CN111394096A - 基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器及制备方法与应用 - Google Patents

基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器及制备方法与应用，属于法医学技术领域。所述的双发射荧光传感器包括蓝色荧光的碳化硅量子点和红色荧光的金纳米簇，所述碳化硅量子点和金纳米簇在365nm激发下呈现440nm和660nm的两个发射峰值。本发明中双发射SiC/Au NPs荧光探针结合特异性抗菌肽，对口腔细菌有靶向结合作用；在靶菌存在的情况下，双发射SiC/Au NPs荧光探针溶液表现出明显的荧光淬灭，并且其荧光猝灭的程度与荧光试纸条在紫外灯下观察到的颜色变化趋势相对应；此外，该荧光传感器体系还应用于唾液样本中细菌的测量。

Description

基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器及制备方 法与应用
技术领域
本发明属于法医学技术领域，具体涉及一种基于细菌同步检测的双发射SiC/AuNPs荧光传感器及制备方法与应用。
背景技术
唾液斑是犯罪现场最常见的体液样本类型之一，尤其是在性侵犯事件中，可提供有力的证据来证明受害者与嫌疑人之间的联系。最常见的法医唾液鉴定方法，包括α-淀粉酶测试和ELISA技术。然而，测试结果并不总是令人满意。最近，口腔细菌的检测方法因简单有效被作为一种新型方法展开了一系列研究。口腔特异性细菌(如唾液链球菌，血链球菌和微黄奈瑟氏球菌)只存在于口腔中，被认为是法医唾液鉴定的新指标。Nakanishi等人最近报告了一项研究(H.Nakanishi,A.Kido,T.Ohmori,A.Takada,M.Hara,N.Adachi,K.Saito,Anovel method for the identification of saliva by detecting oral streptococciusing PCR,Forensic science international 183(1)(2009)20-23.)，他们采用基于PCR的方法，在模拟法医唾液样本中检出口腔细菌。Jung JY和同事使用real-time PCR和PCR结合免疫色谱条来检测细菌(J.Y.Jung,H.K.Yoon,S.An,J.W.Lee,E.R.Ahn,Y.J.Kim,H.C.Park,K.Lee,J.H.Hwang,S.K.Lim,Rapid oral bacteria detection based on real-time PCR for the forensic identification of saliva,Scientific Reports 8(1)(2018)10852.
J.W.Lee,Y.J.Ju,S.K.Lim,Simple and rapid identification of saliva bydetection of oral streptococci using direct polymerase chain reactioncombined with an immunochromatographic strip,Forensic Science InternationalGenetics 33(2018)155-160.)。其中一项重要发现是，他们发现模拟法医样本中的唾液链球菌和血链球菌与唾液密切相关，并且制定了唾液识别阳性的标准,即同时检测出两种或两种以上口腔细菌时，即可证明唾液阳性。
用经典检测方法(平板计数法)检测唾液样本中的口腔细菌需要相对长的时间(1-3天)。相对快速替代的方法，如免疫测定或核酸(特别是PCR)(J.W.Law,N.S.Ab Mutalib,K.G.Chan,L.H.Lee,Rapid methods for the detection of foodborne bacterialpathogens:principles,applications,advantages and limitations,Frontiers inMicrobiology 5(770)(2015)770.)是识别细菌的有力技术，但仍需16-48小时的细菌培养以及复杂的样本前处理操作(H.Saida,N.S.H.J.A.Ytow,E.Microbiology,Photometricapplication of the Gram stain method to characterize naturalbacterialpopulations in aquatic environments,64(2)(1998)742-747.)。
