FI119894B - Elektrokemiluminesenssiin perustuva analyysimenetelmä ja siinä käytettävä laite - Google Patents

Description

5

ELEKTROKEMILUMINESENSSIIN PERUSTUVA ANALYYSIMENETELMÄ JA SIINÄ KÄYTETTÄVÄ LAITE

KEKSINNÖN KÄYTTÖALUE

Keksintö käsittelee katodiseen el ektrokem i 1 um i n esen s si detektoi n ti i n perustuvia analyysimenetelmiä ja laitteita. Erityisesti keksintö soveltuu hajautetun analytiikan kvantitatiiviseen pikadiagnostiikkaan.

10

KEKSINNÖN TAUSTA

Tällä hetkellä vallitsee yleisesti suuri kysyntä nopeille, herkille ja kvantitatiivisille diagnostiikkateknologioille. Nämä soveltuvat käytettäviksi laajalla markkina-alueella 15 käsittäen terveydenhoidon, tutkimuksen, maatalouden, ympäristöhuollon ja eläinlääkinnän sekä tietyt teollisuustuotannon alueet. Parantunut herkkyys, ajansäästö, käytön helppous, kestävyys ja alentuneet testikohtaiset kustannukset ovat tekijöitä, joiden toteutuminen näissä diagnostiikkateknologioissa voi avata aivan uusiakin käyttökohteita.

20

Tietyillä diagnostiikkateknologioilla voidaan saavuttaa suuri herkkyys, mutta ne ovat liian kalliita. Toiset taas saattavat olla kaupallisesti kilpailukykyisiä, mutta eivät ole riittävän laajasti sovellettavissa erilaisille markkina-alueille. Teknologialla, jossa on kyetty yhdistämään kaikki nämä vaatimukset, on tulevaisuudessa tärkeä sija ja suuri 25 markkinapotentiaali.

Diagnostiikassa on käytössä joukko erilaisia analysointimenetelmiä: esimerkiksi radioaktiivisuuten perustuva määritys, entsyymilinkattu immunomääritys (ELISA), kolorimetriset määritykset ja fluoresenssiin, kemiluminesenssiin ja anodiseen tai 30 kuumien elektronien indusoimaan (ns. katodiseen) elektrokemiluminesenssiin (EKL) perustuvat määritykset. Kuumien elektrodien indusoima EKL on kuvattu yksityiskohtaisesti patentissa US 6251690, Kulmala S., ym. Jokaisella näistä tekniikoista on markkinakelpoisuuden määrittelevä oma ominainen kombinaationsa herkkyystasojen, helppokäyttöisyyden, kestävyyden, nopeuden ja käyttökustannusten 2 suhteen. Eroavaisuudet em. ominaisuuksien kohdalla johtuvat menetelmien fysikaalisista rajoituksista. Esimerkiksi monien radioaktiiviseen leimaukseen perustuvien sovellutusten huonona puolena on itse leiman heikentyminen ajan kuluessa radioaktiivisen hajoamisen seurauksena ja radioaktiivisen jätteen aiheuttamat 5 ylimääräiset kustannukset sekä turvallisuus- että ympäristönäkökohtien kannalta.

Monien herkkien menetelmien soveltamista hajautetun diagnostiikan alueella rajoittaa testien ja laitteiden äärimmäinen monimutkaisuus, jolloin vain asiantuntijat pystyvät suorittamaan määritykset. Määrityksen monimutkaisuus on useimmiten myös suoraan verrannollinen laitteen ja/tai testin hintaan. Esimerkkinä voidaan mainita mm. 10 kaupallisesti suosituksi detektointimenetelmäksi noussut anodinen elektrokemiluminesenssi, johon perustuvat määrityslaitteistot ovat käyttöominaisuuksiltaan monimutkaisia laboratoriorobotteja, joiden käyttö vaatii asiantuntijaosaamista ja joissa mittausprosessi sisältää toistuvia kompleksisia pesu- ja valmisteluvaiheita. Kaikki em. seikat ovat tekijöitä, jotka lisäävät määritysten 15 kustannuksia ja myös kasvattavat jätemäärää sekä tekevät siten käytännössä mahdottomaksi analyysimenetelmän soveltamisen hajautetun analytiikan tarpeisiin.

Kaupallisesti tärkeät mittausmenetelmät perustuvat siihen, että analysoitavat aineet saadaan tunnistettua ja mitattua seoksista ns. leima-aineilla. Biologisten molekyylien 20 ominaisuuksiin perustuvissa mittauksissa, kuten immunomäärityksissä, voidaan mitattava analyytti (X) valikoivasti kiinnittää erilaisten molekyylien seoksesta kiinteään faasiin liitettyyn vasta-aineeseen ja siihen tarttuneet molekyylit mitata toisen, myös aineeseen (X) valikoivasti kiinnittyvän vasta-aineen avulla, joka on merkattu eli leimattu sopivalla merkkiaineella. Merkkiaineita voivat olla radioaktiiviset isotoopit, 25 entsyymit, valoa absorboivat, fluoresoivat tai fosforesoivat molekyylit, tietyt metallikelaatit jne, jotka on liitetty kiinteällä sidoksella vasta-aineeseen. Vaihtoehtoisesti puhdistettu (X) voidaan merkata ja määrittää sen avulla tuntemattoman näytteen merkkaamattoman (X):n määrä kilpailureaktiolla. Myös DNA:n ja RNA:n mittausmenetelmät perustuvat valikoivaan bioaffiniteettiin ja voidaan siten mitata 30 analogisesti. Myös monia muita kemiallisia ja biokemiallisia analyysejä voidaan tehdä näin. Nykyisin pyritään yhä enenevässä määrin mittaamaan, kustannusten alentamiseksi ja/tai mittaustarkkuuden lisäämiseksi, näytteestä samanaikaisesti useita eri parametreja. Eräänä mahdollisuutena on käyttää eri aallonpituudella fluoresoivia ja fosforesoivia (luminoivia) tai eliniältään erilaisia merkkiaineita. Erilaisia mittaustapoja ja strategioita, 3 joita voidaan käyttää immunodiagnostiikassa on kuvattu kirjassa The Immunoassay Handbook, Edited by David Wild, Stockton Press Ltd., New York, 1994, sivuilla 1-618. Luonnollisesti on mahdollista määrittää merkkiaineita liuoksista myös sellaisenaan ilman, että ne on kiinnitetty merkkiaineiksi.

5

On ennestään tunnettua, että analytiikassa käytettäviksi leima-aineiksi soveltuvia orgaanisia yhdisteitä ja metallikelaatteja voidaan virittää valolla tai elektrokemiallisesti ja tuottaa täten leima-aineille spesifistä luminesenssia. Tähän perustuvat menetelmät ovat yleensä erityisen herkkiä ja soveltuvat hyvin leima-aineiden virittämiseen. 10 Kuitenkin, koska mitattavat väkevyydet ovat äärimmäisen pieniä, esiintyy myös tapauskohtaisia vaikeuksia; fluoresenssin käyttöä voi vaikeuttaa muun muassa Tyndallin, Rayleighin ja Ramanin sironnat. Biologisia näytteitä mitattaessa esiintyy lähes poikkeuksetta voimakas virityspulssin jälkeen nopeasti purkautuva taustafluoresenssi. Fosforesenssi on liuosfaasissa hyödynnettävissä lähinnä vain 15 lantanidi-ionien ja valta vasten syntetisoitujen orgaanisten molekyylien välisten kelaattien yhteydessä. Näiden hitaasti purkautuvaan fotoluminesenssiin perustuvien leimayhdisteiden viritystekniikoiden ongelmana on laitteiden monimutkaisuus ja kalleus mm. herkistä optisista komponenteista johtuen.

