CN113466445A - 基于杂交链式-酶显色反应检测Hg2+和Ag+的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

基于杂交链式-酶显色反应检测Hg2+和Ag+的生物传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于杂交链式‑酶显色反应检测Hg2+和Ag+的生物传感器及其制备方法和应用，所述生物传感器包括固定Helper DNA的磁珠、固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子、发夹探针HP2、TMB底物溶液。本发明生物传感器利用核酸适配体的特异性识别，在Hg2+或Ag+存在下，通过T‑Hg2+‑T或C‑Ag+‑C的配位，Helper DNA打开发夹探针HP1从而开启HP1和HP2之间的HCRs，实现信号放大，大量修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子连接到扩增的DNA链上，辣根过氧化物酶引发TMB底物发生酶促显色反应，溶液颜色发生明显变化，由无色转呈蓝色，通过测量652nm处的吸光度即可准确定量Hg2+或Ag+，操作简便、条件温和、检测范围宽、检出限低。

Description

基于杂交链式-酶显色反应检测Hg2+和Ag+的生物传感器及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于汞离子、银离子检测与生物传感的技术领域，具体涉及一种基于杂交链式-酶显色反应检测Hg2+和Ag+的生物传感器，以及该生物传感器的制备方法和应用。
背景技术
汞是一种重金属，俗称水银，常以液态存在。汞是一种高毒性和非必需的元素，水溶性二价汞离子是汞污染最普遍的形式之一。银是一种稀有但天然存在的元素，高浓度范围的银离子表现出高毒性。汞离子和银离子与巯基及氨基存在很高的亲和力，会与人体内的氨基酸、核酸等化合物形成一些有害的络合物，因此对水生生物和人体有很高的毒性，对人体健康有很严重的不良影响，长期在汞或银浓度较高的环境下生活会使人体细胞代谢功能紊乱甚至导致脑损伤和死亡，同时对维持可持续环境的计划构成了极大地挑战，因此对汞离子和银离子的检测具有重要意义。
目前，汞离子检测传统的方法有分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光度法等，这些方法对Hg2+或Ag+的检测灵敏度都较高，但同时也存在如仪器昂贵、分析周期长、样品与处理复杂、检测费用昂贵等问题，不能达到快速、高通量的检测要求，限制了在常规测量中的应用。因此，迫切需要建立一种现场检测的传感器。
发明内容
为了解决现有检测方法复杂、昂贵等不足，本发明旨在利用杂交链式反应(HCR)扩增放大信号提高检测的选择性和灵敏度，并结合酶显色反应建立一种即时的生物传感器，实现对汞离子和银离子的检测。
解决上述问题所采用的生物传感器包括：固定Helper DNA的磁珠、固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子、发夹探针HP2、TMB底物溶液；其中，所述磁珠为表面原位生长金纳米粒子的溶菌酶修饰的Fe3O4@C纳米材料，记为Fe3O4@C@lyz@Au，lyz代表溶菌酶；所述固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子记为AuNPs-HRP-HP1DNA；当检测物为Hg2+时，所述Helper DNA的序列为：TGTCTTGGTTTCGGCGTGGGTTTT；当检测物为Ag+时，所述Helper DNA的序列为：ACTCTAGCATTCCGCCTGCCTTAA；所述发夹探针HP1的序列为：GGGGGTTAACCCACGCCGAATCCTAGACT CAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG；所述发夹探针HP2的序列为：AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG。
上述固定Helper DNA的磁珠和固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子优选均匀分散于重悬液中，所述重悬液为含3～6wt.％牛血清白蛋白、0.2～0.3wt.％吐温-20、8～12wt.％蔗糖的20mmol/LNa3PO4水溶液。
上述磁珠的粒径为150～250nm，金纳米粒子的粒径为15～20nm。
本发明生物传感器的制备方法包括下述步骤：
步骤1：设计并合成发夹探针HP1、发夹探针HP2、Helper DNA。
步骤2：制备Fe3O4@C@lyz@Au