荧光传感器技术在细菌检测方面具有快速、灵敏度高和选择性好等优点(A.Roda,M.Mirasoli,B.Roda,F.Bonvicini,C.Colliva,P.Reschiglian,Recent developments inrapid multiplexed bioanalytical methods for foodborne pathogenic bacteriadetection,Microchimica Acta 178(1-2)(2012)7-28.)，由此引起了学者们的广泛关注，比如，Elahi N的团队(E.N,K.M,B.MH,A.B,A fluorescence Nano-biosensorsimmobilization on Iron(MNPs)and gold(AuNPs)nanoparticles for detection ofShigella spp,Materials science&engineering.C,Materials for biologicalapplications 105(undefined)(2019)110113.)开发了一种基于DNA探针和金纳米粒子的荧光纳米生物传感器，用于细菌志贺氏菌的检测，可以检测出低浓度细菌(102cfu mL-1)。此外，Birui Jin等(B.Jin,S.Wang,M.Lin,Y.Jin,S.Zhang,X.Cui,Y.Gong,A.Li,F.Xu,T.J.J.B.Lu,Bioelectronics,Upconversion nanoparticles based FRET aptasensorfor rapid and ultrasenstive bacteria detection,90(2017)525.)研究了一种基于上转换荧光纳米粒子的新型适配体传感器，在食物和水样中快速和超灵敏地检测大肠杆菌，整个反应时间在20分钟内。综合以上，基于荧光传感器的方法可能是一种有效的细菌检测方式，然而用于口腔细菌检测鲜有报道。
单一荧光传感器同时检测两种细菌需要不同的检测方法和实验条件，这使得检测过程更加复杂和耗时。正如Jung JY等人提出的上述标准(J.Y.Jung,H.K.Yoon,S.An,J.W.Lee,E.R.Ahn,Y.J.Kim,H.C.Park,K.Lee,J.H.Hwang,S.K.J.S.R.Lim,Rapid oralbacteria detection based on real-time PCR for the forensic identification ofsaliva,8(1)(2018)10852-.)，唾液的阳性结果需要检测出两种或两种以上靶菌。在此研究中，我们开发了一种双发射荧光纸传感器，同步化和视觉化测定唾液中的口腔细菌(唾液链球菌和血链球菌)。
发明内容
本发明通过提供一种基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器及制备方法与应用，以解决目前单一荧光传感器无法同时检测两种口腔细菌的技术问题。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：
一种基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器，所述荧光传感器包括蓝色荧光的碳化硅量子点和红色荧光的金纳米簇，所述碳化硅量子点和金纳米簇在365nm的激发下出现440nm和660nm的两个发射峰值。
一种基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)碳化硅量子点的制备：称取碳化硅粉末加入到蒸馏水中，用氨水调节pH为9-12，混合搅匀，将以上混合物放入到聚四氟乙烯反应釜，加热反应8-13h后透析过滤，即可得到纯化的碳化硅量子点；
(2)金纳米簇的制备：将氯金酸溶液添加到牛血清蛋白溶液中，在36-38℃下进行剧烈搅拌，然后加入氢氧化钠溶液将pH值调整到11-13，并在36-38℃加热12-16h后，取上清液用微孔膜进行过滤，即得金纳米簇；