20 Yleisesti tarkasteltaessa EKL:n erityisenä etuna on sähköisen viritystavan edullinen hinta ja yksinkertaisempi rakenne, koska ei tarvita monimutkaista viritysoptiikkaa, verrattuna fotoluminesenssiin, minkä lisäksi em. monet fotoluminesenssiin liittyvät vaikeudet vältetään. Tavanomainen ns. anodinen elektrokemiluminesenssi, jossa käytetään inerttejä metallielektrodeja, on toteutettavissa orgaanisilla luminoforileimoilla 25 suhteellisen yksinkertaisella laitteistolla vedettömissä liuottimissa. Kuitenkin bioaffiniteettimääritykset, joihin kohdistuu suurin kaupallinen kiinnostus, toimivat lähinnä vain vesiliuoksissa. Tällaiset näytteet ovatkin miltei aina vesiliuoksia ja siten leimayhdisteiden mittausmenetelmän tulee toimia vedessä tai ainakin misellaarisessa vesiliuoksessa. Lisäksi vain tietyt harvat transitiometallikelaatit voivat toimia EKL-30 leimoina anodisessa EKL:ssä vesi- tai miselliliuoksissa,

Toistaiseksi kaupallisesti merkittävin anodiseen EKL:iin perustuva analyyttisen kemian sovellus on Ru(bpy)32+-kelaatin johdannaisia leima-aineina hyödyntävä menetelmä, jossa leiman detektiovaihe tapahtuu misellaarisessa vesiliuoksessa. On huomioitava, 4 että misellaariset seokset ovat aina useille erilaisille häiriötekijöille herkkiä johtuen misellitasapainojen hallitsemattomasta monimutkaisuudesta. Kuumien elektronien indusoima EKL, joka ei ole riippuvainen miselleistä, omaa siten useita merkittäviä etuja verrattuna anodiseen EKL:iin, joka on myös käyttökelpoinen sekä 5 immunomäärityksissä että DNA-hybridisaatiomenetelmissä (Blackburn, G., ym., 1991, Clin. Chem. 37: 1534-1539; Kenten, J., ym. 1992, Clin. Chem. 33: 873-879.;). Tässä nykyisin Roche Diagnosticsin kaupallisesti hyödyntämässä menetelmässä immunomäärityksissä ja DNA- tai RNA-koetinsovellutuksissa käytetään apuna magneettisia partikkeleja, joiden avulla analyytin kvantitoinnissa käytettävä leima-aine 10 saatetaan laboratoriorobotilla kullasta valmistetulle jatkuvakäyttöiselle työelektrodille (Massey; Richard J., ym. US 5746974; Leland; Jonathan K., ym. US 5705402). Magneettisten lateksipartikkeleiden toistettava käsittely on kuitenkin monessa suhteessa hankalaa, minkä vuoksi tämä menetelmä on käyttökelpoinen vain kalliiden laboratoriorobottien yhteydessä (esim. Elecsys 1010 ja 2010), joissa on monimutkainen 15 ja tarkka nesteiden käsittelylaitteisto. Lisäksi jatkuvakäyttöinen massiivikultainen työelektrodi vaatii pitkällisen puhdistus- ja esikäsittelyn kunkin analyysin välillä (Elecsys Service Manual, s. 70).

Erityisenä puutteena kuumien elektronien indusoiman EKL:n käytölle 20 bioaffiniteettimäärityksissä on tarvittava pitkä inkubointiaika keskenään reagoivien molekyylien saattamiseksi kineettiseen tasapainotilaan, joka puolestaan on välttämätöntä analyysitarkkuuden optimoimiseksi. Tämän keksinnön mukaisesti saadaan huomattava parannus katodiseen EKLriin perustuvaan menetelmään erityisesti, koska reaktioaikoja saadaan nopeutettua käyttämällä patenttivaatimuksessa 1 esitettyä 25 laitetta, jolle on ominaista ohuen tasaisen huokolevyn läsnäolo kyseisen reaktion aikana työelektrodin pinnalla, tai patenttivaatimuksessa 9 esitettyä menetelmää.

KUVIEN SELITYS

30 Kuva 1. Kaaviokuva keksinnön mukaisesta johde/eriste/huokolevy-laitteesta (JEH). Elektrodirakenteet voivat sisältää johteen (101), eristekerroksen (102) ja huokolevyn (103), jolloin rakenteesta käytetään lyhennettä JEH.

5

Kuva 2. Eräs käytännön ratkaisu toteuttaa JEH-periaatteen mukainen EKL-mittalaitteen testiliuska, johon kuumia elektroneja injektoiva eristepintainen työelektrodina toimiva Si-anturi on kiinnitetty. Samassa kuvassa näkyy myös eristepintaisen elektrodin päällä oleva liukuvaan kelkkaan kiinnitetty huokolevyn sisältävä kansiosa. Liukuvan 5 kansiosan ja testiliuskan rakenne on toteutettu niin, että ala-asennossa huokolevy asettuu tiiviisti Si-anturin pintaan ja alkaessaan liukua ylöspäin nousee irti piin pinnasta sekä asettuu taas liuskan runko-osaa vasten yläasennossa. Esimerkki testiliuskan rakenteesta (kuva 2). Testiluskassa on liikkuva kansi (1), joka liikkuessaan vartta (3) pitkin nousee ylös (9) ja lukkiutuu lopuksi paikalleen aivan varren päässä. Tutkittava 10 näyte lisätään aukosta (2). Aukon alapuolella on huokolevy (5) joka on painettu piielektrodia (6) vasten piikien (8) avulla. Piielektrodin alapuolella on metallijohdin (7), josta saadaan kontakti (4) ulkopuoliseen virtalähteeseen .

Kuva 3. Luminesenssilaitteen mittauskennon rakenteita. Kuvassa 3A kennossa (1) 15 testiliuska (4) on mittausasennossa. Mittauskennon yläosassa on sekoitusmoottori (3) ja testliuskassa kontakti (5) sähköistä viritystä varten. Pesu jäljestetään liittimien (2) kautta. Kuvassa 3B mittauskenno (8) on kertakäyttöinen. Pesu on järjestetty liittimien (2) kautta. Pesu/mittausliuos tuodaan kennoon sähköä johtavan teräsputken (6) kautta, joka toimii samalla anodina. Nesteen poisto tapahtuu toisen putken (7) kautta. 20 Testiliuskan (4) sähköiset kontaktit sijaitsevat liuskan yläosassa.

Kuva 4. Mittauskennon pesujäijestely. Letkupumpulla (1) siirretetään letkun (2) kautta pesunestettä (5) kennoon (4). Sama letkupumppu imee kennon yläosasta koko ajan toista letkua (3) myöten, joka on paksumpi kuin toinen letku (2). Venttiilillä (9) valitaan 25 imu kennon alaosasta tai yläosasta. Ohuemman letkun venttiilin (10) ollessa suljettuna voidann kenno tyhjentää kennon alaosasta. Kenno voidaan tarvittaessa pestä (6) venttiiliä (8) säätämällä

Kuva 5. Testiliuskaan istutettava kertakäyttöinen mittauskenno. Kuvassa 5A 30 piielektrodi on istutettu sähköä johtavaan kehikkoon (3) sähköä eristävän aineen (2) avulla. Kuvassa 5B on esitetty, miten laitteesta saadaan luminesenssi (4) koko elektrodin alueelta.

