CN113981119B - 一种乳酪中单增李斯特菌的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乳酪中单增李斯特菌的检测方法及特异性检测方法，属于微生物检测技术和前处理技术领域。该方法将提取的单增李斯特菌的DNA进行链置换扩增，扩增所用的引物P1与P2的5＇端分别修饰FITC‑与BIO‑，然后将扩增过后的产物首先与链霉亲和素修饰的羧基化的磁珠相连接，再与AuMB@Ag‑FITC抗体相连接，最后在785 nm波长下，功率为25 mw下进行表面拉曼散射，达到特异性识别单增李斯特菌的目的。该发明基于夹心法策略，实现同步识别单增李斯特菌，简化操作步骤，极大的缩短了反应时间，并且通过拉曼光谱1616 cm‑1处的信号峰值进而检测单增李斯特菌，在匹配了有效的反应条件后，使检测灵敏性提高至101 CFU/mL，减小了样品中其他基质的干扰、提升检测效率，具有非常好的应用推广前景。

Description

一种乳酪中单增李斯特菌的检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术和前处理技术领域，具体涉及一种基于链置换扩增的表面拉曼散射检测单增李斯特菌的方法。
背景技术
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是一种革兰氏阳性菌，与其他大多数致病菌不同的是它在低温、酸性及高盐浓度下具有一定的抗性，并且容易形成生物膜导致食品被持续性污染，为干酪、再生干酪、熟肉制品与即食食品等重点防控对象。
传统的细菌检测方法主要通过前增菌、选择性增菌、显色培养基富集及生化鉴定，通常需要一周左右；免疫学检测主要基于抗原与抗体特异性反应，其中ELISA试剂盒的检测是食品安全中最常见的检测方法，目标细菌被固定抗体所捕获，并与第二抗体结合形成三明治结构，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。ELISA试剂盒的检测灵敏度低且易被干扰，假阳性率也较高；聚合酶链式反应可以在几小时内将低水平的目标DNA扩增到可检测的水平，但需要昂贵的仪器和专业技术人员进行操作，现场应用受到了很大的限制。
新兴的链置换扩增（sequence exchange amplification，SEA）方法是PCR的重要补充，链置换扩增反应依靠DNA双链在特定温度下的动态解离能力，其允许碱基对的局部打开，从而产生单链变性气泡，然后通过一个短的核苷酸引物侵入变形泡，使得DNA聚合酶获得延伸。表面增强拉曼光谱（SERS）与普通的拉曼光谱的不同之处在于使用金、银等使得信号强度得到8-10个数量级的增强。SERS检测生物传感器具有灵敏、快速、稳定等优点，是未来致病菌检测的一种行之有效且具有广阔发展前景的方法。
近年来，分子印迹、适配体等分子识别技术的开发降低了检测成本，同时，金、银等贵重金属纳米颗粒的开发运用，使得拉曼信号大大增强，本发明利用链置换扩增核酸的特异性与SERS超灵敏的分析能力从而对目标DNA进行简单、灵敏的检测，DNA扩增产物分别与AuMB@Ag-FITC抗体连接、链霉亲和素连接可以限制假阳性结果，从而大大提高了检测的特异性和可靠性。
发明内容
为了提高检测稳定性、降低检测成本、简化检测步骤，本发明提供一种乳酪中单增李斯特菌的检测方法，同时提供一种乳酪中单增李斯特菌的特异性检测方法。
一种乳酪中单增李斯特菌的检测操作步骤如下：
（1）提取乳酪中单增李斯特菌的DNA
用细菌DNA提取试剂盒，提取乳酪中单增李斯特菌的DNA；
（2）扩增
使用一对扩增引物对步骤（1）提取的DNA进行扩增；
一对引物的序列为：
Primer 1：FITC-GTCATTGGAAACTGGAAGACTG
Primer 2：Bio-CCACTCTCCTCTTCTGCAC
所述引物专门针对单增李斯特菌设计；
在扩增引物Primer 1的5＇端修饰异硫氰酸荧光素（FITC-）、在引物Primer 2的5＇端修饰生物素（BIO-），接着进行琼脂糖凝胶电泳；
所述琼脂糖凝胶为浓度1.5 %的琼脂糖凝胶，电压为120 V，电泳时间35 min；得到链置换扩增产物；
（3）制备链霉亲和素修饰的磁珠
取100 μL浓度 30 mg/mL的磁珠溶液，加入50 μL浓度10 mg/mL的N-（3-二甲基氨基丙基）-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液、50 μL浓度10 mg/mL N，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液，于离心管中避光室温活化30 min，磁性分离去上清，加入5 μL浓度5 mg/mL的链霉亲和素，反应3 h；加入 质量浓度10 %的牛血清蛋白溶液，反应1 h，磁性分离去上清；再用无菌水清洗磁珠，去除未结合的链霉亲和素，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，得到浓度30 mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠溶液；
