CN113447547A - 基于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法，将二硫化钼吸附在碳工作电极表面，并共价链接纳米铂包金三角，在表面电聚合形成聚多巴胺膜层，将总前列腺特异性抗原t‑PSA和游离前列腺特异性抗原f‑PSA抗体固定在修饰电极上形成敏感电极，利用结果及浓度比值实现对前列腺癌症检测。利用了二硫化钼表面积、生物相容性及结构功能性等特性，配合纳米铂包金三角具备独特催化性能，共同作用增强电极电化学性能；利用聚多巴胺膜表面大量官能团为特异性抗原提供多位点，增进电极的生物敏感性；利用抗原抗体特异性结合对t‑PSA和f‑PSA检测，并利用结果及浓度比值实现对前列腺癌高精度检测。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器领域，尤其涉及基于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法。
背景技术
作为全球第五大主要死因，前列腺癌症的临床诊断主要依靠直肠指诊、血清PSA、经直肠前列腺超声和盆腔MRI检查。但由于其早期呈现出无症状的现象，导致了前列腺癌症发病率的逐年增加，同时致使影像学诊断方法存在局限。采用对血清中前列腺癌症的相关肿瘤标志物进行检测，实现对前列腺癌症进行筛查，将对前列腺癌症发病率进行有效控制。现如今国内外血清钟肿瘤标志物的检测手段常用酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫分析、生物发光免疫分析、化学发光免疫分析、聚合酶链式反应(PCR)和放射免疫分析等。各类检测方法存在设备大型、耗时长、且对操作人员技术要求高的问题，通常不仅需要被检测人员前往特定场所，血液样本也需要在实验室或医院进行进一步的处理。相应的，电化学生物传感技术通过生物识别元件应对各类检测对象，并将生物信号转换为可读的电信号结果，这种特性使得它可以实现对待测物质移动快速检测，同时具备低成本、灵敏快速的特点，可以很好解决上述问题。目前已广泛应用于各类生物物质的检测。
目前，现有技术方案广泛应用电化学生物传感器于前列腺癌症检测。例如：现有研究开发电化学免疫传感器在丝网印刷电极(SPE)修饰有基于金纳米颗粒(AuNPs)和壳聚糖(CHI)纳米复合膜检测前列腺特异性抗原(PSA)。稳态电流随PSA浓度在1-18ng/mL范围内线性增加，检测限为0.001ng/mL[1]。还有研究采用金纳米棒功能化的还原氧化石墨烯(AuNRs/rGO)来检测PSA。由于掺杂氟的氧化锡(FTO)电极的导电性增强，通过修饰具有更明显表面凹度和压痕的Au NRs，检测PSA获得了很强的初始电化学电流信号。线性范围和检出限(LOD)分别为0.01-1.0pg/mL和3.0fg/mL[2]。如上阐述的各类现有设计，目前电化学生物传感器用于前列腺癌的检测方法主要针对的目标物质为血液中的前列腺特异性抗原(PSA)，然而研究表明在较浓度范围(PSA＜10ng/mL)，由于浓度的上升可能源于前列腺炎症等其他疾病，其对于前列腺癌症的检测精准度较低。同时，如上所述为了放大电化学信号，电极通常采用各类纳米材料修饰选择，然而现有研究存在检测下限较高的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法，包括以下步骤：
1)在丝网印刷双通道电极的两个碳工作电极上修饰复合金属纳米材料：
(1)二硫化钼层修饰：将二硫化钼溶液滴加在清洗过的碳工作电极表面，在60-80℃条件下加热30-60分钟；
(2)纳米铂包金三角层修饰：将金三角溶液、硝酸银、抗坏血酸和去离子水加入反应瓶中，并在65-75℃条件下水浴20-25分钟，然后加入氯铂酸溶液，并将混合溶液放置过夜，得到纳米铂包金三角溶液；将制备的纳米铂包金三角滴加在修饰二硫化钼层工作电极表面，在60-80℃条件下加热30-60分钟；
(3)聚多巴胺层电聚合：中性pH条件下，在修饰有二硫化钼以及纳米铂包金三角的电极表面滴加多巴胺溶液，采用电化学循环伏安法在电极表面电聚合形成聚多巴胺膜层，形成修饰复合金属纳米材料电极；
2)在步骤(1)生成的修饰复合金属纳米材料电极上进一步修饰对两类前列腺癌肿瘤标志物特异性敏感生物分子，并将电极用于对两类前列腺肿瘤标志物进行检测，具体包括以下两个子步骤：
(1)两类特异性敏感生物分子修饰：对生成的修饰复合金属纳米材料电极进行进一步修饰，在双通道电极的两侧工作电极分别滴加识别游离前列腺特异性抗原(f-PSA)的特异性抗体溶液以及识别总前列腺特异性抗原(t-PSA)的特异性抗体溶液，并将电极在室温下静置2-4小时后完成两类特异性抗体物理吸附过程；
