓度，且灵敏度高；

8、本发明中的电化学传感器可以测定RNA的实际浓度，即可以绝对定量；

9、本发明中的电化学传感器可直接测定RNA样品，无需将待测RNA样品反转录为cDNA检测。

附图说明

图1是Fe₃O₄（A）和Au@Fe₃O₄（B）的透射电子显微镜图；

图2是Au@Fe₃O₄纳米复合材料的光电子能谱图；

图3是Au@Fe₃O₄纳米复合材料和Fe₃O₄的X衍射图；

图4是还原氧化石墨烯、还原的氧化石墨烯-SCX8、4-磺酸杯[8]芳烃水合物的红外光谱图；

图5是还原氧化石墨烯、还原的氧化石墨烯-SCX8复合物的热重图谱；

图6是Au@RGO-SCX8复合物的透射电子显微镜图；

图7是CCND2捕获探针CP和qPCR引物设计原理图；

图8是电化学传感器的构建和工作原理，图中HT是己硫醇；

图9是电化学传感器在修饰上不同材料后阻抗的变化；CCND2-L（A图）和CCND2-S（B图）的阻抗图谱；

图10是电化学传感器对CCND2-L定量检测结果，A图是DPV结果，B图是根据DPV数据做的标准曲线；

图11是电化学传感器对CCND2-S定量检测结果，A图是DPV结果，B图是根据DPV数据做的标准曲线；

图12是电化学传感器特异性检测结果；A图为不同序列特异性检测结果；B图是人乳腺癌细胞H292和人正常肺细胞Beas-2B中，CCND2 基因由于APA调控所产生的CCND2两种转录本（CCND2-L和CCND2-S）表达量的电化学检测结果；

图13是人乳腺癌细胞H292和人正常肺细胞Beas-2B中APA调控所产生的CCND2两种转录本（CCND2-L和CCND2-S）表达量的qPCR检测结果。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂；

实施例中涉及的还原氧化石墨烯是称取市购氧化石墨烯置于去离子水中超声分散后，用NaOH调pH至10.0~12.0，然后90℃回流反应3~6 h，16000 rpm离心20~40 min，离心水洗2~4次制得。

实施例1：本非编码RNA的电化学传感器的制备方法步骤如下：

1、四氧化三铁（Fe₃O₄）纳米微球的制备

把1.35 g FeCl₃.6H₂O加入到40 mL乙二醇中形成澄清溶液，并加入乙酸钠和聚乙二醇，其中乙酸钠与三氯化铁的质量比为3:1，聚乙二醇与三氯化铁的质量比为7:10；搅拌30分钟后，放入水热反应釜中加热至180℃，反应7小时，冷却后到室温得黑色沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀，在60℃下处理10小时得到Fe₃O₄纳米微球；

2、金纳米粒子负载四氧化三铁纳米复合物（Au@Fe₃O₄）的制备

将步骤（1）Fe₃O₄纳米微球10 mg分散于10 mL的超纯水中，超声分散均匀后，加入聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸和抗坏血酸，搅拌，用磁铁分离后得到黑色沉淀，用无水乙醇洗涤后得到Au@Fe₃O₄复合物；其中聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸、抗坏血酸的在超纯水中的浓度分别为0.10 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、2 mg/mL；

采用JEM-2100型透射电子显微镜(日立，日本)对所得的四氧化三铁纳米微球和金纳米粒子负载的四氧化三铁复合物分别进行了表征；由图1A可见，制备成的四氧化三铁呈规整的球状，粒径大约为350 nm。负载金纳米粒子之后，四氧化三铁表面有明显的小颗粒（图1B），证明了金纳米粒子已经负载到四氧化三铁的表面。同时，为了从另外的角度验证金纳米粒子和四氧化三铁已经复合成功，采用光电子能谱（图2）和X衍射（图3）对其进行了表征，结果表明复合物中存在金和铁的特征峰，因此也进一步证明金纳米粒子与四氧化三铁成功复合。