将Fe3O4磁性纳米粒子超声分散于葡萄糖水溶液中，在密闭条件下160～170℃反应5～6小时，得到Fe3O4@C纳米材料；将Fe3O4@C纳米材料均匀分散在含溶菌酶和三(2-羧乙基)膦盐酸盐的HEPES缓冲溶液中，于37℃下孵育20～40分钟，得到Fe3O4@C@lyz；将Fe3O4@C@lyz超声分散在HAuCl4的乙醇水溶液中，并加入NaBH4，室温反应，得到Fe3O4@C@lyz@Au。
步骤3：Fe3O4@C@lyz@Au固定Helper DNA
在pH＝5的醋酸缓冲溶液中加入Helper DNA和三(2-羧乙基)膦盐酸盐，混匀后37℃活化40～60分钟，再加入Fe3O4@C@lyz@Au，混匀后37℃继续活化40～60分钟，然后加入NaCl，37℃老化20～40分钟后，4℃继续老化5～6小时，得到Fe3O4@C@lyz@Au-Helper DNA。
步骤4：制备AuNPs-HRP-HP1 DNA
将金纳米粒子用NaOH水溶液调节pH至6～7，然后加入辣根过氧化物酶，振荡混匀后4℃静置2～3小时，得到修饰辣根过氧化物酶的金纳米粒子；在pH＝5的醋酸缓冲溶液中加入发夹探针HP1和三(2-羧乙基)膦盐酸盐，混匀后37℃活化40～60分钟，再加入修饰辣根过氧化物酶的金纳米粒子，混匀后37℃活化40～60分钟，然后加入NaCl，37℃老化20～40分钟后，4℃继续老化5～6小时，得到AuNPs-HRP-HP1 DNA。
上述步骤2中，优选Fe3O4@C纳米材料、溶菌酶、三(2-羧乙基)膦盐酸盐的质量比为1:1～2:6～8，优选Fe3O4@C@lyz、HAuCl4、NaBH4的质量比为1:30～35:3～5。
上述步骤3中，优选Fe3O4@C@lyz@Au、Helper DNA、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、NaCl的配比为1mg:0.12～0.24nmol:1.2～2.4nmol:0.6～1.8μmol。
上述步骤4中，优选金纳米粒子、辣根过氧化物酶的配比为2～3nmol:0.1～0.2mg，修饰辣根过氧化物酶的金纳米粒子、发夹探针HP1、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、NaCl的配比为1nmol:0.5～1nmol:5～10nmol:8～12μmol。
本发明生物传感器可用于检测Hg2+或Ag+，具体检测方法如下：
(1)取Fe3O4@C@lyz@Au-Helper DNA、AuNPs-HRP-HP1 DNA、发夹探针HP2加入pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液中，然后加入不同浓度Hg2+标准溶液或不同浓度Ag+标准溶液，振荡混匀后，37℃温育40～60分钟，取出后继续振荡10～20分钟，磁分离去除上清液后，重新分散在pH＝5的醋酸钠缓冲液中，加入TMB底物溶液，反应5～10分钟后，测定652nm处的吸光度；根据不同浓度Hg2+或Ag+标准溶液的吸光度值，作Hg2+浓度-吸光度值或Ag+浓度-吸光度值的标准曲线并计算回归方程。
(2)根据步骤(1)的方法测定待测样品的吸光度值，结合回归方程计算待测样品中所含Hg2+或Ag+的浓度。
上述步骤(1)中，将Fe3O4@C@lyz@Au-Helper DNA、AuNPs-HRP-HP1 DNA、发夹探针HP2加入pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液中，优选使Tris-HCl缓冲溶液中Helper DNA的终浓度为0.15～0.2μmol/L，Helper DNA、发夹探针HP1、发夹探针HP2的终浓度之比为1:0.4～0.5:0.3～0.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明构建的生物传感器，利用核酸适配体的特异性识别，在Hg2+或Ag+存在下，利用富含T碱基或C碱基的核酸为辅助探针(Helper DNA)，通过T-Hg2+-T或C-Ag+-C的特异性结合实现了对Hg2+或Ag+的高特异性检测；在Hg2+或Ag+的存在下，通过T-Hg2+-T或C-Ag+-C的配位，Helper DNA打开发夹探针HP1从而开启HP1和HP2之间的HCRs，实现信号放大，大量修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子连接到扩增的DNA链上，辣根过氧化物酶引发TMB底物发生酶促显色反应，溶液颜色发生明显变化，由无色转呈蓝色，通过测量652nm处的吸光度即可准确定量Hg2+或Ag+。该方法操作简便、条件温和、检测范围宽及检出限低，提高了Hg2+和Ag+检测的选择性和灵敏度，其对Hg2+和Ag+的检测范围为0.1nmol/L～10μmol/L，Hg2+检出限可达到0.03nmol/L，Ag+检出限可达到0.02nmol/L。
附图说明
图1是实施例1生物传感器对不同浓度的Hg2+检测的结果图。