(2)两类前列腺肿瘤标志物检测：对修饰形成的双通道电极采用差分脉冲伏安法(DPV)进行f-PSA、t-PSA浓度的检测。
所述的二硫化钼层修饰是：将二硫化钼粉末溶于去离子水，制成浓度1mg/mL的二硫化钼溶液，修饰完成后使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干。
所述的纳米铂包金三角层修饰是：反应过程硝酸银浓度2mM、抗坏血酸浓度10mM，体积比为金三角溶液：硝酸银：抗坏血酸：去离子水＝1:0.02:0.2:9；后加入的氯铂酸溶液浓度1mM，体积比为氯铂酸：硝酸银＝2:1，修饰完成后使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干。
所述的聚多巴胺层电聚合是：将盐酸多巴胺与磷酸盐缓冲液在中性pH条件下混合震荡，制成浓度1mg/mL多巴胺溶液；将多巴胺溶液滴加到电极表面，使用循环伏安法扫描；实现聚多巴胺电聚合法修饰，聚合完成后使用去离子水冲洗电极表面并氮气吹干，形成表面自组装法修饰复合金属纳米材料的电极。
所述的循环伏安法扫描参数是扫描电压：-0.5V-0.5V，扫描步径：20mV/s，扫描圈数：10。
所述的两类特异性敏感生物分子修饰是：将f-PSA特异性抗体、t-PSA特异性抗体使用中性pH条件下磷酸盐缓冲液稀释，制成浓度1μg/mL的特异性抗体前溶液；修饰完成后使用去离子水冲洗电极表面并氮气吹干，完成生物敏感分子与复合金属纳米材料的连接，形成对f-PSA特异性抗原与t-PSA特异性抗原均敏感的生物分子修饰电极。
所述的两类前列腺肿瘤标志物检测是：利用差分脉冲伏安法，对不同浓度的f-PSA、t-PSA标准溶液以及空白对照组人工血清进行电化学检测，获得检测不同浓度标准溶液所得到的差分脉冲伏安法电流峰值，以及相同条件下对人工血清检测所得到电流峰值，二者求差并取绝对值得到电流的相对变化值；将标准溶液浓度对数与电流的相对变化值进行拟合，得到浓度拟合曲线，由于传感器在拟合曲线相应浓度范围内电流将随对应的前列腺肿瘤特异性抗原浓度而发生线性变化；通过对照检测目标前列腺肿瘤标志物得到的电流值和浓度拟合曲线，即可计算得到该检测目标的相应浓度，进而完成了前列腺癌症的检测。
所述的差分脉冲伏安法是，参数为扫描电压：-0.7V-0.4V，电压增幅：5mV，电压幅值：50mV，脉冲宽度：0.05V，采样带宽：0.0167s，脉冲周期：0.5s。
本发明公开了基于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法，将二硫化钼吸附在碳工作电极表面，并共价链接纳米铂包金三角，在表面电聚合形成聚多巴胺膜层，将总前列腺特异性抗原t-PSA和游离前列腺特异性抗原f-PSA抗体固定在修饰电极上形成敏感电极，利用结果及浓度比值实现对前列腺癌症检测。利用了二硫化钼表面积、生物相容性及结构功能性等特性，配合纳米铂包金三角具备独特催化性能，共同作用增强电极电化学性能；利用聚多巴胺膜表面大量官能团为特异性抗原提供多位点，增进电极的生物敏感性；利用抗原抗体特异性结合对t-PSA和f-PSA检测，并利用结果及浓度比值实现对前列腺癌高精度检测。
本发明的有益效果是：
1、本发明首次提出将二硫化钼/纳米铂包金三角结构用于电极修饰，利用该复合金属纳米材料结构，增强电极表面的电化学特性。其中二硫化钼纳米结构具有大可用表面积、高生物相容性以及多结构功能性等优异特性，并为纳米铂包金三角链接提供边缘的不饱和位点；而纳米铂包金三角的双金属结构展现出响应快、稳定性好、电催化能力强等特点，则更进一步的增强了二硫化钼对电极性能的提高作用，二者协同作用综合实现了电极电化学特性的增强，检测下限达到0.0001ng/mL；
2、本发明应用电聚合方法在电极表面形成聚多巴胺膜，采用电聚合方法可依靠改变反应过程中的电参数从而实现对聚多巴胺膜层厚度更精确的控制，保证了形成膜层形成更为均匀。同时，聚多巴胺膜表面具有大量官能团，为特异性抗原的结合提供更多位点，实现电极生物敏感性的增强；
3、本发明利用抗原抗体间特异性结合对t-PSA和f-PSA进行特异性检测，不仅可以实现对其含量的精准检测，进一步的，利用二者浓度比值可以实现对前列腺癌症的更高精度检测，尤其对灰区范围(t-PSA：4-10ng/mL)内的前列腺癌症病人较单一肿瘤标志物实现更为准确的诊查。
附图说明
图1是双通道电极修饰纳米材料以及生物物质并与目标物质特异性结合的示意图；
图2是初始双通道电极制备过程示意图；
图3是实施例1电极利用电化学循环伏安法在电极表面电聚合形成聚多巴胺膜层过程循环伏安扫描结果图
图4是实施例1制得电极在电极表面修饰复合金属纳米材料过程的循环伏安法对电极表征结果图
图5是实施例1制得电极空白电极的扫描电镜图像；