3、金纳米粒子/磺酸化杯[8]芳烃/还原氧化石墨烯/甲苯胺蓝/纳米复合物(Au@SCX8- RGO-TB)复合材料的制备

将4-磺酸杯[8]芳烃水合物、氧化石墨烯分散到去离子水中，4-磺酸杯[8]芳烃水合物在去离子水中的质量浓度均为0.2%，氧化石墨烯在去离子水中的质量浓度均为0.3%，超声混合后调节pH值为7，回流反应后，离心，弃去上清液，固体用去离子水洗涤3次，得到还原的氧化石墨烯-SCX8复合物（RGO-SCX8）；将制得的RGO-SCX8分散于去离子水中，超声分散均匀后加入HAuCl₄，HAuCl₄在还原的氧化石墨烯-SCX8复合物分散液中的质量浓度为3%，搅拌、离心分离后弃去上清液，用去离子水洗涤沉淀，得到Au@RGO-SCX8复合物；把Au@RGO-SCX8复合物超声分散于离子水中，然后加入甲苯胺蓝（每1 mL Au@RGO-SCX8复合物分散液中添加0.5mg甲苯胺蓝），搅拌，离心分离得到沉淀，用去离子水洗涤沉淀，最后得到Au@RGO-SCX8-TB复合物；

采用红外光谱、热重分析和透射电镜等技术对制得的SCX8-RGO复合物进行了表征；还原的氧化石墨烯（RGO）的FTIR光谱表明该材料中存在伸展振动峰-OH（3426 cm^-1），和含氧官能团C-O / C-C（1040 cm^-1），其中也存在共轭C=C（1625 cm^-1）。SCX8-RGO中，-OH（3426 cm^-1）和O-H弯曲峰振动（1400 cm^-1）明显增强，是由于在SCX8中引入了-OH引起的，同时也存在CH₂（3190 cm^-1）的伸缩峰。此外，在1167和1040 cm^-1处出现典型的-SO₃-，这意味着SCX8分子被成功负载到RGO上。因此，红外光谱结果说明复合物中含有SCX8的特征红外峰（图4），证明材料复合成功。热重分析结果也表明在相同温度下，复合物的失重比RGO要大得多（图5），表明SCX8作为有机物和RGO成功复合。从透射电镜图中可以看出，RGO-SCX8复合材料为片层结构。同时，经过还原反应，可以看到SCX8-RGO表面存在粒径约为10 nm左右的颗粒（图6），证明金纳米粒子已经成功地修饰到SCX8-RGO表面。在丝网印刷电极上修饰或负载上各种材料之后，其阻抗发生了变化，由此来判断修饰是否成功。

4、电化学传感器的构建

以CCND2基因的长3’UTR (CCND2-L) 和短的3’UTR (CCND2-S)为研究对象，用所构建的传感器对其进行了定量检测；由于CCND2基因中APA信号位点的选取不同，可产生分别带有长和短3’UTR的CCND2转录本CCND2-L和CCND2-S。我们首先从NCBI数据库中下载到人的Dicer1基因序列（GenBank No. NG_016311.1），然后根据基因3’UTR序列中的APA多聚腺苷酸化位点（AAUAAA），获得CCND2-L和CCND2-S转录本的序列，然后使用Primer5.0软件设计扩增这些不同转录本的实时定量PCR（qPCR）的引物（图7），并把引物放入UCSC（http://genome.ucsc.edu）数据库中在人的基因组中blast，当结果显示为特异性扩增目的片段时选用该引物并开展qPCR实验。同时，截取qPCR反应获得的扩增子amplicon中40 nt的序列作为电化学传感器构建用的捕获探针序列（Capture probe，CP），并在NCBI数据（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上检测探针的特异性。根据碱基互补配对原理设计，CP与目标RNA的部分序列互补，目标RNA另一部分序列则与信号探针（Label probe，LP）互补配对。信号探针LP与带有电信号物质TB的超分子复合材料相结合，辅助探针（Auxiliary probe，AP）将带有信号探针LP的超分子复合材料进行串联，从而达到信号放大的目的（图8）。本发明用丝网印刷电极进行检测；丝网印刷电可以减小人为误差，降低背景电信号值；所有步骤均在0.5mL离心管中完成。引入磁性材料Fe₃O₄以便分离。Au@Fe₃O₄作为金属纳米粒子不仅有增加导电率，增大表面积的作用，还能与带有-SH的捕获探针CP相连（图7、8）。