6

Kuva 6. Testiliuska. Kuvassa 6A testiliuska on esitetty yläpuolelta ja kuvassa 6B alapuolelta. Piielektrodi (1) on istutettu testiliuskaan sähköä eristävän aineen (2) avulla. Katodiin (1) ja anodiin (3) saadaan suoraan sähköinen kontakti testiliuskan alapuolelta.

5 Kuva 7. Testiliuska, jossa kaikki tarvittavat reagenssit on kuivattuna valmiina ja jossa analyysin käynnistäminen ja pysäyttäminen on kontroloitu. Kuvassa 7A testiliuska on käyttövalmiina. Kehikon (1) pohjalla on ohut huokolevy (2), johon on kuivattu tarvittavat reagenssit. Huokolevy on piielektrodin yläpuolella, mutta ei kosketa elektrodia. Kehikon (1) alapuolella on kimmoisasta materiaalista valmistettu osa (3), 10 joka toimii jousena. Kun näyte on lisätty huokolevyn (2) päälle, liuottaa näyte kuivatut reagenssit. Reaktio piielektrodin pinnan kanssa käynnistetään painamalla kehikko alas, jolloin huokolevy asettuu piielektrodin päälle ja näyte leviää piielektrodin alueelle. Halutun ajan kuluttua kehikko (1) vapautetaan ala-asennosta ja reaktio voidaan pysäyttää. Kuvassa 7B kehikko (1, 3) on työnnetty testiliuskan sisään halutun 15 reaktioajan jälkeen. Piielektrodi (4) on kiinnitetty testiliuskaan sähköä eristävän aineen (6) avulla ja anodi (5) toimii samalla matalan altaan reunoina. Kuvassa 7C testiliuska on pesuvaiheessa. Pesu-ulokkeen (7) avulla piielektrodi pestään tarvittaessa ennen elektrokemiluminesenssin mittausta.

20 Kuva 8. Multiparametrinen testiliuska. Testiliuskaan voidaan lisätä useampia reaktiovyöhykkeitä. Osa niistä voi toimia negatiivisina ja positiivisina kontrolleina.

Kuva 9. Si-antureiden säilyvyystesti vuoden ajalta mitattuna heterogeenisellä hCRP-immunomäärityksellä JEH-laitteella ja luminesenssimittalaitteella. CRP-pitoisuudet (a) 25 0, (b) 10, (c) 30 ja (d) 100 ng/ml.

Kuva 10. Si-antureiden oksidikerroksen paksuuden vaikutus EKLriin, (a) 10'7 M Tb(III) kelatoitu 2,6-bis[N,N-bis(karboksimetyyli)aminometyyli]-4-bentsoyylifenolilla (b) kontrolliliuos (mittauspuskuri).

30

Kuva 11. EKL-mittalaitteella ja testiliuskalla (JEH) mitattu pelkän leimaluminoforin terbium-2,6-bis[N,N-bis(karboksimetyyli)aminometyyli]-4-bentsoyylifenoli -kelaatin vakiointi-suora, mittauskenno täytettiin mittauspuskuriin sekoitetulla leimaluminoforilla.

7

Kuva 12. Erilaisia leimavasta-aineen leimaukseen soveltuvia luminoforeja rakenteineen ja EKL-spektreineen (ANS = 4-amino-l-naftaleenisulfonaatti, FMOC-OH = hydrolysoitu 9-fluorenyylimetyyli kloroformaatti, Tb(III)-Ll = Tb(III) kelatoitu 2,6-bis[N,N-bis(karboksimetyyli)aminometyyli]-4-bentsoyylifenolilla, Ru(bpy)32+ = 5 rutenium(II) tris-(2,2’-bipyridine kelaatti, Yb(III)-Ll = Yb(III) kelatoitu 2,6-bis[N,N-bis(karboksimetyyli)aminometyyli]-4-bentsoyylifenolilla). Käytettävissä on siten koko UV-VIS-NIR spektrialue. Mittaukset tehtiin JEH-laitteella ja luminesenssimittalaitteella.

10 Kuva 13. Heterogeenisen hCRP-immunomäärityksen standardikuvaaja (kts. Esimerkki 2).

Kuva 14. Heterogeeninen hCRP-immunomääritys seruminäytteillä (kts. Esimerkki 3).

15 Kuva 15. Homogeeninen hCRP-immunomääritys standardinäyteliuoksilla (kts. Esimerkki 4).

Kuva 16. Heterogeenisen hTSH-immunomäärityksen standardinäytteillä mitattu kuvaaja (kts. Esimerkki 5).

20

Kuva 17. Kalibraatiokäyrä heterogeenisestä hTSH-immunomäärityksestä seruminäytteillä. hTSH-standardit valmistettiin seerumiin (kts. Esimerkki 6).

Kuva 18. Kalibraatiokäyrä heterogeenisestä hTSH-immunomäärityksestä 25 kokoverinäytteillä. hTSH-standardit valmistettiin heparinisoituun kokoverinäytteeseen (kts. Esimerkki 7). Mittaukset tehtiin JEH-laitteella ja luminesenssimittalaitteella (Kuva 9, Esimerkki 2).

Kuva 19. Kuvassa 19A on esitetty läpivirtauskennosovellutus JEH-laitteesta, jossa 30 affiniteettiin perustuva reaktio voidaan tehdä huokolevyllä tai piielektrodin pinnalla. Kuvassa 19B sivu (7) on irroitettu, jotta rakenteet näkyvät paremmin. Huokolevy (4) toimii nesteen kuljettimena ja siihen voidaan kuivata erilaisia reagensseja (esim. leimattu vasta-aine). EKL:n mittaus tapahtuu suoraan huokolevyn (4) läpi. Näyte lisätään suoraan huokolevyn (4) päälle, jolloin reaktio käynnistyy. Mittausta varten 8 kammioon (6) lisätään liuosta niin paljon, että muodostuu kontakti anodin (5) ja piielektrodin (3) kanssa. Pesu tapahtuu sisääntulon (1) ja ulosviennin (2) kautta, jolloin neste kulkee huokolevyä pitkin. Kammion (6) päällä voi olla kansi ja siinä aukko näytteen lisäystä varten.

5

Kuva 20. Kuvan 15 laitteella mitattu tyypillinen standardikuvaaja heterogeenisestä hCRP-immunomäärityksestä (kts. Esimerkki 8).

Kuva 21. Laadunvalvontakuva Si-anturin fysikaaliseen adsoptioon perustuvasta vasta-10 ainepinnoituksesta AFM-mittauksella.

Kuva 22. Polystyreenin pintakuva AFM-mittauksella. Pinnan epätasaisuudet estävät AFM:n tehokkaan käytön pinnoituksen kontrollissa (kts. Esimerkki 10).

15

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

Tämän keksinnön mukaisesti erilaisia analyysejä voidaan tehdä yksinkertaisilla ja 20 halvoilla laitteilla yhtä hyvin kuin on tunnettua johdannossa kuvatuilla monimutkaisilla laitteilla, kun itse immunomääritys tai DNA-hybridisaatio tehdään kertakäyttöisen työelektrodin pinnalla olevaa huokolevyä hyväksi käyttäen (JEH-laite). Tällöin mittalaite ja mittakenno ovat riittävän halpoja hajautetun analytiikan tarpeisiin.