图2是实施例2生物传感器对不同浓度的Ag+检测的结果图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
制备检测Hg2+的生物传感器
本实施例的生物传感器由固定Hg-Helper DNA的磁珠(Fe3O4@C@lyz@Au-Hg-HelperDNA)溶液、固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子(AuNPs-HRP-HP1 DNA)溶液、发夹探针HP2、TMB底物溶液组成。该生物传感器中的TMB底物溶液为市售产品，其他组成部分由下述步骤制备得到：
步骤1：设计并合成发夹探针HP1、发夹探针HP2、Hg-Helper DNA；其中，Hg-HelperDNA的序列为：TGTCTTGGTTTCGGCGTGGGTTTT，发夹探针HP1的序列为：GGGGGTTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG，发夹探针HP2的序列为：AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG。
步骤2：制备Fe3O4@C@lyz@Au
称取0.2g Fe3O4磁性纳米粒子加入50mL 0.10mol/L葡萄糖水溶液中，超声分散均匀后转移至50mL聚四氟乙烯高压反应釜中，于170℃下高温反应5小时，冷却至室温，用无水乙醇和去离子水在磁铁作用下交替超声洗涤数次，最后在80℃下真空干燥，得到Fe3O4@C纳米材料。将10mg Fe3O4@C纳米材料均匀分散在10mL 3mg/mL溶菌酶溶液与45mmol/L TCEP溶液体积比为1:1的混合液中，其中3mg/mL溶菌酶溶液是将溶菌酶溶于9mmol/L pH＝7.4的HEPES缓冲溶液中配制而成，45mmol/L TCEP溶液是将三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)溶于9mmol/L pH＝5的HEPES缓冲溶液中配制而成，于37℃下孵育30分钟，用乙醇和水交替洗涤，最后在80℃下真空干燥，得到Fe3O4@C@lyz。将5mg Fe3O4@C@lyz超声分散在30mL15mmol/LHAuCl4溶液(溶剂为乙醇与水体积比1:1混合液)中，冰水浴下机械搅拌1小时后加入5mL90mmol/L NaBH4水溶液，继续搅拌30分钟后，从冰水浴中取出，在磁铁作用下交替用二次水和无水乙醇反复超声洗涤，并于80℃下真空干燥，得到Fe3O4@C@lyz@Au，其平均粒径为200nm。该步骤通过溶菌酶在Fe3O4@C上自组装形成薄膜提供巯基用来原位生长金纳米粒子。
步骤3：Fe3O4@C@lyz@Au固定Hg-Helper DNA
在3μL 5mmol/L pH＝5的醋酸缓冲溶液中加入6μL Hg-Helper DNA和6μL 1mmol/LTCEP水溶液，混匀后置于37℃水浴活化1小时。向活化体系中加入200μL 17mg/mL Fe3O4@C@lyz@Au的水分散液，混匀后置于37℃水浴继续活化1小时，继续加入40μL 0.1mol/L NaCl水溶液，37℃老化30分钟后置于4℃继续老化6小时。结束后在磁铁作用下用超纯水洗涤，得到Fe3O4@C@lyz@Au-Hg-Helper DNA。将Fe3O4@C@lyz@Au-Hg-Helper DNA重悬于100μL重悬液中，获得Fe3O4@C@lyz@Au-Hg-Helper DNA溶液，该溶液中Hg-Helper DNA的浓度为5μmol/L。重悬液配方：含5wt.％牛血清白蛋白、0.25wt.％吐温-20、10wt.％蔗糖的20mmol/L Na3PO4水溶液。
步骤4：制备AuNPs-HRP-HP1 DNA
向三口烧瓶中加入125μL 8wt.％的HAuCl4水溶液和25mL超纯水，加热回流至沸腾冒泡后，加入2.5mL 38.8mmol/L柠檬酸钠水溶液，2～3分钟内溶液从灰变为红最后变为稳定的红色后，继续加热15分钟后，撤去加热，慢慢冷却至室温，得到金纳米粒子(AuNPs)，粒径为15～20nm。取1mL AuNPs用0.2mol/L NaOH水溶液调节pH至6.5，然后加入10μL 10mg/mL的辣根过氧化物酶(HRP)水溶液，振荡混匀后4℃静置2小时，结束后用超纯水离心洗涤，得到修饰辣根过氧化物酶的金纳米粒子(AuNPs-HRP)。在3μL 5mmol/L pH＝5的醋酸缓冲溶液中加入3μL发夹探针HP1和3μL 1mmol/L的TCEP水溶液，混匀后置于37℃水浴活化1小时。向活化体系中加入200μL AuNPs-HRP，混匀后置于37℃水浴活化1小时，继续加入40μL0.1mol/L NaCl水溶液，37℃老化30分钟后置于4℃继续老化6小时，结束后用超纯水离心洗涤，得到AuNPs-HRP-HP1 DNA。将AuNPs-HRP-HP1 DNA重悬于100μL重悬液中，得到AuNPs-HRP-HP1 DNA溶液，该溶液中HP1 DNA的浓度为2μmol/L。重悬液配方：含5wt.％牛血清白蛋白、0.25wt.％吐温-20、10wt.％蔗糖的20mmol/L Na3PO4水溶液。