（4）制备金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体
取1 mL金纳米粒子（ AuNPs）溶液，加入5 μL浓度3.73 mg/mL的的亚甲基蓝溶液，加入100 μL浓度11 mg/mL的L-抗坏血酸溶液；
于超声功率100 W条件下超声处理20 s，同时加入400 μL质量浓度1 %的硝酸银（AgNO3）溶液；
加入4 μL浓度1 mg/mL的异硫氰酸荧光素（FITC）抗体，偶联1 h；
加入50 μL质量浓度10 %的牛血清蛋白（BSA）溶液，封闭1 h；
离心分离10 min，重悬于1 mL的无菌水中，得到金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体；
（5）扩增的产物与链霉亲和素修饰的磁珠连接
将步骤（2）中的链置换扩增产物和链霉亲和素修饰的磁珠进行连接；
取20 μL链置换扩增产物和100 μL浓度30 mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠溶液混合，于室温下摇床孵育培养1 h；得到链霉亲和素修饰的磁珠与核酸相结合产物；
（6）将步骤（5）中的产物与金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体连接
将链霉亲和素修饰的磁珠与核酸相结合产物磁性分离，加入500 μL金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体，反应3 h，制得夹心复合物，所述夹心复合物其核酸的一端与链霉亲和素修饰的磁珠连接，另一端与金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体连接；
（7）表面拉曼散射检测
将步骤（6）中所述夹心复合物磁性分离去上清，将磁珠放置于硅片上，用必达泰克拉曼光谱仪检测单增李斯特菌在1616 cm-1处峰值的大小，将亚甲基蓝修饰在金包银这个基底上，通过检测亚甲基蓝在1616 cm-1这个特征峰峰值的强弱进而对单增李斯特菌进行检测；进行乳酪中单增李斯特菌检测时，只需要得到在1616 cm-1处的拉曼光谱值，代入所对应的标准曲线，则可得到乳酪中单增李斯特菌的浓度。
进一步的乳酪中单增李斯特菌的具体检测操作如下：
步骤（2）的具体操作如下：
扩增体系由2.5 μL的10×Bst酶缓冲液、0.5 μL的浓度8 U/μL的Bst DNA聚合酶、0.5 μL的浓度25 mM的三磷酸脱氧核糖核苷酸、1 μL的质量浓度10 %的聚乙二醇-200、浓度100 μM的引物各0.5 μL、1 μL DNA模板和18.5 μL无菌水组成，于63 ℃条件下反应1 h；
琼脂糖凝胶电泳具体操作如下：
取5 μL扩增产物与1 μL的6×DNA上样缓冲液混合，用质量浓度1.5 %的琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入4 S核酸染料水溶液，电压为120 V、时间为35 min，进行电泳，确证链置换扩增；
步骤（3）的具体操作如下：
吸取体积100 μL 浓度30 mg/mL的磁珠溶液，吸取体积50 μL 浓度10 mg/mL的N-（3-二甲基氨基丙基）-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液，吸取体积50 μL浓度 10 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液于1.5 mL离心管中避光活化，于室温孵育30 min，磁性分离去上清，再用无菌水清洗磁珠两次，重悬至80-100 μL；再加入浓度5 μL 浓度5 mg/mL的链霉亲和素，于室温下孵育反应3 h；加入等体积的质量浓度10 %的牛血清蛋白溶液，反应1 h；磁性分离去上清，再用无菌水清洗磁珠去除未结合的蛋白质，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，放4 ℃冰箱存放备用。
步骤（7）的具体操作如下：
将所述夹心复合物磁性分离去上清，用移液枪将磁珠转置于硅片上，用必达泰克拉曼光谱仪，在785 nm的激发下，25 mW的激光功率，直接对夹心复合物进行SERS测试；在曝光时间为40 s的情况下，获得了200 ~ 2000 cm-1区域的拉曼光谱；采集3次光谱，取平均值；当进行乳酪中单增李斯特菌检测时，只需要得到在1616 cm-1处的拉曼光谱值，代入所对应的标准曲线，则可得到乳酪中单增李斯特菌的浓度。
一种单增李斯特菌的特异性检测操作步骤如下：
（1）细菌DNA的提取