(3)抗菌肽与纳米探针的结合：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺添加到碳化硅量子点溶液中，以激活在碳化硅量子点表面呈现的羧基基团，激活的碳化硅量子点与-NH2改性抗菌肽1经共价键连接，将形成的混合物在室温下在黑暗中搅拌0.5-2h，然后将混合物取出用透析袋进行透析，得到SiC-AMP1；将抗菌肽2加入到AuNCs溶液中，带有-SH末端的抗菌肽2溶液与AuNCs通过Au-S键作用结合到一起，得到的复合物样品为Au-AMP2；
(4)双发射荧光传感器SiC/Au NPs的自组装：将步骤(3)制备的SiC-AMP1与Au-AMP2溶液在室温下混合后，缓慢搅拌，然后离心，收集沉淀物，用去离子水洗涤，即获得双发射SiC/Au NPs荧光探针，于4℃保存待用。
优选地，所述氯金酸溶液浓度为5-10mM，牛血清蛋白(BSA)浓度为50-150mg/mL，氢氧化钠溶液浓度为1M-5M。
优选地，所述步骤(3)中-NH2改性抗菌肽1以及带有-SH末端的抗菌肽2溶液的浓度为0.1-1mg/mL。
优选地，所述步骤(4)所述的SiC-AMP1与Au-AMP2溶液混合体积比为3:7-7:3。
一种基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的应用，所述双发射荧光传感器在检测口腔细菌及其在法医唾液鉴定中的应用。
优选地，双发射荧光传感器用于检测口腔细菌的方法包括以下步骤：
S1：标准溶液中口腔细菌的检测：配置不同浓度的口腔细菌溶液，将其加入到结合多肽的双发射荧光探针溶液中，反应0.1-6h后分别测量其波长在440nm和660nm处的荧光强度，绘制两种细菌浓度与荧光强度的线性关系，制得标准溶液曲线，从而实现标准溶液中口腔细菌的检测；
S2：唾液样本中口腔细菌的检测：制备唾液样品，唾液样品中添加不同浓度的口腔细菌，每个样品分别进行3个平行试验，向双发射SiC/Au NPs荧光探针中加入人体唾液样品，反应0.1-6h后测量其波长在440nm和660nm处的荧光强度，通过反应前后的荧光强度对比，建立用于两种细菌检测的标准工作曲线，从而实现唾液样本中口腔细菌的同步检测。
优选地，双发射荧光传感器用于法医唾液鉴定的方法为：收集法医实际案例中的唾液、血液、尿液、阴道液样本，进行预处理后，通过双发射SiC/Au NPs荧光探针对不同体液样本中口腔特异细菌定性定量检测，当两种口腔细菌被同时检测，即唾液样本呈现阳性结果，从而从众多法医体液样本中鉴别出唾液。
本发明的有益效果是：
1.本发明中荧光传感器由蓝色荧光的SiC Qds和红色荧光的AuNC构建，纳米粒子(NPs)在365nm的单波长激发下具有440nm和660nm的两个发射峰值。双发射SiC/Au NPs荧光探针结合抗菌肽(AMPs)，对口腔细菌有特异性结合作用；在靶菌存在的情况下，双发射SiC/Au NPs荧光探针溶液表现出明显的荧光淬灭，并且其荧光猝灭的程度与荧光试纸条肉眼观察到的颜色变化趋势相对应；此外，该荧光传感器体系还应用于唾液样本中细菌的测量。
2.本发明构建的荧光传感器可以快速、简便的用于法医样本中微生物含量的定量分析，荧光信号可在50cfu/mL到1.0×107cfu/mL浓度范围内实现对口腔细菌的定量响应，具有灵敏度高、线性范围宽、无须样品预处理、检测速度快、成本低廉等优良分析性能，很好克服了传统方法操作繁琐、反应时间长，灵敏度低等缺陷。
3.本发明的基于SiC Qds和Au NCs的双发射荧光纳米探针，制备方法简单，所用试剂均为普通的化学试剂安全无毒，环保无污染，原料廉价，能够广泛应用。
4、本发明不仅可以实现细菌的同步检测，而且可以可视化的试纸条检测，操作简单，灵敏，快速高效等优良分析性能，在法医微生物检测及法医唾液鉴定检测领域中具有很好的实用前景。
附图说明
图1是本发明流程示意图。
图2是实施例1中双发射SiC/Au NPs荧光探针的荧光光谱图。
图3是不同浓度唾液链球菌(波长为440nm)和血链球菌(波长为660nm)存在下体系的荧光强度变化(50-106cfu mL-1)。插图为双发射探针SiC/Au NPs检测两种目标菌在紫外灯照射下的照片。
图4是根据图3得出的目标唾液链球菌与体系相对荧光强度的关系。
图5是根据图3得出的目标血链球菌与体系相对荧光强度的关系。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提供一种基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器，所述荧光传感器包括蓝色荧光的碳化硅量子点和红色荧光的金纳米簇，所述碳化硅量子点和金纳米簇在365nm的单波长激发下具有440nm和660nm的两个发射峰值。