25 Huokolevyllä tarkoitetaan tässä keksinnössä huokoista nestettä läpäisevää alle 100pm paksuista kalvoa, joka on muodostettu katodina toimivan EKL elektrodin päälle. Katodinen EKL-elektrodi, toisin kuin anodinen EKL-elektrodi, toimii täysin perinteisestä sähkökemiasta poiketen. Katodinen elektrodi kantaa jo pinnallaan ohuen eristekalvon patentin US 6645776 B (Kulmala ym) mukaisesti. Huokolevy 30 muodostetaan kyseisen katodin eristemembraanin päälle. Keksinnön mukainen EKL-elektrodi sisältää siten ainakin kaksi kalvoa, sähköä johtamattoman eristemembraanin (kalvon) ja sen päällä alle lOOpm paksuisen huokolevyn. Huokolevy on elektrolyyttisesti sähköä johtava toisin kuin em. eristemembraani. Huokolevy on siten selkeästi erillinen patentin US 6645776 B kuvaamasta elektrodimateriaalista.

9

Anodisissa ECL sovellutuksissa (US 4280815 A, Technicon; 5324457 A, Univ Texas Instruments; 6090545 A, Meso Scale Technologies) on aiemmin käytetty erilaisia huokoisia materiaaleja itse elektrodina tai elektrodien pinnoitteena. Viitattujen keksintöjen kohde ei ole kuitenkaan ollut tämän keksinnön mukainen huokolevy. Koska 5 katodinen EKL toimii erilaisilla sähkökemiallisilla periaatteilla (mm. viritysvyöhykkeen etäisyys elektrodista on erilainen), huokolevy itse ei toimi missään tilanteessa elektrodina, huokolevyn asettamisella elektrodin pinnalle saadaan aikaan uudenlaisia yllättäviä ominaisuuksia tunnettuun teknologiaan verrattuna, sen lisäksi että huokolevyn avulla voidaan nopeasti kerrostaa tasainen näyte katodin pinnalle.

10

Erityisesti keksinnössä kuvataan katodisessa EKL:ssa käytettävä Johde/Eriste/Huokolevy-laite (JEH). Siinä voidaan virittää hyvin monen tyyppisiä leimoja (erilaisia vaihtoehtoja esitetty kuvassa 8). JEH-laitteen periaate on esitetty kaaviokuvassa 1. Laite saatetaan toimintakuntoon lisäämällä näytettä tai puskuria 15 nestekontaktiksi huokolevylle, josta se leviää työelektrodille. Laitteen havaittiin toimivan erittäin nopeina immunomäärityspohjina. Yllättäen havaittiin myös, että pystyttiin virittämään leimoja, jotka sijaitsivat alle 100 μηη:3 huokolevyssä. Keksinnön mukaisesti voidaan valmistaa halpoja kertakäyttöisen työelektrodin sisältäviä JEH-laitteita, -sensoreita tai -koettimia. Tällöin jatkuvakäyttöinen työelektrodi voidaan 20 korvata kertakäyttöisellä työelektrodilla. Samalla päästään eroon työelektrodin puhdistus- ja tasapainotusoperaatiosta ja robotiikkaa vaativasta mikropartikkelien käsittelystä.

Tämä keksintö muodostaa huomattavan parannuksen hajautetun analytiikan 25 markkinoille tarkoitetuille laitteille ja menetelmille mahdollistaen halvat kvantitatiiset pikatestit. Tämä on saatu aikaaan käyttämällä EKL-mekanismin ja -mittaustavan kanssa erilaisia ohuita huokolevyjä.

Ennestään tunnettua on, että erilaisia huokoisia materiaaleja voidaan käyttää 30 nesteenkuljettamiseen ja suodattamiseen immunokromatografiaan perustuvissa määrityksissä (Hybritech Inc. Clinical Chemistry 31 (1985) 1427). Nämä eivät kuitenkaan ole kvantitatiivisia eivätkä käytä hyväkseen katodista EKL: a.

10

Mikrofluidistiikkasysteemeissä eli mikrolitraluokkaa käyttäviä tilavuuksia hyödyntävissä menetelmissä on usein ongelmana kuplanmuodostus, lämpödiffuusion haitalliset vaikutukset, laminaarivirtausten aiheuttamat ongelmat (eli nesteiden sekoittumattomuus virtausten aikana) sekä kapillaari-ilmiöiden aiheuttamat pintavoimat.

5 Tässä keksinnössä esitetään uudenlainen tapa käyttää JEH-laitteissa ohuita huokolevyjä suodatuksen ohella homogeenisina nestevirtausten tasaajina ja levittäjinä. Kvantitatiivinen detektointi perustuu kuumien elektronien indusoimaan EKLiiin sekä esim. kokoverinäytteiden näytteenotto- ja käsittelyprosessien yksinkertaistamiseen EKL-detektointimenetelmien ja laitteistojen avulla tehtävissä määrityksissä.

10 Huokolevyjä käyttämällä tällaisissa mikrofluidistiikkamenetelmissä em. haittatekijöiden vaikutus pystytään joko kokonaan poistamaan tai merkittävästi vähentämään.

Keksintö käsittää laitteiston, joilla voidaan virittää JEH-laitteiden sisältämien ohuiden huokolevyjen avulla työelektrodien pintaan levitettyjä leima-yhdisteitä niin, että niitä 15 voidaan käyttää immunoanalyysi- ja DNA-koetinmenetelmiin perustuvissa pikatesteissä.

Tähän tavoitteeseen päästään käyttämällä JEH-laitteissa ohuita alle 100 μιη paksuja huokolevyjä homogeenisina nestevirtausten tasoittajina sekä näytteen ja 20 mikiOläpivirtauskennojen tai mikrokenOskennojen nesteen levittäjinä EKLiiin perustuvissa detektointimenetelmissä bioaffiniteettimäärityksissä, joille on tunnusomaista patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkit täyttävä laite. Tämä keksintö koskee erityisesti menetelmiä ja laitteita, joilla katodinen EKLiiin perustuva analyysi voidaan käytännössä suorittaa. Keksinnölle erityisen tunnusomaista on lisäksi se, että katodinen 25 viritys tapahtuu hyvin lähellä elektrodia. Apuna käytettävä huokolevy voidaan liittää tiiviisti elektrodiin, mikä ei ole mahdollista muissa detektointimenetelmissä. Vaihtoehtoisesti huokolevy voidaan tuoda elektrodille bioaffiniteettireaktion käynnistämiseksi ja myöhemmin poistaa ennen EKLin mittausta tai mittaus voidaan tehdä suoraan huokolevyn läpi. Merkkiaine voi olla kiinnitetty elektrodiin liitetyyn 30 huokolevyyn tai työelektrodin pintaan. Huokolevyn ja työelektrodin välinen nesteliitos on optimaalisesti alle 100 μιη. Huokolevy voi olla kovalenttisesti tai adsorptiolla sidottu suoraan työelektrodin pintaan menetemillä, jotka ovat muista yhteyksistä tunnettuja (kaupallinen valmistaja esimerkiksi Schleicher & Schuell).