用细菌DNA提取试剂盒，提取乳制品中单增李斯特菌的DNA、副溶血性弧菌的DNA、大肠杆菌的DNA、阪崎肠杆菌的DNA、鼠伤寒沙门氏菌的DNA、金黄色葡萄球菌的DNA、铜绿假单胞菌的DNA；
（2）扩增
使用一对扩增引物对步骤（1）提取的各细菌DNA分别进行扩增；
针对单增李斯特菌设计一对引物的序列为：
Primer 1：FITC-GTCATTGGAAACTGGAAGACTG
Primer 2：Bio-CCACTCTCCTCTTCTGCAC
在扩增引物Primer 1的5＇端修饰异硫氰酸荧光素（FITC-）、在引物Primer 2的5＇端修饰生物素（BIO-），接着进行琼脂糖凝胶电泳；
所述琼脂糖凝胶为浓度1.5 %的琼脂糖凝胶胶，电压为120 V，电泳时间35 min；分别得到各细菌的扩增产物；若体系中存在单增李斯特菌，会出现明显的梯状条带，若无单增李斯特菌，则没有梯状条带；
（3）制备链霉亲和素修饰的磁珠
取100 μL浓度 30 mg/mL的磁珠溶液，加入50 μL浓度10 mg/mL的N-（3-二甲基氨基丙基）-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液、50 μL浓度10 mg/mL N，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液，于离心管中避光活化30 min，磁性分离，加入5 μL浓度5 mg/mL的链霉亲和素，反应3h；加入 质量浓度10 %的牛血清蛋白溶液，反应1 h，磁性分离去上清；用无菌水清洗磁珠，去除未结合的链霉亲和素，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，得到浓度30 mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠溶液；
（4）制备金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体
取1 mL金纳米粒子（ AuNPs）溶液，加入5 μL浓度3.73 mg/mL的亚甲基蓝溶液，加入100 μL浓度11 mg/mL的L-抗坏血酸溶液；
于超声功率100 W条件下超声处理20 s，加入400 μL质量浓度1 %的硝酸银（AgNO3）溶液；
加入4 μL浓度1 mg/mL的异硫氰酸荧光素（FITC）抗体，偶联1 h；
加入50 μL质量浓度10 %的牛血清蛋白（BSA）溶液，封闭1 h；
离心分离10 min，重悬于1 mL的无菌水中，得到金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体；
（5）扩增的产物与链霉亲和素修饰的磁珠连接
分别将步骤（2）的各细菌的链置换扩增产物和链霉亲和素修饰的磁珠进行连接；
取20 μL所述各细菌的链置换扩增产物分别和100 μL浓度30 mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠溶液混合，于室温下摇床孵育培养1 h；分别得到各细菌的链霉亲和素修饰的磁珠与各细菌核酸相结合的产物；
（6）将步骤（5）中的产物与金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体连接
将步骤（5）中各细菌的链霉亲和素修饰的磁珠与核酸相结合的产物磁性分离去上清，加入500 μL金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体，反应3 h，制得夹心复合物，所述夹心复合物其核酸的一端与链霉亲和素修饰的磁珠连接，另一端与金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体（AuMB@Ag-FITC抗体）连接；
（7）表面拉曼散射检测
将步骤（6）中所述各细菌的夹心复合物分别磁性分离去上清，分别将磁珠放置于硅片上，用必达泰克拉曼光谱仪进行拉曼检测，利用拉曼光谱检测目标细菌在1616 cm-1处峰值的大小，当进行特异性分析时，若所述的各细菌的夹心复合物存在单增李斯特菌时，则在1616 cm-1处会出现明显的拉曼信号，若所述的各细菌的夹心复合物没有单增李斯特菌，则在1616 cm-1无明显的拉曼信号峰值。
进一步的单增李斯特菌的特异性检测具体操作如下：
步骤（2）的具体操作如下：
扩增体系由2.5 μL 10×Bst酶缓冲液、0.5 μL浓度8 U/μL的Bst DNA聚合酶、0.5μL浓度25 mM的三磷酸脱氧核糖核苷酸、1 μL的质量浓度10 %的聚乙二醇-200、浓度100 μM引物各0.5 μL、1 μL DNA模板和18.5 μL无菌水组成，于63 ℃条件下反应1 h；
琼脂糖凝胶电泳具体操作如下：
取5 μL链置换扩增产物与1 μL的6×DNA上样缓冲液混合，用质量浓度1.5 %的琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入4 S核酸染料水溶液，电压为120 V、时间为35 min，进行电泳，确证链置换扩增；若体系中存在单增李斯特菌时，会出现明显的梯状条带，若体系中无单增李斯特菌，则无明显梯状条带。