图6是实施例1制得电极修饰二硫化钼电极的扫描电镜图像；
图7是实施例1制得电极进一步修饰纳米铂包金三角电极的扫描电镜图像；
图8是实施例1制得电极进一步修饰形成聚多巴胺膜层电极的扫描电镜图像；
图9是实施例1制得电极应用于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法检测不同浓度(0.0001ng/mL,0.001ng/mL,0.01ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,50ng.mL以及100ng/mL)的f-PSA差分脉冲伏安法检测曲线；
图10是实施例1制得电极应用于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法检测不同浓度(0.0001ng/mL,0.001ng/mL,0.01ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,50ng.mL以及100ng/mL)的f-PSA差分脉冲伏安法检测曲线得到的拟合曲线；
图11是实施例1制得电极应用于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法检测不同浓度(0.0001ng/mL,0.001ng/mL,0.01ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,50ng.mL以及100ng/mL)的t-PSA差分脉冲伏安法检测曲线；
图12是实施例1制得电极应用于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法检测不同浓度(0.0001ng/mL,0.001ng/mL,0.01ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,50ng.mL以及100ng/mL)的t-PSA差分脉冲伏安法检测曲线得到的拟合曲线；
图13是实施例1制得电极应用于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法检测1ng/mL半胱氨酸(L-Cys)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)、总前列腺特异性抗原(t-PSA)以及游离前列腺特异性抗原(f-PSA)标准溶液差分脉冲伏安法检测曲线；
图14是实施例1制得电极应用于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法检测1ng/mL半胱氨酸(L-Cys)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)、总前列腺特异性抗原(t-PSA)以及游离前列腺特异性抗原(f-PSA)标准溶液N＝3条件下特异性柱状图；
图15是实施例1制得电极应用于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法检测1ng/mL半胱氨酸(L-Cys)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)以及总前列腺特异性抗原(t-PSA)标准溶液差分脉冲伏安法检测曲线；
图16是实施例1制得电极应用于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法检测1ng/mL半胱氨酸(L-Cys)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)以及总前列腺特异性抗原(t-PSA)标准溶液N＝3条件下特异性柱状图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。
本发明提供的一种基于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法，可以实现对两类前列腺癌肿瘤标志物微量生化检测的要求，该检测方法包括以下步骤：