（1）构建检测CCND2-L和CCND2-S不同转录本的传感器序列，包括目标RNA（TargetRNA）、捕获探针（CP-S/L）、信号标记探针（LP-S/L）、辅助探针（AP-S/L），探针用灭菌水稀释；

其中捕获探针序列为CP-S：GACGCGTCTCTCTCTTTCGG - (CH₂)₆-SH；CP-L：AAGGCAGCTGACTATATCAT- (CH₂)₆-SH；

目标RNA为CCND2基因的长3’UTR (CCND2-L) 和短的3’UTR (CCND2-S)，CCND2-L序列为：ATGATATAGTCAGCTGCCTTTTAAGAGGTCTTATCTGTTC；CCND2-S序列为CCGAAAGAGAGAGACGCGTCCATAATCTGGTCTCTTCTTC；

信号探针（LP-S）序列为：TACTCCCCCAGGTGCGAAGAAGAGACCAGATTATG- (CH₂)₆-SH；LP-L：TACTCCCCCAGGTGCGAACAGATAAGACCTCTTAA- (CH₂)₆-SH；

辅助探针（AP-S）序列为：GCACCTGGGGGAGTACATAATCTGGTCTCTTCTTC；AP-L：GCACCTGGGGGAGTATTAAGAGGTCTTATCTGTTC。

（2）将10 mg Au@Fe₃O₄复合物超声分散在10 mL缓冲液Ⅰ（含有10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、300 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl₂的溶液）中，并加入捕获探针（CP），捕获探针在缓冲液Ⅰ中浓度为10 μmol/L，在4℃的条件下放置12小时，磁铁分离；然后在固体加入缓冲液Ⅰ和己硫醇，固体在缓冲液Ⅰ中的浓度为1 mg/mL，己硫醇在缓冲液Ⅰ中浓度为5mmol/L，己硫醇用来封闭非特异性位点，室温放置30min后，用磁铁分离，在分离后固体中加入缓冲液Ⅱ（含有10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/LEDTA、300 mmol/L NaCl、1 mmol/L TCEP的溶液）和浓度范围在10^-18 ~10^-9 mol/L的不同浓度目标RNA，分离后固体在缓冲液Ⅱ中的浓度是2 mg/mL；室温下放置2小时后磁铁分离，在分离的固体中依次加入信号探针（LP）、辅助探针（AP）和Au@RGO-SCX8-TB复合物分散液，室温下放置2小时后磁铁分离，将固体分散在磷酸缓冲液（pH=7）中，取磷酸缓冲液分散液滴于并覆盖在丝网印刷电极表面，并在电化学工作站上用示差脉冲伏安法确定目标RNA的浓度和峰电流的关系（电信号也可以用循环伏安法或交流伏安法实现），并获得电流强度与RNA浓度的标准曲线，进而完成电化学传感器的构建；其中所述信号探针和辅助探针的初始浓度均为10 μmol/L，每1 mg分离的固体中各添加100 μL的信号探针和辅助探针；Au@RGO-SCX8-TB复合物分散液的浓度为1 mg/mL，每1mg固体中添加1 mL的Au@RGO-SCX8-TB复合物分散液；

图9为不同修饰电极分别在0.1 M KCl:1 mM K₄[Fe(CN)₆] / K₃[Fe(CN)₆]混合溶液中的阻抗图谱；图9A、B分别为CCND2-L和CCND2-S的阻抗图；a: SPCE； b:SPCE / Au@Fe₃O₄；c:SPCE / Au@Fe₃O₄/ CP；d:SPCE / Au@Fe₃O₄ / CP / HT；e:SPCE / Au@Fe₃O₄/CP/HT/Target；f: SPCE / Au@Fe₃O₄ / CP / HT / Target / Au@SCX8-RGO-TB-LP。与a相比，b的阻抗明显降低，是因为Au@Fe₃O₄中Au具有良好的导电性可以促进电子的转移，也进一步说明Au@Fe₃O₄是复合成功的。随着材料的逐步修饰，c、d、e的阻抗是逐渐增大的。但f的阻抗大幅度下降，这是因为Au@SCX8-RGO-TB-LP中含有大量的金纳米粒子增加了电子的转移率。说明生物传感器已被成功构建；本实施例中丝网印刷电极上修饰上的物质的导电性与得到的阻抗值是一致的，由此判断电极的修饰是成功的。