步骤（3）的具体操作如下：
吸取体积100 μL 浓度30 mg/mL的磁珠溶液，吸取体积50 μL 浓度10 mg/mL的N-（3-二甲基氨基丙基）-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液，吸取体积50 μL 浓度10 mg/mL N，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液于1.5 mL离心管中避光活化，于室温孵育30 min，磁性分离去上清，再用无菌水清洗磁珠两次，重悬至80-100 μL；再加入浓度5 μL 浓度5 mg/mL的链霉亲和素，于室温下孵育反应3 h，加入等体积的质量浓度10 %的牛血清蛋白溶液，反应1 h；磁性分离去上清，再用无菌水清洗磁珠去除未结合的蛋白质，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，放入4 ℃冰箱存放备用。
步骤（7）的具体操作如下：
将所述各细菌的夹心复合物磁性分离去上清，分别用移液枪将磁珠转置于硅片上，用必达泰克拉曼光谱仪，在785 nm的激发下，25 mW的激光功率，分别直接对各细菌的夹心复合物进行SERS测试；在曝光时间为40 s的情况下，获得了200 ~ 2000 cm-1区域的拉曼光谱；采集3次光谱，取平均值；当进行特异性分析时若所述的各细菌的夹心复合物存在单增李斯特菌时，则在1616 cm-1处会出现明显的拉曼信号；若所述的各细菌的夹心复合物没有单增李斯特菌，则在1616 cm-1无明显的拉曼信号峰值。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1、本发明方法使用链置换扩增代替了传统的聚合酶链式反应，聚合酶链式反应通常需要2 h而链置换扩增只需要1 h，并且只需要一个简单的水浴锅便可进行实验，摆脱了对精密仪器的需求且不需要专业的技术人员。检测效率提高了50 %。
2、本发明方法使用引物BIO-端，FTTC-端分别与链霉亲和素修饰的磁珠和AuMB@Ag-FITC抗体连接从而代替了昂贵的抗体，检测成本降低了约75 %，同时免疫磁珠磁吸作用良好，避免了链置换扩增过程中杂质的干扰，从而减少非特异性结合造成的假阳现象，同时，免疫磁珠的制备方法与普通的方法相比较，所需材料试剂较少，过程简单，缩短了反应时间，其他方法的反应时间为1-2天，本发明方法的反应时间缩短至4-6 h；最重要的是所制得的磁珠偶联物分散性好。
3、本发明采用表面拉曼散射进行单增李斯特菌的检测，利用金，银作为增强基底使得信号强度得到8-10个数量级的增强，从机理上来看，我们用外来的拉曼信号分子亚甲基蓝等将其标记到金、银增强基底上，然后再将标记好的增强基底与异氰酸荧光素连接，最后与所检测的致病菌相结合，通过检测亚甲基蓝在1616 cm-1的拉曼信号强弱来检测致病菌。这些外来的信号分子会被金、银等纳米粒子吸收，由于电磁和化学增强效应，会使得拉曼信号增强，这被称为拉曼热点。金纳米粒子制备容易、颗粒大小可控、抗干扰能力强、稳定性高、不易失活和成本低等优点。
附图说明
图1是本发明检测方法原理图。
图2是本发明实施例1中的不同浓度单增李斯特菌的拉曼图。
图3是本发明实施例1中单增李斯特菌菌浓度标准曲线图。
图4是本发明实施例2中单增李斯特菌特异性电泳图。
图5是本发明实施例2中单增李斯特菌特异性图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中的拉曼测试实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
以下实施例中所用牛血清白蛋白抗体（BSA抗体）购于北京索莱宝科技有限公司；
以下实施例中，羧基化磁珠购买于阿拉丁试剂有限公司；金纳米粒子合成所涉及到的原料均购买于上海杰一生物技术有限公司；硝酸银（AgNO3）、牛血清蛋白（BSA）50-500bp DNA标记，DNA上样缓冲液（6×DNA loading Buffer），Bst 2.0 DNA聚合酶（8 U/μL），DNA染料，琼脂糖和Luria-Bertani（LB）培养基由Sangon Biotech（中国上海）提供。异硫氰酸荧光素（FITC）抗体购于北京索莱宝生物技术有限公司。链霉亲和素购买于北京生物有限公司， N-（3-二甲基氨基丙基）-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自Sigma Chemical Company（密苏里州圣路易斯，美国），引物的合成与修饰由南京擎科生物技术有限公司完成。
实施例1
人工污染乳酪中的单增李斯特菌的检测研究
1样品的处理