实施例初始电极均选用电化学丝网印刷双通道电极，如图1所示，主要是在制备的双通道电极碳工作电极1表面依次修饰复合金属纳米材料2(包括：二硫化钼、纳米铂包金三角以及聚多巴胺)；进而在复合金属纳米材料修饰的双通道电极2上，通过官能团相互作用分别在两个工作电极连接对前列腺癌症肿瘤标志物敏感的分子：f-PSA特异性抗体(3A)、t-PSA特异性抗体(3B)；最终形成特异性捕获两类目标前列腺肿瘤标志物：f-PSA抗原(4A)、t-PSA抗原(4B)的双通道电极5。初始电化学丝网印刷双通道电极的制备，如图2所示，包括以下步骤：在丝网印刷电极基底I上铺设导电银层II，包括：参比电极整体；双工作电极以及对电极的接口部分。并在100℃烘箱内热固化1h；使用绝缘油墨，在对电极区域铺设绝缘防水层III，并在100℃烘箱内热固化5min；使用导电油墨碳，在对电极区域以及工作电极区域形成导电碳电极IV，并在100℃烘箱内热固化10min；使用绝缘油墨，在非电极接口区域，对电极范围外铺设绝缘防水层V，并在100℃烘箱内热固化5min。
实施例1
本实施例中，具体实施过程如下：
(1)在初始电极上修饰复合金属纳米材料，具体包括以下子步骤：
使用水、乙醇分别冲洗初始电极表面3次，清洗初始电极表面，去除表面杂质和氧化层。
将20g/mL二水合钼酸钠、26g/mL硫脲、倒入衬有聚四氟乙烯衬底的水热反应釜中，密封后在200℃下加热20h。待反应产物自然冷却至室温，分别使用乙醇和去离子水洗涤三次，离心，最后在真空下于60℃干燥过夜。将二硫化钼粉末溶于去离子水，制成浓度为1mg/mL的二硫化钼溶液，取5μL二硫化钼溶液滴加到清洗过的碳工作电极表面，并将电极在烘箱中60℃加热30分钟后，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干。
将氯金酸(2mM)与现用现配的硫代硫酸钠(0.5mM)依次加至反应瓶中混匀，其中氯金酸与硫代硫酸钠体积比为1:1.2，混合溶液在室温25℃下剧烈搅拌15min。然后在反应瓶中缓慢滴加现用现配的硫代硫酸钠(0.5mM)，与之前加入的硫代硫酸钠体积比为1:6，混合溶液在室温25℃下保持温和搅拌90min，并以6000rpm离心10min，制成金三角溶液；将制成的金三角溶液、硝酸银(2mM)、抗坏血酸(10mM)和去离子水依次加入反应瓶中，体积比为金三角溶液：硝酸银：抗坏血酸：去离子水＝1:0.02:0.2:9，并在65℃下水浴20分钟，然后加入之前硝酸银体积比为2:1的氯铂酸(1mM)，并将混合溶液放置过夜。将5μL铂纳米颗粒包覆金三角溶液滴加到二硫化钼修饰过的碳工作电极表面，电极在60℃加热30分钟后，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干。
将适量盐酸多巴胺与磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)混合震荡，制成浓度为1mg/mL的聚多巴胺前溶液。滴加100μL聚多巴胺前溶液到前述修饰过的电极，溶液覆盖电极的工作电极、对电极以及参比电极，如图3所示，使用循环伏安法扫描(扫描电压：-0.5V-0.5V，扫描步径：20mV/s，扫描圈数：10)实现聚多巴胺电聚合法修饰，第一圈正扫时有一个氧化峰，对应于多巴胺的氧化，接下来的逆扫过程中出现两个还原电流峰，对应多巴胺醌的还原和多巴胺色素的还原，第二圈正扫过程出现一个新的氧化峰，对应LDAC的氧化。扫描过程电极表面无色透明的聚多巴胺前溶液逐渐出现黑色，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干，最终形成表面层层自组装法修饰复合金属纳米材料的电极。
(2)在步骤(1)生成的修饰复合金属纳米材料电极上进一步修饰对两类前列腺癌肿瘤标志物特异性敏感生物分子：
两类特异性敏感生物分子修饰：将f-PSA特异性抗体、t-PSA特异性抗体均使用磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)稀释，制成浓度为1μg/mL的f-PSA特异性抗体前溶液、t-PSA特异性抗体前溶液；将5μL f-PSA特异性抗体前溶液、5μL t-PSA特异性抗体前溶液分别滴加到步骤(1)修饰过的双通道电极两侧工作电极表面，电极在25℃下静置2小时后，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干，完成生物敏感分子与复合金属纳米材料的连接，形成对两类前列腺癌症特异性抗原敏感的生物分子修饰电极。
实施例2
本实施例中，具体实施过程如下：
(1)在初始电极上修饰复合金属纳米材料，具体包括以下子步骤：
使用水、乙醇分别冲洗初始电极表面3次，清洗初始电极表面，去除表面杂质和氧化层。
将20g/mL二水合钼酸钠、26g/mL硫脲、倒入衬有聚四氟乙烯衬底的水热反应釜中，密封后在200℃下加热20h。待反应产物自然冷却至室温，分别使用乙醇和去离子水洗涤三次，离心，最后在真空下于60℃干燥过夜。将二硫化钼粉末溶于去离子水，制成浓度为1mg/mL的二硫化钼溶液，取5μL二硫化钼溶液滴加到清洗过的碳工作电极表面，并将电极在烘箱中70℃加热45分钟后，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干。