本发明的工作原理是：建立一种双发射荧光传感器同时检测唾液中两个目标细菌。为了制备双发射荧光传感器，选择带有蓝色荧光的SiC Qds和具有红色荧光的AuNCs，由于其良好的光稳定性和高量子产量，在365nm的激发下，用AMP1(唾液链球菌的抗菌肽)修饰的SiC Qds在440nm处显示发射峰，用AMP2(血链球菌的抗菌肽)修饰的AuNCs在660nm时显示出发射峰，它们都是进一步用于捕获和量化唾液链球菌和血链球菌。在优化条件参数后，评价了该方法的选择性、灵敏度和特异性。荧光试纸条分别用荧光SiC Qds和Au NCs溶液浸泡制备，进一步检测出人体唾液样本中的细菌，颜色变化与荧光光谱的荧光信号变化一致。
具体的如图1所示，以上所述的基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)碳化硅量子点的制备：称取碳化硅粉末加入到蒸馏水中，超声10-30min，用氨水调节pH为9-12，混合搅匀，将以上混合物放入到聚四氟乙烯反应釜，在140℃条件下加热反应8-13h后透析过滤，即可得到纯化的碳化硅量子点；
(2)金纳米簇的制备：将浓度为5-10mM的氯金酸溶液添加到浓度为50-150mg/mL牛血清蛋白溶液中，在36-38℃下进行磁性搅拌10min，转速为400r/min，然后加入浓度为1M-5M的氢氧化钠溶液将pH值调整到11-13，并在36-38℃加热12-16h后，取上清液用0.22μm微孔膜进行过滤，即得金纳米簇；
(3)抗菌肽与纳米探针的结合：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)添加到碳化硅量子点溶液中，以激活在碳化硅量子点表面呈现的羧基基团，激活的碳化硅量子点与浓度为0.1-1mg/mL的-NH2改性抗菌肽1经共价键连接，将形成的混合物在室温下在黑暗中搅拌0.5-2h，然后将混合物取出用透析袋进行透析，得到SiC-AMP1；将抗菌肽2加入到AuNCs溶液中，带有-SH末端的浓度为0.1-1mg/mL的抗菌肽2溶液与AuNCs通过Au-S键作用结合到一起，得到的复合物样品为Au-AMP2；
(4)双发射荧光传感器SiC/Au NPs的自组装：将步骤(3)制备的SiC-AMP1与Au-AMP2溶液在室温下以体积比为3:7-7:3的比例混合后，以100r/min的速度搅拌，然后离心，收集沉淀物，用去离子水洗涤，即获得双发射SiC/Au NPs荧光探针，于4℃保存待用。
进一步地，双发射荧光传感器用于检测口腔细菌的方法包括以下步骤：
S1：标准溶液中口腔细菌的检测：配置不同浓度的口腔细菌溶液，将其加入到NPs-AMP双发射荧光探针中，反应0.1-6h后分别测量其波长在440nm和660nm处的荧光强度，绘制两种细菌浓度与荧光强度的线性关系，制得标准曲线，从而实现标准溶液中口腔细菌的检测；
S2：唾液样本中口腔细菌的检测：制备唾液样品，唾液样品中添加不同浓度的口腔细菌，每个样品分别进行3个平行试验，向双发射SiC/Au NPs荧光探针中加入人体唾液样品，反应0.1-6h后测量其波长在440nm和660nm处的荧光强度，通过反应前后的荧光强度对比，建立用于两种细菌检测的标准工作曲线，从而实现唾液样本中口腔细菌的同步检测。
进一步地，双发射荧光传感器用于法医唾液鉴定的方法为：收集法医实际案例中的唾液、血液、尿液、阴道液样本，进行预处理后，通过双发射SiC/Au NPs荧光探针对不同体液样本中口腔特异细菌定性定量检测，当两种口腔细菌被同时检测，即唾液样本呈现阳性结果，从而能够从众多法医体液样本中鉴别出唾液。
实施例1
基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)碳化硅量子点的制备：称取60mg碳化硅粉末加入到30ml蒸馏水中，超声15min，用氨水调节pH为10，混合搅匀，将以上混合物放入到聚四氟乙烯反应釜，在140℃条件下加热反应11h后透析过滤，即可得到纯化的碳化硅量子点；
(2)金纳米簇的制备：将5mL浓度为6mM的氯金酸溶液添加到5mL浓度为70mg/mL牛血清蛋白溶液中，在36℃下进行磁性搅拌10min，转速400r/min，然后加入浓度为2M的氢氧化钠溶液将pH值调整到11，并在36℃加热13h后，取上清液用0.22μm微孔膜进行过滤，即得金纳米簇；