进行检验前，先用无菌刀削去部分干酪表面封蜡，以点燃的酒精面球消毒，无菌操作取25 g检样，置于灭菌的研钵内切碎。从无菌生理盐水中取出少许加入研钵中，将乳酪研成糊状，放入灭菌三角瓶内，制成1:10的均匀稀释液，再进行样品的分装，将分装的样品中加入不同浓度的单增李斯特菌。
2用本发明方法进行检测
（2.1）提取乳酪中单增李斯特菌的DNA
用细菌DNA提取试剂盒，提取乳酪中不同浓度的单增李斯特菌的DNA；
（2.2）扩增
使用一对扩增引物对步骤（1）中提取的DNA进行扩增；
一对引物的序列为：
Primer 1：FITC-GTCATTGGAAACTGGAAGACTG
Primer 2：Bio-CCACTCTCCTCTTCTGCAC
所述引物专门针对单增李斯特菌设计；
在扩增引物Primer 1的5＇端修饰异硫氰酸荧光素（FITC-）、在引物Primer 2的5＇端修饰生物素（BIO-），接着进行琼脂糖凝胶电泳；
所述琼脂糖凝胶为浓度1.5 %的琼脂糖凝胶，电压为120 V，电泳时间35 min；得到链置换扩增产物。
扩增体系由2.5 μL浓度10×Bst酶缓冲液、0.5 μL浓度8 U/μL的Bst DNA聚合酶、0.5 μL浓度25 mM的三磷酸脱氧核糖核苷酸、1 μL质量浓度10 %的聚乙二醇-200、浓度100μM的引物各0.5 μL、1 μL DNA模板和18.5 μL无菌水组成，于63 ℃条件下反应1 h。
琼脂糖凝胶电泳具体操作如下：
取5 μL链置换扩增产物与1 μL的6×DNA上样缓冲液混合，用质量浓度1.5 %的琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入4 S核酸染料水溶液，电压为120 V、时间为35 min，进行电泳，确证链置换扩增。
（2.3）制备链霉亲和素修饰的磁珠
具体操作如下：吸取体积100 μL 浓度30 mg/mL的磁珠溶液，吸取体积50 μL 浓度10 mg/mL的N-（3-二甲基氨基丙基）-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液，吸取体50 μL浓度 10mg/mL N，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液于1.5 mL离心管中避光活化，于室温孵育30 min，磁性分离去上清，再用无菌水清洗磁珠两次，重悬至80-100 μL；再加入5 μL 浓度5 mg/mL的链霉亲和素，于室温下孵育反应3 h；加入等体积的质量浓度10 %的牛血清蛋白溶液，反应1h；磁性分离去上清，再用无菌水清洗磁珠，去除未结合的链霉亲和素，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，得到浓度30 mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠溶液。4 ℃冰箱存放备用。
（2.4）制备金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体
取1 mL金纳米粒子（ AuNPs）溶液，加入5 μL浓度3.73 mg/mL的的亚甲基蓝溶液，加入100 μL浓度11 mg/mL的L-抗坏血酸溶液；
于超声功率100 W条件下超声处理20 s，同时加入400 μL质量浓度1 %的硝酸银（AgNO3）溶液；
加入4 μL浓度1 mg/mL的异硫氰酸荧光素（FITC）抗体，偶联1 h；
加入50 μL质量浓度10 %的牛血清蛋白（BSA）溶液，封闭1 h；
离心分离10 min，重悬于1 mL的无菌水中，得到金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素（AuMB@Ag-FITC抗体）抗体。
（2.5）扩增的产物与链霉亲和素修饰的磁珠连接
将步骤（2.2）中的不同浓度的单增李斯特菌链置换扩增产物和链霉亲和素修饰的磁珠进行连接；
取20 μL不同浓度的单增李斯特菌链置换扩增产物和100 μL浓度30 mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠溶液混合，于室温下摇床孵育培养1 h；得到链霉亲和素修饰的磁珠与核酸相结合产物。
（2.6）将步骤（2.5）中的产物与金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体连接
将步骤（2.5）得到的链霉亲和素修饰的磁珠与核酸相结合产物磁性分离去上清，加入500 μL金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体（AuMB@Ag-FITC抗体），反应3 h，制得夹心复合物，所述夹心复合物其核酸的一端与链霉亲和素修饰的磁珠连接，另一端与金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体连接。
（2.7）表面拉曼散射检测