11

Keksintö muodostuu laitteesta, jonka keskeisin osa on työelektrodi. Kuumien elektronien indusoimassa EKL:ssä elektrodimateriaalina on ohuella eristekerroksella pinnoitettu johde, jonka materiaali voi olla AI tai Si patentin US 6251690 (Kulmala ym.) mukaisesti. Suosituimmasti se on tasainen pii joka on oksidoitu niin, että sen 5 pinnalla on 1-10 nm:n paksuinen eristekerros, suosituimmasti 3-4 nm:n paksuinen eristekerros. Piisubstraatti voi kuitenkin olla myös esimerkiksi uritettu tai muuten pintamorfologialtaan muunneltu nestevirtausten edistämiseksi. Piipalan koko voi olla erilainen riippuen käyttösovellutuksesta ja siitä onko siinä tarkoitus mitata yhtä tai useampaa analyyttiä samanaikaisesti. Tyypillisesti piipalan koko on 4x9 mm ja paksuus 10 alle 1 mm. Piipala on asennettu tukirakenteeseen, joka voi olla konstruoitu erilaiseen muotoon riippuen käytettävän mittalaitteen koko- ja materiaalivaatimuksista. Tyypillisesti tukirakenne on tehty muovista, joka on ympäristöystävällistä ja helppo hävittää. Tukirakenteen pinnalla olevalle piipalalle levitetään mikrohuokoinen kalvo tai huokolevy joko kosteana tai kuivana riippuen kalvon ominaisuuksista.

15

Keksinnössä käytettäville elektrodin pinnalle asetettaville huokolevyille on tunnusomaista se, että ne ovat mikrohuokoisia ja paksuudeltaan alle 100 μπι. Keksinnön mukaisia materiaaleja on saatavilla useista kaupallisista lähteistä, kuten Millipore, MSI, Sartorius, Pali, Sigma ja DuPont. Kalvot voivat olla joko isotrooppisia tai 20 anisotrooppisia. Kalvojen valmistustekniikat vaihtelevat ja voivat sisältää puristuksen tai venytyksen, huokoset voidaan saada niihin kemiallisilla tai fysikaallisilla keinoin, anisotrooppisten kalvojen kohdalla faasinsiirrolla. Voidaan myös käyttää partikkelien sintrausta tai huokolevy voidaan tehdä säteilyttämällä (nuclear membranes). Soveltuvista materiaaleista voidaan mainita PTFE, polyvinylideenifluoridi, 25 polykarbonaatti, polysulfoni, nadon ja selluloosaesterit. Näitä on saatavilla kaupallisesta lähteistä erilaisina huokoskokoina ja paksuuksina omaten erilaisia fysiko-kemiallisia ominaisuuksia. Kuitumaisista materiaaleista voidaan käyttää kuitusuodattimia, suodatinpaperia, suodatinkangasta jne.

30 JEH-laitteissa saavutetaan huokolevyillä bioaffiniteettimäärityksissä merkittäviä etuja. Huokolevyjen avulla näyte saadaan levittäymään tasaisesti koko vasta-aineella pinnoitetulle työelektrodille. Huokolevyt näyttävät toimivan yllättäen myös homogeenisina nestevirtausten tasaajina ja estävän mikrofluidistiikkasysteemeissä 12 kuplanmuodostuksen, lämpödiffuusion, pintavoimien ja laminaarivirtausten haittavaikutuksia sekä eliminoivat siten näistä aiheutuvia ongelmia esim, mikrofluidistisissa mikroläpivirtauskennoissa tai mikrokerroskennoissa.

5 Mikäli huokolevy on ohut, alle 100 μιη, EKL-perusteisessa bioaffiniteettimenetelmässä käytettävät reagoivat yhdisteet voidaan yllättäen saattaa myös elektrodin päälle asetelulle huokolevylle siten, että huokolevy on nestekosketuksella kiinni elektrodin pinnassa. Tällöin elektrodilta tulevat sähköpulssit virittävät alle 100 μιη etäisyydellä huokolevyllä olevia leimamolekyylejä.

10

Elektrodin pinta voidaan pinnoittaa tunnetuilla keinoin vasta-aineella tai DNA:lla ja niihin tarttuneet leimamolekyylit virittää sähköpulsseilla. Tällöin näytteen ja reagenssien levittämiseen käytetty huokolevy voidaan haluttaessa poistaa ennen mittausta.

15

Potilasnäyte (plasma, seerumi tai kokoveri, selkäydinneste, virtsa jne) voidaan myös ottaa huokolevylle, kuivata ja säilyttää sillä. Tämä on usein edullista esimerkiksi näytteiden kuljetuksen helpottamiseksi. Tällainen huokolevy voidaan asettaa JEH-laitteeseen ja mitata analyytin väkevyys.

20

Elektrodin tai elektrodia vasten asetettavan huokolevyn pinta voidaan tarvittaessa pinnoittaa vasta-aineilla tai antigeeneillä ennestään tunnetuilla menetelmillä, jotka sallivat suuren aktiivisten antigeenien tai vasta-aineiden tiheyden pinnalla. Keksinnön mukaisesti voidaan elektrodit tai huokolevyn elektrodia vasten tuleva pinta pinnoittaa 25 keksinnön esimerkeissä kuvatuilla tavoilla Langmuir-Blodgett kalvoilla.

JEH-laiteet on edullista tuotannollisista syistä säilyttää kuivina. Tällöin laiteet saatetaan toimintakuntoon lisäämällä huokolevyn pinnalle nestemäistä näytettä tai puskuriliuosta niin, että huokolevyn ja elektrodin väliin saadaan boaffiniteettireaktioille soveltuvat 30 olosuhteet.

Keksinnössä kuvattu JEH-laite, jolla voidaan mitata analyyttiväkevyyksiä voi sisältää tukirakenteen, huokolevyn ja elektrodin lisäksi myös erilaisia työtä helpottavia osia ja 13 suojuksia. Jos halutaan mitata kokoverinäytteistä analyyttejä verisolujen poisto voidaan tehdä myös erityisiä huokolevyjä käyttäen, kuten on esitetty tätä keksintöä kuvaavissa esimerkeissä. Keksinnön mukainen laite sisältää myös sähköisen kontaktin työelektrodista virittävään ja luminesenssia mittaavaan laitteistoon. Keksinnön laitteelle 5 on tyypillistä, että sitä voidaan valmistaa suuria määriä automatisoiduilla tuotantolinjoilla. Tuotantomenetelmät ovat laitteen eri komponenttien kohdalla ennestään tunnettuja.

Koska keksinnössä työelektrodina käytetään tasaisia päällystettyjä pintoja, elektrodien 10 pinnoitus eli keksinnön mukaisen laitteen olennaisin laatukontrolli voidaan perustaa tällä tavoin suoraan pinnan äärimmäisen tarkkaan tutkimiseen tunnelointi- ja/tai atomivoimamikroskopialla. Tämä voidaan tehdä aktiivisten vasta-aineitten suoralla havainnollistamisella, mikä on muun tyyppisissä diagnostisissa menetelmissä käytännössä mahdotonta ja on siten laadunvalvonnan mahdollisuus on tämän keksinnön 15 eräs keskeisistä vahvuuksista ja tällä tavoin diagnostisten menetelmien keskeisin laatukriteeri tulee täytettyä. Yleisesti käytetty polystyreenin pinnoitus vasta-aineilla ei suo mahdollisuutta tällaiseen kontrolliin, koska polystyreenin pinta on puristevalun jälkeen liian epätasainen molekyylien tunnistamiseksi materiaalin pinnalla.