(3)抗菌肽与纳米探针的结合：将5.0mgEDC和4.6mgNHS添加到0.8mL碳化硅量子点(SiC Qds)溶液中30min，以激活在碳化硅量子点(SiC Qds)表面呈现的羧基基团，激活的Qds与-NH2改性抗菌肽1经共价连接(COOH-NH2)形成的混合物在室温下在黑暗中搅拌1h，然后将混合物取出用透析袋进行24小时透析，得到SiC-AMP1；将抗菌肽2加入到AuNCs溶液中，带有-SH末端的浓度为0.1-1mg/mL的抗菌肽2溶液与AuNCs通过Au-S键作用结合到一起，得到的复合物样品为Au-AMP2；
本实例中所用的抗菌肽序列为多肽序列列表ID No.所示序列(GLLWHLLHHLLH-NH2)和(K-Acp-acp-acp-RRRRSVQWSA-SH)。
(4)双发射荧光传感器SiC/Au NPs的自组装：将步骤(3)制备的SiC-AMP1与Au-AMP2溶液在室温下以体积比为3:7的比例混合后，以100r/min的速度搅拌3h，然后在3000rpm转速下离心50min，收集沉淀物，用去离子水洗涤三次，即获得双发射SiC/Au NPs荧光探针，于4℃保存待用。
(5)标准溶液中口腔细菌的检测：向步骤(4)制备的双发射SiC/Au NPs荧光探针溶液滴加不同浓度的两种口腔细菌标准溶液，室温下孵育20min后，加入到比色皿中，通过荧光分光光度计在激发为440nm和660nm的位置下分别记录其荧光强度值，从而实现在标准溶液中口腔细菌的检测；
(6)唾液样品中口腔细菌的检测：收集并制备唾液样品，唾液样品中添加不同浓度的口腔细菌，每个样品分别进行3个平行试验，向步骤(4)中制备好的双发射SiC/Au NPs荧光探针中加入含有添加口腔细菌的唾液样品，室温下孵育反应20min后，加入到比色皿中，通过荧光分光光度计在激发为440nm和660nm的位置下分别记录其荧光强度值，从而实现唾液溶液中两种口腔细菌的同步检测；
(7)法医唾液样本的鉴别：收集法医实际案例中的唾液、血液、尿液、阴道液样本，进行简单的预处理后，通过该荧光传感器对不同体液样本中口腔特异细菌定性、定量检测，当两种口腔细菌被同时检测，即证明唾液样本呈现阳性结果，从而从众多法医体液样本中鉴别出唾液。
实施例2
基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)碳化硅量子点的制备：称取70mg碳化硅粉末加入到35ml蒸馏水中，超声30min，用氨水调节pH为12，混合搅匀，将以上混合物放入到聚四氟乙烯反应釜，在140℃条件下加热反应13h后透析过滤，即可得到纯化的碳化硅量子点；
(2)金纳米簇的制备：将6mL浓度为8mM的氯金酸溶液添加到6mL浓度为120mg/mL牛血清蛋白溶液中，在37℃下进行磁性搅拌10min，速度为400r/min，然后加入浓度为1M-5M的氢氧化钠溶液将pH值调整到11-13，并在37℃加热15h后，取上清液用0.22μm微孔膜进行过滤，即得金纳米簇；
(3)抗菌肽与纳米探针的结合：将5.0mgEDC和4.6mgNHS添加到0.8mL碳化硅量子点(SiC Qds)溶液中30min，以激活在碳化硅量子点(SiC Qds)表面呈现的羧基基团，激活的Qds与-NH2改性抗菌肽1经共价连接(COOH-NH2)形成的混合物在室温下在黑暗中搅拌1.5h，然后将混合物取出用透析袋进行24小时透析，得到SiC-AMP1；将抗菌肽2加入到AuNCs溶液中，带有-SH末端的浓度为0.1-1mg/mL的抗菌肽2溶液与AuNCs通过Au-S键作用结合到一起，得到的复合物样品为Au-AMP2；
本实例中所用的抗菌肽序列为多肽序列列表ID No.所示序列(GLLWHLLHHLLH-COOH)和(K-Acp-acp-acp-RRRRSVQWSA-SH)。
(4)双发射荧光传感器SiC/Au NPs的自组装：将步骤(3)制备的SiC-AMP1与Au-AMP2溶液在室温下以体积比为7:3的比例混合后，以100r/min的速度缓慢搅拌8h，然后在8000rpm转速下离心15min，收集沉淀物，用去离子水洗涤三次，即获得双发射SiC/Au NPs荧光探针，于4℃保存待用。
(5)标准溶液中口腔细菌的检测：向步骤(4)制备的双发射SiC/Au NPs荧光探针溶液滴加不同浓度的两种口腔细菌标准溶液，室温下孵育20min后，加入到比色皿中，通过荧光分光光度计在激发为440nm和660nm的位置下分别记录其荧光强度值，从而实现在标准溶液中口腔细菌的检测；