实施例2
制备检测Ag+的生物传感器
本实施例的生物传感器由固定Ag-Helper DNA的磁珠(Fe3O4@C@lyz@Au-Ag-HelperDNA)溶液、固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子(AuNPs-HRP-HP1 DNA)溶液、发夹探针HP2、TMB底物溶液组成。该生物传感器中的TMB底物溶液为市售产品，其他组成部分由下述步骤制备得到：
步骤1：设计并合成发夹探针HP1、发夹探针HP2、Ag-Helper DNA；其中，Ag-HelperDNA的序列为：ACTCTAGCATTCCGCCTGCCTTAA，发夹探针HP1和发夹探针HP2的序列与实施例1相同。
步骤2：制备Fe3O4@C@lyz@Au
该步骤与实施例1步骤2相同。
步骤3：Fe3O4@C@lyz@Au固定Ag-Helper DNA
将实施例1步骤3中的Hg-Helper DNA用等体积Ag-Helper DNA替换，其他步骤与实施例1步骤3相同，得到Fe3O4@C@lyz@Au-Ag-Helper DNA溶液。
步骤4：制备AuNPs-HRP-HP1 DNA
该步骤与实施例1步骤4相同。
实施例3
实施例1的生物传感器检测Hg2+的应用，具体步骤如下：
(1)取4μL Fe3O4@C@lyz@Au-Hg-Helper DNA溶液、4μL AuNPs-HRP-HP1 DNA溶液、4μL 1.5μmol/L发夹探针HP2水溶液、100μL 5mmol/L pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液加入离心管中，并分别加入10μL不同浓度(0nmol/L～10μmol/L)Hg2+标准溶液，振荡混匀后，37℃温育1小时，取出后继续振荡30分钟，磁吸分离去除上清液，重新分散在50μL 100mmol/L pH＝5的醋酸钠缓冲液中，加入100μL TMB底物溶液，反应8分钟后，采用紫外分光光度计测定652nm处的吸光度。根据不同浓度Hg2+标准溶液的吸光度值，作Hg2+浓度-吸光度值的标准曲线并计算回归方程，标准曲线如图1所示，在Hg2+浓度范围为0.1～1000nmol/L时，线性方程为：
y＝0.0001x+0.1410
式中y为吸光度值，x为Hg2+浓度，相关系数R2＝0.9827，由相关系数可见，吸光度值与Hg2+浓度的线性关系较好。经测试，检出限为0.03nmol/L。
(2)根据步骤(1)的方法测定待测样品的吸光度值，结合回归方程计算待测样品中所含Hg2+的浓度。
实施例4
实施例2的生物传感器检测Ag+的应用，具体步骤如下：
(1)取4μL Fe3O4@C@lyz@Au-Ag-Helper DNA溶液、4μL AuNPs-HRP-HP1 DNA溶液、4μL 1.5μmol/L发夹探针HP2水溶液、100μL 5mmol/L pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液加入离心管中，并分别加入10μL不同浓度(0nmol/L～10μmol/L)Ag+标准溶液，振荡混匀后，37℃温育1小时，取出后继续振荡30分钟，磁吸分离去除上清液，重新分散在50μL 100mmol/L pH＝5的醋酸钠缓冲液中，加入100μL TMB底物溶液，反应8分钟后，采用紫外分光光度计测定652nm处的吸光度。根据不同浓度Ag+标准溶液的吸光度值，作Ag+浓度-吸光度值的标准曲线并计算回归方程，标准曲线如图2所示，在Ag+浓度范围为0.1～100nmol/L时，线性方程为：
y＝0.0012x+0.1786
式中y为吸光度值，x为Ag+浓度，相关系数R2＝0.995，由相关系数可见，吸光度值与Ag+浓度的线性关系较好。经测试，检出限为0.02nmol/L。
(2)根据步骤(1)的方法测定待测样品的吸光度值，结合回归方程计算待测样品中所含Ag+的浓度。

Claims (10)

1.一种基于杂交链式-酶显色反应检测Hg2+和Ag+的生物传感器，其特征在于：所述生物传感器包括固定Helper DNA的磁珠、固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子、发夹探针HP2、TMB底物溶液；
所述磁珠为表面原位生长金纳米粒子的溶菌酶修饰的Fe3O4@C纳米材料，记为Fe3O4@C@lyz@Au，lyz代表溶菌酶；
所述固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子记为AuNPs-HRP-HP1DNA；