20 Tässä keksinnössä esitetyillä menetelmillä ja laitteistoilla voidaan huomattavasti yksinkertaistaa kvantitatiivista pikamäärityksiä ja määrityksiä edeltäviä toimenpiteitä kuten esim. kokoverinäytteiden vaatimaa esikäsittelyä. Mm. kokoverinäytteen hyytymisen estävä hepariinikäsittely on tarpeeton keksintöön perustuvassa menetelmässä ja laitteessa. Käyttämällä näytteen levittämiseen tarkoitettua huokolevyä 25 samalla myös kokoverinäytteiden solujen suodattamiseen ja poistamalla huokolevy immunomäärityksen reagointivaiheen jälkeen ennen EKL-mittausvaihetta vasta-aineella/- aineilla pinnoitetun työeletrodin päältä, muodostuu näytteen hyytyessä pintaan suojaava kalvo, joka estää haihtumisen immunoreaktiopinnalta ja osaltaan myös nopeuttaa immunoreaktiota. Luonnollisesti laitteella ja menetelmällä voidaan mitata 30 myös esim. hepariinilla käsiteltyjä kokoverinäytteitä,

Vasta-aineilla voi olla pinnoitettu joko työelektrodi (katodisessa EKL:ssa AI, Si, jne.) tai ko. työelektrodien päällä oleva ohut huokolevy. Jos huokolevy on pinnoitettu vasta-aineella tehdään mittaus huokolevyä poistamatta, mutta mikäli työelektrodi on 14 pinnoitettu analyyttejä tunnistavalla biomolekyylillä (vasta-aine tai DNA-koetin) voidaan huokolevy myös poistaa ennen EKL-mittausvaihetta. EKL-mittaukset perustuvat kuumien elektronien indusoimaan elektrokemiluminesenssiin (US 6251690).

5 Keksinnön mukaisille JEH-laitteille on olemassa useita vaihtoehtoisia ratkaisuja riippuen siitä millaiseen käyttöympäristöön ne on tarkoitettu. Eräässä tyypillisessä keksinnön mukaisessa pikatestiratkaisussa on erillinen testiliuska, johon analyysinäyte (kokoveri, seerumi tai plasma) laitetaan. Näyte levittyy vasta-aineella pinnoitetun testiliuskaan kiinnitetyn työelektrodin pinnalle huokolevyn avulla ja liuottaa samalla 10 huokolevyyn kuivatun leiman. Huokolevy voi olla kiinnitetty esimerkiksi teipillä liukuvaan kansiosaan, joka on analyysinäytteen pipetointivaiheessa ja inkuboinnin aikana työelektrodin päällä ja liukuu pesu- ja mittausvaiheessa pois. Teippiin on tehty työelektrodin kokoinen aukko niin, että huokolevy liimautuu teipillä kansiosaan vain reunoistaan. Näytteen näytetilaan saattamisen jälkeen huokolevyyn kuivattu leimattu 15 vasta-aine liukenee ja immunoreaktio alkaa tapahtua vasta-aineella pinnoitetun työelektrodin pinnassa. Huokolevy toimii systeemissä liuoksen tasaisena levittäjänä. Se myös estää ilmakuplien haittavaikutukset ja eliminoi myös muita jo edellä lueteltuja mikrofluidististen systeemien ongelmia. Välittömästi näytepipetoinnin jälkeen testiliuska työnnetään mittauslaitteeseen, jossa tapahtuu immunomäärityksen 20 inkubointivaihe sekoituksella tai ilman. Sekoitus saadaan helposti aikaan laitteen mittauskennon runkoon kiinnitetyllä värinäsähkömoottorilla . Kun reaktio on edennyt halutulle asteelle testiliuska työnnetään mittauskennoon ja samalla työelektrodin päällä ollut huokolevy liuutetaan ylös, jolloin työelektrodi paljastuu mahdollista pesua ja mittausta varten. Mittauskennossa on EKL-systeemissä tarvittava vastaelektrodi 25 kiinteästi asennettuna. Mittauskennon tilavuus voi olla 50-500 μΐ. Mittauskennossa tapahtuu heterogeenisen immunomäärityksessä ensin pesu ja sitten varsinainen EKL-mittaus tai homogeenisessa määrityksessä pelkkä EKL-mittaus. Pesu- ja mittausliuoksen koostumus voivat olla myös samat. Pesu voidaan tehdä täyttämällä mittauskenno ja imemällä se tyhjäksi. Liuosten siirtäminen voi olla mittalaitteessa 30 toteutettu pumpun avulla. Mittausten jälkeen kenno huuhdellaan, jota varten laitteessa on venttiili, jolla voidaan valita virtaako kennoon joko pesu/mittauspuskuria tai tislattua vettä. Vielä rakenteellisesti yksinkertaistetummassa kannettavassa pikatestilaitteessa 15 tarvittavat liuossäiliöt voivat olla konstruoituina testiliuskaan, niin ettei varsinaisessa laitteessa tarvita lainkaan nestesäiliöitä ja huuhtelupumppua.

EKL-immunomääritysmittaukset, joissa huokolevy (esim. nitroselluloosa) on 5 pinnoitettu vasta-aineella, voidaan tehdä myös JEH-laitteella, jossa on edellä kuvatusta hieman erilainen mittauskenno- ja testiliuskaratkaisu. Koska tämänkaltaisessa mittaussysteemissä nimenomaan huokolevyssä tehdään koko immunomääritys, testiliuska konstruoidaan omaamaan avonainen kansi huokolevyn pesujärjestelyjen vuoksi sekä kooltaan suurempi mittauskenno, johon testiliuska huokolevykansineen 10 mahtuu.

Monimutkaisemmassa laboratoriolaitteessa edellä esitetyn kaltaista rakennetta on myös mahdollista soveltaa. Tällöin työelektrodi voi olla asennettuna mikroläpivirtauskennon tapaiseen kennoon, jolloin anodina voidaan käyttää jotakin läpinäkyvää toiselta puolelta 15 johtavaksi pinnoitettua materiaalia esim. ZnO-lasi tai ITO-kalvo tai rakenne voi olla verkkomainen, esim. teräsverkko, tai pelkkä ohut teräslanka. Huokolevy on asetettu elektrodien väliin, joko irrallisena tai kiinteästi kiinnitettynä. Koska huokolevy ja sen päällä tiiviisti oleva vastaelektrodi ylittävät pituudeltaan työelektrodin, saadaan läpivirtauskenno aikaan yhdistämällä rei-itettyyn vastaelektrodiin virtausletkut tai 20 mikrolitraluokkaa olevat pipetointisäiliöt. Vaihtoehtoisesti koko JEH-laite tai -sensori voi olla valettu liuosvirtaukselle kanavoidun muovin sisään, jossa on liitoskohdat ulkopuolisille näyte- ja pesuliuosinjektoinneille. Laite voi myös olla konstruoitu niin, että katodina toimivan työelektrodin molemmilla puolilla samassa tasossa on anodina toimivat vastaelektrodit. Tällöinkin elektrolyytti suosituimmasti levitetään 25 mittausvaiheessa elektrodien väliin huokolevyn avulla. Kuin myös itse näyte-, leima- ja pesuliuos (jos on kyseessä heterogeeninen määritys). Menetelmällä ja laitteella pystytään myös suorittamaan homogeenisia määrityksiä, jolloin pesut ovat tarpeettomia. Tämä perustuu siihen, että EKL virittää ainoastaan elektrodin pintaan bioaffiniteettireaktiolla konsentroituneet leimat (ns. proximity effect).