将氯金酸(2mM)与现用现配的硫代硫酸钠(0.5mM)依次加至反应瓶中混匀，其中氯金酸与硫代硫酸钠体积比为1:1.2，混合溶液在室温25℃下剧烈搅拌15min。然后在反应瓶中缓慢滴加现用现配的硫代硫酸钠(0.5mM)，与之前加入的硫代硫酸钠体积比为1:6，混合溶液在室温25℃下保持温和搅拌90min，并以6000rpm离心10min，制成金三角溶液；将制成的金三角溶液、硝酸银(2mM)、抗坏血酸(10mM)和去离子水依次加入反应瓶中，体积比为金三角溶液：硝酸银：抗坏血酸：去离子水＝1:0.02:0.2:9，并在70℃下水浴22分钟，然后加入之前硝酸银体积比为2:1的氯铂酸(1mM)，并将混合溶液放置过夜。将5μL铂纳米颗粒包覆金三角溶液滴加到二硫化钼修饰过的碳工作电极表面，电极在70℃加热45分钟后，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干。
将适量盐酸多巴胺与磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)混合震荡，制成浓度为1mg/mL的聚多巴胺前溶液。滴加100μL聚多巴胺前溶液到前述修饰过的电极，溶液覆盖电极的工作电极、对电极以及参比电极，使用循环伏安法扫描(扫描电压：-0.5V-0.5V，扫描步径：20mV/s，扫描圈数：10)实现聚多巴胺电聚合法修饰，第一圈正扫时有一个氧化峰，对应于多巴胺的氧化，接下来的逆扫过程中出现两个还原电流峰，对应多巴胺醌的还原和多巴胺色素的还原，第二圈正扫过程出现一个新的氧化峰，对应LDAC的氧化。扫描过程电极表面无色透明的聚多巴胺前溶液逐渐出现黑色，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干，最终形成表面层层自组装法修饰复合金属纳米材料的电极。
(2)在步骤(1)生成的修饰复合金属纳米材料电极上进一步修饰对两类前列腺癌肿瘤标志物特异性敏感生物分子：
两类特异性敏感生物分子修饰：将f-PSA特异性抗体、t-PSA特异性抗体均使用磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)稀释，制成浓度为1μg/mL的f-PSA特异性抗体前溶液、t-PSA特异性抗体前溶液；将5μL f-PSA特异性抗体前溶液、5μL t-PSA特异性抗体前溶液分别滴加到步骤(1)修饰过的双通道电极两侧工作电极表面，电极在25℃下静置3小时后，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干，完成生物敏感分子与复合金属纳米材料的连接，形成对两类前列腺癌症特异性抗原敏感的生物分子修饰电极。
实施例3
本实施例中，具体实施过程如下：
(1)在初始电极上修饰复合金属纳米材料，具体包括以下子步骤：
使用水、乙醇分别冲洗初始电极表面3次，清洗初始电极表面，去除表面杂质和氧化层。
将20g/mL二水合钼酸钠、26g/mL硫脲、倒入衬有聚四氟乙烯衬底的水热反应釜中，密封后在200℃下加热20h。待反应产物自然冷却至室温，分别使用乙醇和去离子水洗涤三次，离心，最后在真空下于60℃干燥过夜。将二硫化钼粉末溶于去离子水，制成浓度为1mg/mL的二硫化钼溶液，取5μL二硫化钼溶液滴加到清洗过的碳工作电极表面，并将电极在烘箱中80℃加热60分钟后，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干。
将氯金酸(2mM)与现用现配的硫代硫酸钠(0.5mM)依次加至反应瓶中混匀，其中氯金酸与硫代硫酸钠体积比为1:1.2，混合溶液在室温25℃下剧烈搅拌15min。然后在反应瓶中缓慢滴加现用现配的硫代硫酸钠(0.5mM)，与之前加入的硫代硫酸钠体积比为1:6，混合溶液在室温25℃下保持温和搅拌90min，并以6000rpm离心10min，制成金三角溶液；将制成的金三角溶液、硝酸银(2mM)、抗坏血酸(10mM)和去离子水依次加入反应瓶中，体积比为金三角溶液：硝酸银：抗坏血酸：去离子水＝1:0.02:0.2:9，并在75℃下水浴25分钟，然后加入之前硝酸银体积比为2:1的氯铂酸(1mM)，并将混合溶液放置过夜。将5μL铂纳米颗粒包覆金三角溶液滴加到二硫化钼修饰过的碳工作电极表面，电极在80℃加热60分钟后，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干。