具体操作如下：将步骤（2.6）得到所述夹心复合物磁性分离去上清，用移液枪将磁珠转置于硅片上，用必达泰克拉曼光谱仪，在785 nm的激发下，25 mW的激光功率，直接对夹心复合物进行SERS测试；在曝光时间为40 s的情况下，获得了200 ~ 2000 cm-1区域的拉曼光谱；采集3次光谱，取平均值； 当进行乳酪中单增李斯特菌检测时，只需要得到在1616cm-1处的拉曼光谱值，代入所对应的标准曲线，则可得到乳酪中单增李斯特菌的浓度。
上述的不同浓度的单增李斯特菌菌液分别为2×100 CFU/mL,2×101 CFU/mL, 2×102 CFU/mL, 2×103 CFU/mL, 2×104 CFU/mL, 2×105 CFU/mL, 2×106 CFU/mL。
3 分析结果
以1616 cm-1处峰值处的大小为纵坐标，以单增李斯特菌的浓度（CFU/mL）为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。参见图2和图3，所示标准曲线为Y=445.53X-24.13， R²=0.9948。通过该标准曲线计算得最低检测限为7.8 CFU/mL。当进行乳酪中单增李斯特菌检测时，将样本1616 cm-1处的值代入标准曲线中，从标准曲线上读出对应的乳酪中单增李斯特菌的浓度。由图可知，待测样品的浓度为1.9×102 CFU/mL。
实施例2
乳制品（乳酪）中的单增李斯特菌的特异性检测方法
1、样品的处理
进行检验前，先用无菌刀削去干酪部分表面封蜡，以点燃的酒精面球消毒，无菌操作取25 g检样，置于灭菌的研钵内切碎。取无菌生理盐水中取出少许加入研钵中，将乳酪研成糊状，放入灭菌三角瓶内，制成1:10的均匀稀释液，将稀释液分装在7个试管中，在7个试管中分别对应加入相同浓度2.0×102 CFU/mL的单增李斯特菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，得到7种细菌的被测菌液。
2 、用本发明方法进行检测
（2.1）细菌DNA的提取
用细菌DNA提取试剂盒，分别提取7个被测菌液中细菌的DNA，即单增李斯特菌的DNA、副溶血性弧菌的DNA、大肠杆菌的DNA、阪崎肠杆菌的DNA、鼠伤寒沙门氏菌的DNA、金黄色葡萄球菌的DNA、铜绿假单胞菌的DNA。
（2.2）扩增
使用一对扩增引物对步骤（1）提取的各细菌DNA分别进行扩增；
针对单增李斯特菌设计一对引物的序列为：
Primer 1：FITC-GTCATTGGAAACTGGAAGACTG
Primer 2：Bio-CCACTCTCCTCTTCTGCAC
在扩增引物Primer 1的5＇端修饰异硫氰酸荧光素（FITC-）、在引物Primer 2的5＇端修饰生物素（BIO-），接着对7个被测菌液中细菌的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
所述琼脂糖凝胶为浓度1.5 %的琼脂糖凝胶胶，电压为120 V，电泳时间35 min；分别得到各细菌的扩增产物；若体系中存在单增李斯特菌，会出现明显的梯状条带，若无单增李斯特菌，则没有梯状条带。
扩增体系由2.5 μL浓度10×的Bst酶缓冲液、0.5 μL浓度8 U/μL的Bst DNA聚合酶、0.5 μL浓度25 mM的脱氧核糖核苷三磷酸、1 μL质量浓度10 %的聚乙二醇-200、浓度100μM引物各0.5 μL、1 μL DNA模板和18.5 μL无菌水组成，于63 ℃条件下反应1h。
琼脂糖凝胶电泳具体操作如下：
取5 μL链置换扩增产物与1 μL的6×DNA上样缓冲液混合，用质量浓度1.5 %的琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入4 S核酸染料水溶液，电压为120 V、时间为35 min，进行电泳，确证链置换扩增；若体系中存在单增李斯特菌时，会出现明显的梯状条带，若体系中无单增李斯特菌，则无明显梯状条带。
（2.3）制备链霉亲和素修饰的磁珠
吸取体积100 μL 浓度30 mg/mL的磁珠溶液，分别加入体积50 μL 浓度10 mg/mL的N-（3-二甲基氨基丙基）-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液和体积50 μL 浓度10 mg/mL N，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液于1.5 mL离心管中避光活化，于室温孵育30 min，磁性分离去上清，再用无菌水清洗磁珠两次，重悬至80-100 μL；再加入浓度5 μL 浓度5 mg/mL的链霉亲和素，于室温下孵育反应3 h，加入等体积的质量浓度10 %的牛血清蛋白溶液，反应1 h；磁性分离去上清，再用无菌水清洗磁珠去除未结合的链霉亲和素，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，得到浓度30 mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠溶液。温度4 ℃冰箱存放备用。