图10是CCND2-L电化学传感器的检出曲线；其中图10A为CCND2-L的DPV检测曲线，DPV扫描范围：0~-0.5V；图10B为CCND2-L的检出曲线；在10^-17-10^-11M浓度范围内，电流强度与样品浓度的线性回归方程为：I（μA）= -0.047 log C - 1.64 ，相关系数R²为0.993，检出限度为9.5 ×10^-18 mol/L。同理，图11A为CCND2-S的DPV检出曲线，图11B为CCND2-S的检出曲线；在10^-18-10^-11 mol/L浓度范围内，其电流强度与样品浓度的线性方程为：I（μA）= -0.086 log C - 2.20，相关系数R²为0.992；计算其检出限度为1.76×10^-19 mol/L。

实施例2：电化学传感器特异性检测

本实施例采用实施例1中的电化学传感器检测1MT-S、2-MT-S和1MT-L、2MT-L四种错配序列；错配序列浓度稀释至10^-10M进行电化学检测；参照实施例步骤4（2）的方法制备复合物磷酸缓冲液分散液，不同在于将目标RNA替换为本实施例中的错配序列，将制得的磷酸缓冲液分散液滴于并覆盖在丝网印刷电极表面，测DPV，DPV扫描范围：0~-0.5V；

其中错配序列分别为：

1MT-S：CCG AAA GAG CGA GAC GCG TC CAT AAT CTG GTC TCT TCT TC；

2MT-S：CCG AAA GAG CAA GAC GCG TC CAT AAT CTG GTC TCT TCT TC；

1MT-L：ATG ATA TAG CCA GCT GCC TT TTA AGA GGT CTT ATC TGT TC；

2MT-L：ATG ATA TAG CAA GCT GCC TT TTA AGA GGT CTT ATC TGT TC；

结果见图12A，图中结果显示对目标 DNA进行一个或两个碱基的突变，检测到四种错配序列所测得的电流强度均很小，基本在0.15 μA左右，而CCND2-L（target-L）、CCND2-S（target-S）、以及肺癌细胞H292及人正常肺细胞Beas-2B中的CCND2-S和CCND2-L序列的电流强度明显远高于4个错配序列，因此结果显示本实施例制得的电化学生物传感器具有较高的特异性。

实施例3：电化学传感器在人肺癌细胞H292及人正常肺细胞Beas-2B中CCND2-S和CCND2-L的检测中的应用

（1）选用人正常肺细胞及人肺癌细胞进行RNA的提取，提取方法如下：

1）除去细胞培养瓶中的培养基，加入1mL PBS清洗细胞，并吸去丢掉；

2）添加0.5 mL Trizol，用手震动5 min，使细胞裂解，将其收集到1.5 mL的离心管中；

3）加入0.1 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置2-3 min；

4）4℃ 12000 rpm离心15 min；（开始准备离心所需新管；准备RNA收集柱；准备酶-RDD混合体系：10 μL DNase I stock solution 和70 μL Buffer RDD）；

5）转移上层清液至新的离心管中，加入等体积的70%乙醇，上下颠倒使其混合均匀（不能离心），使用移液枪吸打9次，并马上开始下一步操作；

6）转移样品至RNeasy Mini收集柱内，小心盖上，室温下8000 g离心15 s，弃液相，重复使用收集柱进行下一步操作；

7）添加350 μL Buffer RW1，8000rpm离心15s，弃掉液相；

8）添加10 μL DNase I stock solution 和70 μL Buffer RDD混合液，室温（20-30℃）放置孵育15 min（准备新的收集管，制胶）；