将适量盐酸多巴胺与磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)混合震荡，制成浓度为1mg/mL的聚多巴胺前溶液。滴加100μL聚多巴胺前溶液到前述修饰过的电极，溶液覆盖电极的工作电极、对电极以及参比电极，使用循环伏安法扫描(扫描电压：-0.5V-0.5V，扫描步径：20mV/s，扫描圈数：10)实现聚多巴胺电聚合法修饰，第一圈正扫时有一个氧化峰，对应于多巴胺的氧化，接下来的逆扫过程中出现两个还原电流峰，对应多巴胺醌的还原和多巴胺色素的还原，第二圈正扫过程出现一个新的氧化峰，对应LDAC的氧化。扫描过程电极表面无色透明的聚多巴胺前溶液逐渐出现黑色，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干，最终形成表面层层自组装法修饰复合金属纳米材料的电极。
(2)在步骤(1)生成的修饰复合金属纳米材料电极上进一步修饰对两类前列腺癌肿瘤标志物特异性敏感生物分子：
两类特异性敏感生物分子修饰：将f-PSA特异性抗体、t-PSA特异性抗体均使用磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)稀释，制成浓度为1μg/mL的f-PSA特异性抗体前溶液、t-PSA特异性抗体前溶液；将5μL f-PSA特异性抗体前溶液、5μL t-PSA特异性抗体前溶液分别滴加到步骤(1)修饰过的双通道电极两侧工作电极表面，电极在25℃下静置4小时后，使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干，完成生物敏感分子与复合金属纳米材料的连接，形成对两类前列腺癌症特异性抗原敏感的生物分子修饰电极。取实施例1、2、3任意电极用于对两类前列腺肿瘤标志物进行检测。采用电化学差分脉冲伏安法技术检测游离前列腺特异性抗原(f-PSA)，总前列腺特异性抗原(t-PSA)，具体实施过程如下：
(1)对实施例1制得电极进行表征：
对电极进行电化学循环伏安法表征，从而验证各修饰材料对电极电化学特性的提升作用，结果如图4所示，未修饰任何材料的初始电极还原峰出现时峰电流约为84.4μA；经物理吸附二硫化钼层后，由于其可用表面积、高生物相容性以及多结构功能性，还原峰峰电流出现上升，达到了103.2μA；经修饰纳米铂包金三角层结构后，还原峰峰电流进一步出现上升，达到了117.8μA，这是由于纳米铂包金三角的双金属结构展现出的电催化能力强特点对电极的电化学特性在二硫化钼的基础上更进一步的增强；经电聚合形成聚多巴胺膜层后，还原峰电流有所下降，达到100.9μA，这是由于多巴胺在电极表面形成致密均匀含大量官能团的膜层，阻碍了电子的传递过程，但电流较初始电极相比仍有显著提升，且进一步增多了电极与后续抗体相连的位点，增进电极的生物敏感性。
对层层自组装过程电极表面进行扫描电镜表征，图5、6和7依次为初始碳工作电极电极、修饰二硫化钼层电极以及在此基础上进一步修饰纳米铂包金三角的电极，放大倍数均为80000倍，图中可以看出随着纳米材料层层自组装，在电极表面首先形成二硫化钼的层状结构，修饰并进一步形成纳米铂包金三角层。对电聚合形成聚多巴胺膜层的电极表面采用50000倍放大倍数下扫描电镜的表征，如图8所示，电极表面形成致密膜层，均一性良好。
(2)利用实施例1制得电极对两类前列腺肿瘤标志物检测：
(2.1)游离前列腺特异性抗原(f-PSA)检测，包括以下步骤：
配制浓度分别为0.0001ng/mL,0.001ng/mL,0.01ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,50ng.mL以及100ng/mL的f-PSA标准溶液，溶剂为人工血清；使用步骤(2)制备的基于生物敏感复合金属纳米材料的前列腺癌肿瘤标志物特异性抗体修饰的电化学反应电极，在电极表面滴加待测物质后，使用电化学差分脉冲伏安法进行扫描测试(扫描电压：-0.7V-0.4V，电压增幅：5mV，电压幅值：50mV，脉冲宽度：0.05V，采样带宽：0.0167s，脉冲周期：0.5s)，图9可以看到随着待测物质浓度增加，电流峰值逐渐下降。
标准曲线建立：将配制的f-PSA标准溶液，按照前述步骤进行电化学差分脉冲伏安法分析，根据单次测试的物质浓度以及得到的，建立差分脉冲伏安法电流峰值与f-PSA浓度之间的标准曲线，图10可以观察到电流值与f-PSA浓度之间具有良好的线性关系，得到浓度拟合曲线如下，其中ΔI1为浓度0.001-1.000ng/mL，ΔI2为浓度1.000-100.000ng/mL，在这一范围内电流随f-PSA浓度而线性变化，完成对f-PSA浓度检测。
ΔI1＝0.451×lgCf-PSA+4.794
ΔI2＝1.086×lgCf-PSA+4.699