（2.4）制备金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体
取1 mL金纳米粒子（ AuNPs）溶液，加入5 μL浓度3.73 mg/mL的亚甲基蓝溶液，加入100 μL浓度11 mg/mL的L-抗坏血酸溶液；
于超声功率100 W条件下超声处理20 s，加入400 μL质量浓度1 %的硝酸银（AgNO3）溶液；
加入4 μL浓度1 mg/mL的异硫氰酸荧光素（FITC）抗体，偶联1 h；
加入50 μL质量浓度10%的牛血清蛋白（BSA）溶液，封闭1 h；
离心分离10 min，重悬于1 mL的无菌水中，得到金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体（AuMB@Ag-FITC抗体）。
（2.5）扩增的产物与链霉亲和素修饰的磁珠连接
分别将步骤（2）得到的各细菌的链置换扩增产物和链霉亲和素修饰的磁珠进行连接；
取20 μL各细菌的链置换扩增产物分别和100 μL浓度30 mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠溶液混合，于室温下摇床孵育培养1 h；分别得到各细菌的链霉亲和素修饰的磁珠与核酸相结合的产物。
（2.6）将步骤（5）中的产物与金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光抗体连接
将步骤（2.5）得到的各细菌的链霉亲和素修饰的磁珠与核酸相结合的产物磁性分离去上清，分别加入500 μL的金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体（AuMB@Ag-FITC抗体），反应3 h，制得所述各细菌的夹心复合物，所述各细菌的夹心复合物其核酸的一端与链霉亲和素修饰的磁珠连接，另一端与金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体（AuMB@Ag-FITC抗体）连接。
（2.7）表面拉曼散射检测
将步骤（2.6）得到的各细菌的夹心复合物磁性分离去上清，分别用移液枪将磁珠转置于硅片上，用必达泰克拉曼光谱仪，在785 nm的激发下，25 mW的激光功率，分别直接对各细菌的夹心复合物进行SERS测试；在曝光时间为40 s的情况下，获得了200 ~ 2000 cm-1区域的拉曼光谱；采集3次光谱，取平均值；当进行特异性分析时若所述的各细菌的夹心复合物存在单增李斯特菌时，则在1616 cm-1处会出现明显的拉曼信号；若所述的各细菌的夹心复合物没有单增李斯特菌，则在1616 cm-1无明显的拉曼信号峰值。
3、分析结果
如图4所示，由于引物的特异性，当体系中存在单增李斯特菌时，只有1泳道处出现明显的梯状条带，其他泳道由于未加入单增李斯特菌的DNA，引物对其不具有特异性则未出现明显的梯状条带。用上述制备相同浓度的不同菌种的样品(2×102 CFU/mL)直接对样品进行SERS测试，观察其1616 cm-1处峰值的强弱，测三次，取平均值。如图5所示，当体系中存在单增李斯特菌时，拉曼光谱在1616 cm-1处有明显的信号峰值，当体系中不存在单增李斯特菌时，则1616 cm-1处无明显的信号峰值。

Claims (4)

1.一种乳酪中单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，操作步骤如下：
（1）提取乳酪中单增李斯特菌的DNA
用细菌DNA提取试剂盒，提取乳酪中单增李斯特菌的DNA；
（2）扩增
使用一对扩增引物对步骤（1）提取的DNA进行扩增；
一对引物的序列为：
Primer 1：FITC-GTCATTGGAAACTGGAAGACTG
Primer 2：Bio-CCACTCTCCTCTTCTGCAC
所述引物专门针对单增李斯特菌设计；
在扩增引物Primer 1的5＇端修饰异硫氰酸荧光素（FITC-）、在引物Primer 2的5＇端修饰生物素（BIO-），接着进行琼脂糖凝胶电泳；
所述琼脂糖凝胶为浓度1.5 %的琼脂糖凝胶，电压为120 V，电泳时间35 min；得到链置换扩增产物；
（3）制备链霉亲和素修饰的磁珠
取100 μL浓度 30 mg/mL的磁珠溶液，加入50 μL浓度10 mg/mL的N-（3-二甲基氨基丙基）-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液、50 μL浓度10 mg/mL N，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液，于离心管中避光室温活化30 min，磁性分离去上清，加入5 μL浓度5 mg/mL的链霉亲和素，反应3 h；加入质量浓度10 %的牛血清蛋白溶液，反应1 h，磁性分离去上清；再用无菌水清洗磁珠，去除未结合的链霉亲和素，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，得到浓度30 mg/mL链霉亲和素修饰的磁珠溶液；