(6)唾液样品中口腔细菌的检测：收集并制备唾液样品，唾液样品中添加不同浓度的口腔细菌，每个样品分别进行3个平行试验，向步骤(4)中制备好的双发射SiC/Au NPs荧光探针中加入含有添加口腔细菌的唾液样品，室温下孵育反应20min后，加入到比色皿中，通过荧光分光光度计在激发为440nm和660nm的位置下分别记录其荧光强度值，从而实现唾液溶液中两种口腔细菌的同步检测；
(7)法医唾液样本的鉴别：收集法医实际案例中的唾液、血液、尿液、阴道液样本，进行简单的预处理后，通过该荧光传感器对不同体液样本中口腔特异细菌定性、定量检测，当两种口腔细菌被同时检测，即证明唾液样本呈现阳性结果，并且与唾液鉴定经典方法的检测结果保持一致，从而从众多法医体液样本中鉴别出唾液。
试验案例
试验例1
将实施例1制备的双发射SiC/Au NPs荧光探针溶液加入到比色皿中，在常温下用荧光分光光度计检测，设置参数为365nm处激发，记录440nm和660nm处的荧光信号。
实验结果如图2所示，双发射SiC/Au NPs荧光探针的荧光光谱激发波长约为365nm，在440nm和660nm处观察到两个发射峰，分别完全对应于SiC Qds和AuNCs的蓝色和红色荧光。在紫外灯下，SiC Qds和Au NCs分别发出强烈的蓝色和红色荧光，而SiC-Au NP的荧光显示为暗紫荧光。这些结果证明成功制备了SiC Qds，AuNCs和SiC-Au NP。
试验例2
为了验证本发明中实施例1和实施例2用于唾液检测的实际可靠性，开展了回收率实验，添加已知的不同浓度口腔细菌在唾液中，之后通过实施例1和实施例2方法计算得到的浓度和已知浓度进行对照，试验结果见表1。
表1回收率检测试验结果
Figure BDA0002441785970000131
以上结果说明本发明方法在实际样本中具有较好的准确测定结果。
试验例3
两种口腔细菌同步检测的实验方法：
(1)首先按照实施例2所述的细菌培养方法培养两种目标细菌，其次取活化培养后的两种菌，再用PBS将两种菌梯度稀释成50、102、103、104、105和106cfu/mL。取相同梯度下的两种菌等体积混合，得到两种菌的混合样本。在双发射SiC/Au NPs荧光探针溶液里加入混合样本，混合均匀后，孵育20min，用PBS代替菌液作为空白对照组。采用F-7400荧光光谱仪测量最终混合物的荧光信号，空白记作F0，反应后的溶液为F。然后检测荧光强度每个样本。根据相对荧光强度(F0-F)与两种目标菌之间的关系建立同步定量检测方程。
(2)荧光试纸的制备和传感应用
在这项研究中，我们利用普通的纤维滤纸(购自杭州富阳新兴纸业公司)来制造用于细菌检测的纸基传感器。一次将许多纸条切成小块，大小和厚度一致。将小纸片分别浸入准备好的SiC-AMP1和Au-AMP2溶液中10分钟，然后在40℃的烤箱中干燥30min。干燥后，将固定有SiC-AMP1和Au-AMP2的纸张用作用于细菌检测的基于纸张的视觉化传感器。然后，在环境温度下口腔细菌溶液加入到荧光试纸条上，静置2min。然后在紫外光(λex＝365nm)下观察荧光试纸，用iPad mini 3(苹果公司，美国)拍照记录。
(3)实际样本检测
取自法医实验室的唾液，血清，尿液和精液样品按照与人类唾液样品相同的方法进行处理。根据反应结果，通过本发明提及的方法和α-淀粉酶试验这两种方法计算出样品的检测量。所有实验重复三次。
(4)结果分析
如图3所示，将包含唾液链球菌和血链球菌的混合样本加入到双发射SiC/Au NPs荧光探针中后，由于抗菌肽与细菌的特异性相互作用而引发的荧光光谱变化。当细菌数目从50增加到106cfu/mL时，两个位置的荧光发射峰的强度呈现不断下降的趋势。同时插图中显示的试纸条变化，左侧为SiC-AMP1检测唾液链球菌的试纸条颜色变化，肉眼可见，试纸条显示从深蓝色至浅蓝色荧光，这与SiC-AMP1对唾液链球菌的荧光光谱响应一致。右侧为Au-AMP2试纸条对血链球菌的响应的颜色变化，试纸随着血链球菌浓度的增加而逐渐显示出深紫色到浅紫色的荧光变化，这进一步表明试纸上颜色的变化是由于血链球菌对Au-AMP2的紫色荧光的猝灭所致。
在不同细菌浓度下，唾液链球菌在蓝色荧光和血链球菌在红色荧光分别显示不同的颜色，从而实现同步化、可视化比色检测目标细菌。