(2.2)总前列腺特异性抗原(t-PSA)检测，包括以下步骤：
标准溶液制配：配制浓度分别为0.0001ng/mL，0.001ng/mL，0.01ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng.mL以及100ng/mL的t-PSA标准溶液，溶剂为人工血清；
t-PSA电化学差分脉冲伏安法检测：使用本实例制备的基于生物敏感复合金属纳米材料的前列腺癌肿瘤标志物特异性抗体修饰的电化学反应电极，在电极表面滴加待测物质后，使用电化学差分脉冲伏安法进行扫描测试(扫描电压：-0.7V-0.4V，电压增幅：5mV，电压幅值：50mV，脉冲宽度：0.05V，采样带宽：0.0167s，脉冲周期：0.5s)，图11可以看到随着待测物质浓度增加，电流峰值逐渐下降。
标准曲线建立：以步骤(2.1)配制的t-PSA标准溶液，按照步骤(2.2)进行电化学差分脉冲伏安法分析，建立差分脉冲伏安法电流峰值与t-PSA浓度之间的标准曲线，图12可以观察到电流值与t-PSA浓度之间具有良好的线性关系，得到浓度拟合曲线，其中ΔI1为浓度0.001-1.000ng/mL，ΔI2为浓度1.000-100.000ng/mL，在这一范围内电流随t-PSA浓度而线性变化，完成对t-PSA浓度检测。生物敏感的复合纳米金属结构修饰电极，在电化学检测过程中不仅提升了检测响应，也改善了检测精度；
AI1＝0.753×lgCt-PSA+6.424
ΔI2＝1.205×lgCt-PSA+6.515
(3)利用实施例1制得电极，检测电极当血清中其他物质同时存在时对游离前列腺特异性抗原(f-PSA)，总前列腺特异性抗原(t-PSA)检测的特异性：
(3.1)游离前列腺特异性抗原(f-PSA)特异性测试：
配制干扰物质为浓度均为1ng/mL的半胱氨酸(cys)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)、总前列腺特异性抗原(t-PSA)标准溶液以及目标物质为游离前列腺特异性抗原(f-PSA)，溶剂为人工血清；按照步骤(3.1)进行电化学差分脉冲伏安法分析，依次测定人工血清、半胱氨酸(L-Cys)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)、总前列腺特异性抗原(t-PSA)标准溶液以及游离前列腺特异性抗原(f-PSA)，图13可以观察到各类干扰物质加入时，电流峰值与测定人工血清即空白对照基本一致，而当滴加目标物质游离前列腺特异性抗原(f-PSA)后，电流峰值显著降低，对应N＝3绘制特异性柱状图如图14所示。这表明该测试方法可以很好的从各类干扰物质中分辨出测试目标物质f-PSA，这是由于这一测试方法利用了抗原抗体间的特异性结合，因此生物敏感的复合纳米金属结构修饰电极，在电化学检测过程中具有良好的特异性。
(3.2)游离前列腺特异性抗原(f-PSA)特异性测试：
配制干扰物质为浓度均为1ng/mL的半胱氨酸(cys)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)以及目标物质为总前列腺特异性抗原(t-PSA)标准溶液，溶剂为人工血清；按照步骤(3.3)进行电化学差分脉冲伏安法分析，依次测定人工血清、半胱氨酸(L-Cys)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、牛血清白蛋白(BSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)以及总前列腺特异性抗原(t-PSA)标准溶液，图15可以观察到干扰物质电流峰值与人工血清基本一致，而当滴加目标物质总前列腺特异性抗原(t-PSA)后，电流峰值显著降低，对应N＝3绘制特异性柱状图如图16所示。这表明该测试方法可以很好的从各类干扰物质中分辨出测试目标物质t-PSA，这是由于这一测试方法利用了抗原抗体间的特异性结合，因此生物敏感的复合纳米金属结构修饰电极，在电化学检测过程中具有良好的特异性。
将本发明设计的传感器与其他电化学免疫传感器应用于前列腺癌检测的比较如下所示。本设计与几年来发表的相关其他电化学免疫传感器应用于前列腺癌检测相比，首先，与大多电化学传针对单一t-PSA作为目标物质不同，采用了双肿瘤标志物进一步增加对前列腺癌症指征的特异性。其次，由于选取二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺纳米修饰，具有较宽的检测范围以及良好的线性度，且具有较低的检测下限。(DPV:差分脉冲伏安法)
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