（4）制备金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体
取1 mL金纳米粒子（ AuNPs）溶液，加入5 μL浓度3.73 mg/mL的亚甲基蓝溶液，加入100μL浓度11 mg/mL的L-抗坏血酸溶液；
于超声功率100 W条件下超声处理20 s，同时加入400 μL质量浓度1 %的硝酸银（AgNO3）溶液；
加入4 μL浓度1 mg/mL的异硫氰酸荧光素（FITC）抗体，偶联1 h；
加入50 μL质量浓度10 %的牛血清蛋白（BSA）溶液，封闭1 h；
离心分离10 min，重悬于1 mL的无菌水中，得到金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体；
（5）扩增的产物与链霉亲和素修饰的磁珠连接
将步骤（2）中的链置换扩增产物和链霉亲和素修饰的磁珠进行连接；
取20 μL链置换扩增产物和100 μL浓度30 mg/mL的链霉亲和素修饰磁珠溶液混合，于室温下摇床孵育培养1 h；得到链霉亲和素修饰的磁珠与核酸相结合产物；
（6）将步骤（5）中的产物与金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体连接
将链霉亲和素修饰的磁珠与核酸相结合产物磁性分离，加入500 μL金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体，反应3 h，制得夹心复合物，所述夹心复合物其核酸的一端与链霉亲和素修饰的磁珠连接，另一端与金包亚甲基蓝包银包异硫氰酸荧光素抗体（AuMB@Ag-FITC抗体）连接；
（7）表面拉曼散射检测
将步骤（6）中所述夹心复合物磁性分离去上清，将磁珠放置于硅片上，用必达泰克拉曼光谱仪检测单增李斯特菌在1616 cm-1处峰值的大小，将亚甲基蓝修饰在金包银这个基底上，通过检测亚甲基蓝在1616 cm-1这个特征峰峰值的强弱进而对单增李斯特菌进行检测；进行乳酪中单增李斯特菌检测时，只需要得到在1616 cm-1处的拉曼光谱值，代入所对应的标准曲线，则可得到乳酪中单增李斯特菌的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种乳酪中单增李斯特菌的检测方法，其特征在于步骤（2）的具体操作如下：
扩增体系由2.5 μL的10×Bst酶缓冲液、0.5 μL的浓度8 U/μL的Bst DNA聚合酶、0.5 μL的浓度25 mM的三磷酸脱氧核糖核苷酸、1 μL的质量浓度10 % 的聚乙二醇-200、浓度100μM的引物各0.5 μL、1 μL DNA模板和18.5 μL无菌水组成，于63 ℃条件下反应1 h；
琼脂糖凝胶电泳具体操作如下：
取5 μL链置换扩增产物与1 μL的6×DNA上样缓冲液混合，用质量浓度1.5 %的琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入4 S核酸染料水溶液，电压为120 V、时间为35 min，进行电泳，确证链置换扩增。
3.根据权利要求1所述的一种乳酪中单增李斯特菌的检测方法，其特征在于步骤（3）的具体操作如下：
吸取体积100 μL 浓度30 mg/mL的磁珠溶液，吸取体积50 μL 浓度10 mg/mL的N-（3-二甲基氨基丙基）-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液，吸取体积50 μL浓度 10 mg/mL N，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液于1.5 mL离心管中避光活化，于室温孵育30 min，磁性分离去上清，再用无菌水清洗磁珠两次，重悬至80-100 μL；再加入浓度5 μL 浓度5 mg/mL的链霉亲和素，于室温下孵育反应3 h；加入等体积的质量浓度10 %的牛血清蛋白溶液，反应1 h；磁性分离去上清，再用无菌水清洗磁珠去除未结合的蛋白质，将磁珠转移至新管，弃去上清液，用水重悬，放4 ℃冰箱存放备用。
4.根据权利要求1所述的一种乳酪中单增李斯特菌的检测方法，其特征在于步骤（7）的具体操作如下：
将所述夹心复合物磁性分离去上清，用移液枪将磁珠转置于硅片上，用必达泰克拉曼光谱仪，在785 nm的激发下，25 mW的激光功率，直接对夹心复合物进行SERS测试；在曝光时间为40 s的情况下，获得了200 ~ 2000 cm-1区域的拉曼光谱；采集3次光谱，取平均值；当进行乳酪中单增李斯特菌检测时，只需要得到在1616 cm-1处的拉曼光谱值，代入所对应的标准曲线，则可得到乳酪中单增李斯特菌的浓度。
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