9）添加350 μL Buffer RW1，8000 rpm离心15 s，弃液相；

10）添加500 μL Buffer RPE，8000 rpm离心15 s，弃液相；

11）添加500 μL Buffer RPE，8000 rpm离心2min，弃液相；

12）使用新的收集管，最大转速离心1 min；

13）添加30-50 μL RNase- free-water至收集柱内薄膜（正中），12000 rpm离心2 min；

14）使用Nanodrop 2000对RNA浓度进行测定及琼脂糖凝胶电泳初步检测RNA质量情况。

（2）采用实施例1步骤4（2）方法制备复合物的磷酸缓冲液分散液，不同在于将目标RNA替换为本实施例步骤（1）中提取的RNA序列，将制得的磷酸缓冲液分散液滴于并覆盖在丝网印刷电极表面，采用示差脉冲伏安法DPV进行检测，扫描范围0~-0.5 V；检测结果为H292L电流强度为-1.0232 μA，H292-S电流强度为-1.2681 μA，Beas-2B-L电流强度为-1.0029 μA，Beas-2B-S电流强度为-1.2193 μA（图12A）；

然后将上述电流强度值带入实施例1步骤4（2）中获得的检出曲线（图10、11）中计算目标RNA的浓度，图12B为人乳腺癌细胞H292和人正常肺细胞Beas-2B中CCND2两种转录本（CCND2-L和CCND2-S）的表达量的电化学检测结果，结果为Beas-2B CCND2-L的浓度为2.15×10^-14 M；Beas-2B CCND2-S的浓度为4.52×10^-12 M；H292 CCND2-L的浓度为5.84×10^-14M；H292 CCND2-S的浓度为1.66×10^-11 M；在人正常细胞及肺癌细胞中，CCND2-S的电流强度明显高于CCND2-L。

采用qPCR法对电化学检测结果进行验证，使用PrimerScript RT reagent Kit 试剂盒完成qPCR实验，具体操作如下：

（1）将实施例3步骤（1）制得的RNA反转录合成cDNA，使用PrimerScript RT reagentKit 试剂盒完成cDNA的制备；

（2）实时荧光定量PCR

1）按以下组分配制qPCR反应体系，总体积20μl（反应液在冰上进行配制，配制过程注意避光）

；

引物序列如下：

；

2）配制完成后混合均匀，再平均分装到96孔板中，盖膜，1500 rpm 离心2 min；

3）采用两步法进行qPCR反应；按照最适反应条件在荧光定量PCR仪上设置下列参数：

；

图13为人乳腺癌细胞H292和人正常肺细胞Beas-2B中CCND2两种转录本（CCND2-L和CCND2-S）表达量的qPCR相对表达量分析结果；可以看出不管是在人正常细胞还是在人肺癌细胞中，CCND2-S的表达量也是明显高于CCND2-L的表达量的；此结果与电化学的检测结果类似。

用本发明构建的电化学传感器测定RNA和APA的结果与传统的qPCR的测定结果一致。但是qPCR一般只用于相对定量，很少用于绝对定量，而本发明中的电化学传感器可以测定RNA的实际浓度，即可以绝对定量。

本发明实施例提供的非编码RNA的电化学检测方法具有更高的灵敏度，可以获得更准确的结果。

序列表

<110> 云南大学

<120> 非编码RNA的电化学传感器的制备方法及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

atgatatagt cagctgcctt ttaagaggtc ttatctgttc 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ccgaaagaga gagacgcgtc cataatctgg tctcttcttc 40

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gacgcgtctc tctctttcgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

aaggcagctg actatatcat 20

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

tactccccca ggtgcgaaga agagaccaga ttatg 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

tactccccca ggtgcgaaca gataagacct cttaa 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

gcacctgggg gagtacataa tctggtctct tcttc 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

gcacctgggg gagtattaag aggtcttatc tgttc 35

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

ccgaaagagc gagacgcgtc cataatctgg tctcttcttc 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

ccgaaagagc aagacgcgtc cataatctgg tctcttcttc 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

atgatatagc cagctgcctt ttaagaggtc ttatctgttc 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

atgatatagc aagctgcctt ttaagaggtc ttatctgttc 40

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

cgaggaacag aagtgcgaag a 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

cgaggaacag aagtgcgaag a 21

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 15

tctccctcct ctgtctcaaa ctg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<400> 16

acctcccttc aactatcatc cca 23

Claims

1.一种非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）四氧化三铁纳米微球的制备

（2）金纳米粒子负载四氧化三铁纳米复合物的制备

将步骤（1）Fe₃O₄纳米微球分散于超纯水中，超声分散均匀后，依次加聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸和抗坏血酸，搅拌，用磁铁分离后得到黑色沉淀，用无水乙醇洗涤后得到Au@Fe₃O₄复合物；