当检测物为Hg2+时，所述Helper DNA的序列为：TGTCTTGGTTTCGGCGTGGGTTTT；
当检测物为Ag+时，所述Helper DNA的序列为：ACTCTAGCATTCCGCCTGCCTTAA；
所述发夹探针HP1的序列为：GGGGGTTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG；
所述发夹探针HP2的序列为：AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于：所述固定Helper DNA的磁珠和固定发夹探针HP1的修饰有辣根过氧化物酶的金纳米粒子均均匀分散于重悬液中，所述重悬液为含3～6wt.％牛血清白蛋白、0.2～0.3wt.％吐温-20、8～12wt.％蔗糖的20mmol/L Na3PO4水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于：所述磁珠的粒径为150～250nm，金纳米粒子的粒径为15～20nm。
4.一种权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下述步骤：
步骤1：设计并合成发夹探针HP1、发夹探针HP2、Helper DNA；
步骤2：制备Fe3O4@C@lyz@Au
将Fe3O4磁性纳米粒子超声分散于葡萄糖水溶液中，在密闭条件下160～170℃反应5～6小时，得到Fe3O4@C纳米材料；将Fe3O4@C纳米材料均匀分散在含溶菌酶和三(2-羧乙基)膦盐酸盐的HEPES缓冲溶液中，于37℃下孵育20～40分钟，得到Fe3O4@C@lyz；将Fe3O4@C@lyz超声分散在HAuCl4的乙醇水溶液中，并加入NaBH4，室温反应，得到Fe3O4@C@lyz@Au；
步骤3：Fe3O4@C@lyz@Au固定Helper DNA
在pH＝5的醋酸缓冲溶液中加入Helper DNA和三(2-羧乙基)膦盐酸盐，混匀后37℃活化40～60分钟，再加入Fe3O4@C@lyz@Au，混匀后37℃继续活化40～60分钟，然后加入NaCl，37℃老化20～40分钟后，4℃继续老化5～6小时，得到Fe3O4@C@lyz@Au-Helper DNA；
步骤4：制备AuNPs-HRP-HP1 DNA
将金纳米粒子用NaOH水溶液调节pH至6～7，然后加入辣根过氧化物酶，振荡混匀后4℃静置2～3小时，得到修饰辣根过氧化物酶的金纳米粒子；在pH＝5的醋酸缓冲溶液中加入发夹探针HP1和三(2-羧乙基)膦盐酸盐，混匀后37℃活化40～60分钟，再加入修饰辣根过氧化物酶的金纳米粒子，混匀后37℃活化40～60分钟，然后加入NaCl，37℃老化20～40分钟后，4℃继续老化5～6小时，得到AuNPs-HRP-HP1 DNA。
5.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述Fe3O4@C纳米材料、溶菌酶、三(2-羧乙基)膦盐酸盐的质量比为1:1～2:6～8。
6.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤2中，所述Fe3O4@C@lyz、HAuCl4、NaBH4的质量比为1:30～35:3～5。
7.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述Fe3O4@C@lyz@Au、Helper DNA、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、NaCl的配比为1mg:0.12～0.24nmol:1.2～2.4nmol:0.6～1.8μmol。
8.根据权利要求4所述的生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤4中，所述金纳米粒子、辣根过氧化物酶的配比为2～3nmol:0.1～0.2mg，修饰辣根过氧化物酶的金纳米粒子、发夹探针HP1、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、NaCl的配比为1nmol:0.5～1nmol:5～10nmol:8～12μmol。
9.权利要求1所述的生物传感器在检测Hg2+或Ag+中的应用，具体检测方法如下：
(1)取Fe3O4@C@lyz@Au-Helper DNA、AuNPs-HRP-HP1 DNA、发夹探针HP2加入pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液中，然后加入不同浓度Hg2+标准溶液或不同浓度Ag+标准溶液，振荡混匀后，37℃温育40～60分钟，取出后继续振荡10～20分钟，磁分离去除上清液后，重新分散在pH＝5的醋酸钠缓冲液中，加入TMB底物溶液，反应5～10分钟后，测定652nm处的吸光度；根据不同浓度Hg2+或Ag+标准溶液的吸光度值，作Hg2+浓度-吸光度值或Ag+浓度-吸光度值的标准曲线并计算回归方程；