Leimareagenssit voivat olla kuivattu huokolevyyn. Huokolevymateriaalina voidaan käyttää ohutta paksuudeltaan alle 100 μιη olevaa jotakin huokoista materiaalia esim. polykarbonaattia (pystysuuntaisia huokoisia reikiä esim. Whatman Cyclopore tai 30 16

Nuclepore Membranes) tai nitroselluloosaa (huokoisia reikiä sekä pysty- että pitkittäissuunnassa esim. Schleicher & Schuell). Työelektrodien pinnoituksen laadunvalvontaan on edullista käyttää atomivoimamikroskopiaa (AFM). Työelektrodeja voidaan pinnoittaa vasta-aineella fysikaaliseen adsorptioon tai kovalenttiseen 5 sitoutumiseen perustuen ja myös vasta-ainepintojen järjestäytymisastetta kasvattavilla Langmuir-Blodget (LB) -kalvo ja Langmuir-Shaefer menetelmillä.

Seuraavassa keksintöä havainnollistetaan edelleen kaaviokuvin sekä ei-rajoittavin esimerkein ja niihin liittyvin kuvin.

10 ESIMERKKI 1. Eristepintaisten elektrodien valmistaminen Si-kiekoista termisesti oksidoimalla, sahaamalla ja vasta-aineella pinnoittamalla.

15

Si-kiekkojen oksidointi. Kiekot (Si-levyt: resistiivisyys 0,01-0,023 Ωαη p++ seostettu boorilla, orientaatio <100>, paksuus 525+/-25 μπι, valmistaja Okmetic Oyj) pestiin teollisuudessa yleisesti käytössä olevalla RCA-pesumentelmällä ja ladattiin 700-asteiseen uuniin, jossa on noin 95% typpeä ja 5% happea sisältävä ilmakehä. Lämpötila 20 nostettiin 850 asteeseen ja hapen osapainetta kasvatettiin: 90% typpeä, 10% happea sekä odotettiin halutun oksidointiajan verran. Kiekkoja huuhdeltiin puhtaalla typpivirtauksella 30 minuuttia. Lämpötila laskettiin takaisin 700 asteeseen puhtaassa typessä ja poistettiin kiekot uunista.

25 Eri oksidointiaj oilla saatiin seuraavia tuloksia:

Oksidointiaika (min) Paksuus (nm) 0 (*) 2.666 15 3.418 30 3.936 30 40 4.171 60 4.852 80 5.535 120 6.393 17 200 8.070 400 11.442

Paksuus mitataan ellipsometrillä mittaamalla lasersäteen polarisaation muutosta. 5 Menetelmässä ohuilla kalvoilla taitekerroin on pakko asettaa kiinteäksi ja oksidille on käytetty tyypillistä arvoa 1,465. Si-kiekon kiilloittamattomalle puolelle kiinnitettiin pintasuojakalvo. Sahattava kiekko kiinnitettiin sahaustelineeseen ja sahattiin tietokoneohjatulla ohutteräisellä timanttikiekkoleikurilla halutun kokoisiksi Si-anturiaihioiksi.

10

Vasta-aineella pinnoitus voidaan tehdä esimerkiksi niin, että paloiksi sahattu mutta suojakalvossa vielä kiinni oleva Si-kiekko laitetaan pinnoitettava puoli alaspäin kellumaan pinnoitusliuoksen päälle muoviastiaan (pinnoitusliuos: 50 mM Trizma base, 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, pH 7,8 HCklla, jossa 7,0 ug/ml vasta-ainetta anti-CRP; Medix 15 Biochemica Oy Ab anti-hCRP clone 6405, 1,0 mg/ml)). Kouttauksessa tilavuus oli 50 ml / kiekko eli 4,5 ug vasta-ainetta / cm2. Pinnoituksen annettiin tapahtua yli yön kosteassa tilassa, minkä jälkeen levy siirrettiin uuteen saturointiliuosta (50 mM Trizma base, 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,1 % BSA, 6% D-sorbital, 1 mM CaCl2*H20, pH 7,8 HClilla) sisältävään astiaan ja annettiin saturoinnin tapahtua yön yli. Varastointia varten 20 paloiksi sahatut ja pinnoitetut valmiit Si-antureita sisältävät levyt kuivattiin 30°C:ssa 2,5 h ja laitettiin tämän jälkeen jääkaappiin ilmatiiviisti kuivausaineen kanssa. Testiliuskoja koottaessa Si-palat otetaan varastointisäilytyksestä, irroitetaan suojakalvosta ja kiinnitetään testiliuskaan (kuva 2). Kuvassa 9 on esitetty vasta-aineella pinnoitettujen JEH-laitteiden säilyvyys varastoinnissa. Oksidikerroksen paksuuden 25 vaikutus EKL-signaaliin on esitettu kuvassa 10 ja kuvassa 11 vielä keksinnön mukaisella testiliuskalla ja mittauskennolla yhden leimana käytetyn molekyylin, terbium-2,6-bis[N,N-bis(karboksimetyyli)aminometyyli]-4-bentsoyylifenoli -kelaatti, vapaana liuosfaasissa mitattu konsentraatioriippuvuus. Kuvassa 12 on erilaisten käyttökelpoisten leimaluminoforien spektrit, joista näkyy että laitteella ja menetelmällä 30 on käytettävissä koko laaja spektrialue (UV-VIS-NIR).

ESIMERKKI 2. CRP-immunomääritys heterogeenisesti standardinäyteliuoksilla kuvien 1 ja 2 mukaisilla testiliuskalla ja mittauskennolla käyttäen detektointitapana kuumien elektronien indusoimaa EKL:a.

18 CRP-immunomääritys tehtiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla valmistetuilla Si-antureilla, jotka oli kiinnitetty kuvissa 1 ja 2 esitettyjen laitteiden liukuvan huokolevyosan sisältävään testiliuskaan ja mitattu keksinnössä kuvatulla laitteistolla ja menetelmällä kuvassa 3A esitetyssä luminesenssimittalaitteen mittauskennossa. 5 Immunomääritys perustui huokolevyjen käyttöön yhdistettynä EKL-detektointiin. Vaihtoehtoisesti hieman modifioimalla testiliuskaa voitiin mittaus suorittaa kuvassa 3B esitetyssä kertakäyttöisessä mittakennossa.

Huokolevy, jossa kuivattu leima, kiinnitettynä testiliuskan liukuvan kansiosaan.

10 Ulkomitoiltaan 7,00 x 12,0 mm polykarbonaattihuokolevy (paksuus 6-11 um, lxlO5 -6xl08 reikää/cm2, halkaisijaltaan 1,0 um olevia reikiä, Nuclepore Membrane 112110, Whatman) kiinnitettiin samankokoiseen teippiraamiin (3M 465, kaksipuolinen selkäaineeton akryyliteippi), johon oli tehty SI-anturin kokoinen 4,00 x 9,00 mm aukko. Leiman kuivaus huokolevyyn. Leimattua vasta-ainetta (Medix Biochemica Oy Ab anti-15 hCRP clone 6404, 2,22 mg/ml) sisältävää liuosta (50 mM Trizma base, 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,5 % BSA, 0,05% bovine-gammaglobulin, 0,01% Tween 20, 1 mM CaCl2*H20, pH 7,7 HCklla, jossa Tb- 2,6-bis[N,N-bis(karboksimetyyli)aminometyyli]- 4-bentsoyylifenoli -kelaatilla leimattua vasta-ainetta 0,074 mg/ml) pipetoitiin 0,5 ui ja kuivattiin se noin 2 mm halkaisijaltaan olevana pisarana keskelle huokolevyä (12,0 x 20 7,00 mm). Kuivumisen annettiin tapahtua huoneenlämmössä huoneilmassa yön yli.