图4与图5是根据两种菌对应的荧光发射峰的体系相对递减的荧光强度与细菌数目之间呈现的变化关系，建立的检测两种菌的线性方程。对两种菌的数目分别取以10为底的对数(log cfu/mL)，以得到的细菌数为X,以440nm和660nm处的相对荧光强度(F0-F)为Y，分别建立线性方程。检测唾液链球菌和血链球菌的线性方程分别为：Y＝-724.8log X+4223(R2＝0.9813)和Y＝-716.0log X+4429(R2＝0.9948)。这里值得说明的是，整个过程可以在20分钟内完成。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器，其特征在于，所述荧光传感器包括蓝色荧光的碳化硅量子点和红色荧光的金纳米簇，所述碳化硅量子点和金纳米簇在365nm激发下具有440nm和660nm的两个发射峰值。
2.一种根据权利要求1所述的基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)碳化硅量子点的制备：称取碳化硅粉末加入到蒸馏水中，用氨水调节pH为9-12，混合搅匀，将以上混合物放入到聚四氟乙烯反应釜，加热反应8-13h后透析过滤，即可得到纯化的碳化硅量子点；
(2)金纳米簇的制备：将氯金酸溶液添加到牛血清蛋白溶液中，在36-38℃下进行磁性搅拌，然后加入氢氧化钠溶液将pH值调整到11-13，并在36-38℃加热12-16h后，取上清液用微孔膜进行过滤，即得金纳米簇；
(3)抗菌肽与纳米探针的结合：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺添加到碳化硅量子点溶液中，以激活在碳化硅量子点表面呈现的羧基基团，激活的碳化硅量子点与-NH2改性抗菌肽1经共价键连接，将形成的混合物在室温下在黑暗中搅拌0.5-2h，然后将混合物取出用透析袋进行透析，得到SiC-AMP1；将抗菌肽2加入到AuNCs溶液中，带有-SH末端的抗菌肽2溶液与AuNCs通过Au-S键作用结合到一起，得到的复合物样品为Au-AMP2；
(4)双发射荧光传感器SiC/Au NPs的自组装：将步骤(3)制备的SiC-AMP1与Au-AMP2溶液在室温下混合后，缓慢搅拌，然后离心，收集沉淀物，用去离子水洗涤，即获得双发射SiC/Au NPs荧光探针，于4℃保存待用。
3.根据权利要求2所述的基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的制备方法，其特征在于，所述氯金酸溶液浓度为5-10mM，牛血清蛋白浓度为50-150mg/mL，氢氧化钠溶液浓度为1M-5M。
4.根据权利要求2所述的基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中-NH2改性抗菌肽1以及带有-SH末端的抗菌肽2溶液的浓度为0.1-1mg/mL。
5.根据权利要求2所述的基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的SiC-AMP1与Au-AMP2溶液混合体积比为3:7-7:3。
6.一种基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的应用，其特征在于，所述双发射荧光传感器在检测口腔细菌及其在法医唾液鉴定中的应用。
7.根据权利要求6所述的基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的应用，其特征在于，用于检测口腔细菌的方法包括以下步骤：
S1：标准溶液中口腔细菌的检测：配置不同浓度的口腔细菌溶液，将其加入到双发射SiC/Au NPs荧光探针溶液中，反应0.1-6h分别测量其波长在440nm和660nm处的荧光强度，绘制两种细菌浓度与荧光强度的线性关系，制得标准溶液曲线，从而实现标准溶液中口腔细菌的检测；
S2：唾液样本中口腔细菌的检测：制备唾液样品，唾液样品中添加不同浓度的口腔细菌，每个样品分别进行3个平行试验，向双发射SiC/Au NPs荧光探针中加入人体唾液样品，反应0.1-6h后测量其波长在440nm和660nm处的荧光强度，通过反应前后的荧光强度对比，建立用于两种细菌检测的标准工作曲线，从而实现唾液样本中口腔细菌的同步检测。
8.根据权利要求7所述的基于细菌同步检测的双发射SiC/Au NPs荧光传感器的应用，其特征在于，用于法医唾液鉴定的方法为：收集法医实际案例中的唾液、血液、尿液、阴道液样本，进行预处理后，通过双发射SiC/Au NPs荧光探针对不同体液样本中口腔特异细菌定性定量检测，当两种口腔细菌被同时检测，即唾液样本呈现阳性结果，从而能够从众多法医体液样本中鉴别出唾液。
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