(2)根据步骤(1)的方法测定待测样品的吸光度值，结合回归方程计算待测样品中所含Hg2+或Ag+的浓度。
10.根据权利要求9所述的生物传感器在检测Hg2+或Ag+中的应用，其特征在于：步骤(1)中，将Fe3O4@C@lyz@Au-Helper DNA、AuNPs-HRP-HP1 DNA、发夹探针HP2加入pH＝8的Tris-HCl缓冲溶液中，使Tris-HCl缓冲溶液中Helper DNA的终浓度为0.15～0.2μmol/L，HelperDNA、发夹探针HP1、发夹探针HP2的终浓度之比为1:0.4～0.5:0.3～0.5。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114062672A (zh) * 2021-11-12 2022-02-18 福州大学 一种检测covid-19抗体的血糖生物传感器

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2688155A1 (en) * 2007-05-31 2009-02-05 The Regents Of The University Of California High specificity and high sensitivity detection based on steric hindrance & enzyme-related signal amplification
WO2018010681A1 (zh) * 2016-07-14 2018-01-18 青岛大学 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器
CN111235233A (zh) * 2020-01-21 2020-06-05 长江师范学院 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用
WO2021111461A1 (en) * 2019-12-02 2021-06-10 INDIAN INSTITUTE OF TECHNOLOGY MADRAS (IIT Madras) Nanozyme linked oligo probe sorbent assay (nlopsa) for the detection of nucleic acid biomarkers

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2688155A1 (en) * 2007-05-31 2009-02-05 The Regents Of The University Of California High specificity and high sensitivity detection based on steric hindrance & enzyme-related signal amplification
WO2018010681A1 (zh) * 2016-07-14 2018-01-18 青岛大学 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器
WO2021111461A1 (en) * 2019-12-02 2021-06-10 INDIAN INSTITUTE OF TECHNOLOGY MADRAS (IIT Madras) Nanozyme linked oligo probe sorbent assay (nlopsa) for the detection of nucleic acid biomarkers
CN111235233A (zh) * 2020-01-21 2020-06-05 长江师范学院 一种基于适配体识别-hcr反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李光文;王美丽;方权辉;黄胜;陈敬华;陈伟;张兰;唐淑榕;: "基于铜纳米线放大的汞离子高灵敏比色检测法", 分析试验室, no. 01 *
王承克;王晴晴;陈丹;: ""发夹"结构DNA用于生物分析传感器研究进展", 化学通报, no. 05 *
许宙;唐瑶;汪荣;陈茂龙;文李;程云辉;: "基于磁性纳米材料构建酶联增敏生物传感器检测双酚A", 食品与机械, no. 10 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114062672A (zh) * 2021-11-12 2022-02-18 福州大学 一种检测covid-19抗体的血糖生物传感器

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