（4）电化学传感器的构建

将Au@Fe₃O₄复合物超声分散在缓冲液Ⅰ中，并加入捕获探针，在4℃的条件下放置5~20小时，磁铁分离，然后在固体加入缓冲液Ⅰ和己硫醇，固体在缓冲液Ⅰ中的浓度为0.5~3 mg/mL，己硫醇用来封闭非特异性位点，室温放置10~40 min后，用磁铁分离，在分离后固体中加入缓冲液Ⅱ和浓度范围在10^-18 ~10^-9 mol/L的目标RNA，分离后固体在缓冲液Ⅱ中的浓度是0.5~5 mg/mL；室温下放置1~2小时后磁铁分离，在分离的固体中依次加入信号探针、辅助探针和Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液，室温下放置1~2小时后磁铁分离，将固体分散在磷酸缓冲液中，取分散液滴于丝网印刷电极表面，并在电化学工作站上用示差脉冲伏安法、循环伏安法或交流伏安法确定目标RNA的浓度和峰电流的关系，并获得电流强度与RNA浓度的标准曲线，进而完成电化学传感器的构建。

2.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（1）中三氯化铁在乙二醇中的质量体积浓度为0.2%~0.5%，水热反应是在120~220℃下反应5~10小时，干燥是在60~100℃下处理6~10小时，乙酸钠与三氯化铁的质量比为3~6:1，聚乙二醇与三氯化铁的质量比为1:2~3:1。

3.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（2）中聚乙二醇400、柠檬酸三钠、氯金酸、抗坏血酸的在超纯水中的浓度分别为0.10~0.25 mg/mL、1~5 mg/mL、2~6 mg/mL、1~6 mg/mL。

4.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（3）中4-磺酸杯[8]芳烃水合物和氧化石墨在去离子水中的质量浓度均为0.1%~0.5%；HAuCl₄的在还原的氧化石墨烯-SCX8复合物分散液中的质量浓度为1%~5%。

5.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（3）中电信号物质为能被4-磺酸杯[8]芳烃水合物识别的电活性物质，每1 mL Au@RGO-SCX8复合物分散液中添加0.2 mg~1mg电信号物质。

6.根据权利要求5所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：电信号物质为甲苯胺蓝、亚甲基蓝或二茂铁。

7.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤（4）中Au@Fe₃O₄复合物在缓冲液Ⅰ中的浓度为0.5~3 mg/mL，捕获探针在缓冲液Ⅰ中浓度为0.5~10μmol/L，己硫醇在缓冲液Ⅰ中浓度为1~5 mmol/L；

信号探针和辅助探针的初始浓度均为10~20 μmol/L，每1 mg分离的固体中各添加100~150 μL的信号探针和辅助探针；Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液的浓度为1~5 mg/mL，每1 mg分离的固体中添加1~1.5 mL的Au@RGO-SCX8-电信号物质复合物分散液。

8.根据权利要求7所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：缓冲液Ⅰ为含有10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、300 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl₂的溶液；缓冲液Ⅱ为含有10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、300 mmol/L NaCl、1 mmol/LTCEP的溶液。

9.根据权利要求1所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法，其特征在于：每0.1mg分离后固体添加2~10 μL浓度范围在10^-18 ~10^-9 mol/L的目标RNA。

10.权利要求1-9任一项所述的非编码RNA的电化学传感器的制备方法制得的电化学传感器在选择性多聚腺苷酸化检测中的应用，其特征在于：用电化学法检测由APA现象所产生的不同长度的3’UTR转录本表达量。