主要参考文献
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Claims (8)
1.一种基于二硫化钼/纳米铂包金三角/聚多巴胺的前列腺癌肿瘤标志物检测方法，其特征是，包括以下步骤：
1)在丝网印刷双通道电极的两个碳工作电极上修饰复合金属纳米材料：
(1)二硫化钼层修饰：将二硫化钼溶液滴加在清洗过的碳工作电极表面，在60-80℃条件下加热30-60分钟；
(2)纳米铂包金三角层修饰：将金三角溶液、硝酸银、抗坏血酸和去离子水加入反应瓶中，并在65-75℃条件下水浴20-25分钟，然后加入氯铂酸溶液，并将混合溶液放置过夜，得到纳米铂包金三角溶液；将制备的纳米铂包金三角滴加在修饰二硫化钼层工作电极表面，在60-80℃条件下加热30-60分钟；
(3)聚多巴胺层电聚合：中性pH条件下，在修饰有二硫化钼以及纳米铂包金三角的电极表面滴加多巴胺溶液，采用电化学循环伏安法在电极表面电聚合形成聚多巴胺膜层，形成修饰复合金属纳米材料电极；
2)在步骤(1)生成的修饰复合金属纳米材料电极上进一步修饰对两类前列腺癌肿瘤标志物特异性敏感生物分子，并将电极用于对两类前列腺肿瘤标志物进行检测，具体包括以下两个子步骤：
(1)两类特异性敏感生物分子修饰：对生成的修饰复合金属纳米材料电极进行进一步修饰，在双通道电极的两侧工作电极分别滴加识别游离前列腺特异性抗原(f-PSA)的特异性抗体溶液以及识别总前列腺特异性抗原(t-PSA)的特异性抗体溶液，并将电极在室温下静置2-4小时后完成两类特异性抗体物理吸附过程；
(2)两类前列腺肿瘤标志物检测：对修饰形成的双通道电极采用差分脉冲伏安法(DPV)进行f-PSA、t-PSA浓度的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，二硫化钼层修饰是：将二硫化钼粉末溶于去离子水，制成浓度1mg/mL的二硫化钼溶液，修饰完成后使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是，纳米铂包金三角层修饰是：反应过程硝酸银浓度2mM、抗坏血酸浓度10mM，体积比为金三角溶液：硝酸银：抗坏血酸：去离子水＝1:0.02:0.2:9；后加入的氯铂酸溶液浓度1mM，体积比为氯铂酸：硝酸银＝2:1，修饰完成后使用大量去离子水缓慢冲洗电极表面并氮气吹干。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是，聚多巴胺层电聚合是：将盐酸多巴胺与磷酸盐缓冲液在中性pH条件下混合震荡，制成浓度1mg/mL多巴胺溶液；将多巴胺溶液滴加到电极表面，使用循环伏安法扫描；实现聚多巴胺电聚合法修饰，聚合完成后使用去离子水冲洗电极表面并氮气吹干，形成表面自组装法修饰复合金属纳米材料的电极。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是，循环伏安法扫描参数是扫描电压：-0.5V-0.5V，扫描步径：20mV/s，扫描圈数：10。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是，两类特异性敏感生物分子修饰是：将f-PSA特异性抗体、t-PSA特异性抗体使用中性pH条件下磷酸盐缓冲液稀释，制成浓度1μg/mL的特异性抗体前溶液；修饰完成后使用去离子水冲洗电极表面并氮气吹干，完成生物敏感分子与复合金属纳米材料的连接，形成对f-PSA特异性抗原与t-PSA特异性抗原均敏感的生物分子修饰电极。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是，两类前列腺肿瘤标志物检测是：利用差分脉冲伏安法，对不同浓度的f-PSA、t-PSA标准溶液以及空白对照组人工血清进行电化学检测，获得检测不同浓度标准溶液所得到的差分脉冲伏安法电流峰值，以及相同条件下对人工血清检测所得到电流峰值，二者求差并取绝对值得到电流的相对变化值；将标准溶液浓度对数与电流的相对变化值进行拟合，得到浓度拟合曲线，由于传感器在拟合曲线相应浓度范围内电流将随对应的前列腺肿瘤特异性抗原浓度而发生线性变化；通过对照检测目标前列腺肿瘤标志物得到的电流值和浓度拟合曲线，即可计算得到该检测目标的相应浓度，进而完成了前列腺癌症的检测。
8.如权利要求7所述的方法，其特征是，差分脉冲伏安法是，参数为扫描电压：-0.7V-0.4V，电压增幅：5mV，电压幅值：50mV，脉冲宽度：0.05V，采样带宽：0.0167s，脉冲周期：0.5s。
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