Immunomäärityksessä tarvittavat standardinäytteet (CRP-pitoisuus 0,3 , 1,0,3,0 , 10,0 , 30,0 , 100,0 , 300,0 , 1000,0 , 3000,0 ng/ml) valmistettiin koeputkessa laimentamalla CRP:n standardiliuosta (Scripps, cat.no.C0124, 2,37 mg/ml CRP) laimennosliuoksella 25 (50 mM Trizma base, 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,5 % BSA, 1 mM CaCl2*H20, pH 7,7 säädetty HCklla) Laimennettua näytettä pipetoitiin vaakatasossa 3,5 μΐ testiliuskan kannen päälle huokolevyyn (kuva 1), josta näyte liuotti kuivatun leiman. Liuska siirrettiin mittauslaitteeseen pystyasentoon ja näytteen annettiin inkuboitua huokolevyn alla olevan koutatun Si:n kanssa 5 min sekoittaen sitä samalla mittauskennon 30 kansiosassa olevan värinäsähkömoottorin avulla. Inkuboinnin jälkeen huokolevy raameineen liukui pois Si:n päältä testiliuskan työntyessä pesumittauskennoon. Kenno pumpattiin 4 kertaa täyteen ja 3 kertaa tyhjäksi yhdistetyllä pesumittausliuoksella (50 mM Na2B4C>7, 0,1 % NaN3, 0,003% Tween 20, pH 7,9 säädetty H2S04:lla). Viimeisen 19 täytön jälkeen mitattiin EKL (f = 10 Hz, Q = 20 uAs, pulssiaika 250 us, 60 pulssia, U = 25 V) keksinnössä esitetyllä laitteella, joka oli varustettu patentissa US 6251690 kuvatulla elektroniikalla. Mittauksen jälkeen kenno pumpattiin tyhjäksi ja Si-liuska nostettiin pois. Kenno pestiin 3 kertaa tyhjennystäytöillä ennen seuraavaa Si-liuskaa. 5 Viimeisin täyttö tapahtui tislatulla vedellä. Mittauskennon pesujäijestely on esitetty kuvassa 4. CRP-immunomäärityksen standardikuvaaja on esitetty kuvassa 13.

ESIMERKKI 3. Kelaatin mittaus mittauskennossa, jossa anodi muodostaa altaan piielektrodin ympärille. Kuvan 5A mukaisessa koejärjestelyssä piielektrodi kiinnitettiin 10 teipin avulla altaan pohjalle ja peitettiin reunoja myöten UV-kovetteisella liimalla (Loctite 322 tai EPO-TEK OG 142). Kovettamisen jälkeen teippi poistettiin. Kenno täytettiin esimerkissä 2 mainitulla pesumittausliuoksella, jossa esimerkissä 2 mainitun Tb-kelaattiliuoksen väkevyys oli 10"3 mol/1. EKL mitattiin (f = 20 Hz, I = 316 mM, pulssiaika 500 ps, U = 67 V ja valokuvattiin digitaalikameralla. Kuvaa varten pulsseja 15 kerättiin 10 kpl. Kuten kuvasta 5B voidaan havaita, tulee laitteesta luminesenssi koko elektrodin alueelta.

ESIMERKKI 4. Esimerkissä 3 kuvattu elektrodirakenne voidaan helposti istuttaa muoviseen rakenteeseen, jolloin saadaan yksinkertaisesti kytkettyä sähköinen kontakti 20 molempiin elektrodeihin. Testiliuska on esitetty kuvissa 6A ja 6B. Samalla periaatteella voidaan rakentaa myös esimerkin 2 mukainen testiliuska, joka on esitetty kuvassa 7. Vastaavasti yksityisiä elektrodiyksiköitä lisäämällä testiliuskaan voidaan rakentaa testiliuska, jolla voidaan tehdä monta määritystä samanaikaisesti. Osa määrityksistä voi toimia negatiivisena ja positiivisena kontrollina. Tällainen testiliuska on esitetty kuvassa 25 8.

ESIMERKKI 5. CRP-immunomääritys heterogeenisesti seeruminäytteillä.

Tunnetut seeruminäytteet (määritetty immunoturbidimetrisesti luokitellussa 30 laboratoriossa), joiden CRP-pitoisuudet olivat 133000 , 37000 , 13000 , 7000 , 234 ng/ml, mitattiin laimentamalla EKL-immunomäärityksen avulla. Näytteet laimennettiin tuhatkertaisesti laimennosliuoksella (50 mM Trizma base, 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,5 % BSA, 1 mM CaCl2*H20, pH 7,7 säädetty HCl:lla) ja mitattiin kuten esimerkissä 2 on esitetty. Tuloksena saatu serumnäytekuvaaja on esitetty kuvassa 14.

20 ESIMERKKI 6. CRP-immunomääritys homogeenisesti standardinäyteliuoksilla.

Laitteella ja katodiseen EKL-detektointiin perustuen tehtiin CRP:n homogeeninen immunomääritys standardiliuoksia näytteinä käyttäen samalla tavalla kuin esimerkissä 5 2 paitsi, että inkuboinnin jälkeen testiliuskan työnnyttyä mittauskennoon ei tehty pesua lainkaan, vaan mittakenno ainoastaan täytettiin pumpun avulla mittausliuoksella ja suoritettiin välittömästi mittaus. Homogeenisen immunomäärityksen tulokset on esitetty kuvassa 15.

10 ESIMERKKI 7. TSH-immunomääritys heterogeenisesti näytestandardeilla.

Heterogeeninen hTSH-immunomääritys tehtiin käytännön suoritukseltaan samalla tavalla kuin esimerkissä 2 esitetyn CRP:kin kanssa. Testiliuskaan kiinnitetyt Si-anturit oli valmistettu samoin kuin on esitetty esimerkissä 1. Si-antureiden vasta-15 ainepinnoitusliuoksen koostumus oli 0,1 M MES, 0,03 M H3BO3, 0,5 mM K-sitraatti, 0,025%glutaraldehydi, 0,05% bovine-gamma-globulin, jossa 6,87 mg/ml vasta-ainetta (MIT0406 MOAB anti hTSH Medix Biotech Inc. USA) ja saturointiliuoksen 50 mM Trizma base, 0,1% BSA, 0,1 % NaN3, 0,1% Tween 20, pH 7,5 säädetty H2S04:lla. Samoin leimavasta-aine (Monoclonal anti-hTSH, clone 5404, 5,5 mg/ml, Medix 20 Biochemica Oy Ab), joka oli leimattu Tb- 2,6-bis[N,N-bis(karboksimetyyli)aminometyyli]-4-bentsoyylifenoli -kelaatilla oli kuivattu testiliuskan huokolevyosaan kuten edellä on esitetty.

Immunomäärityksessä tarvittavat standardinäytteet (TSH-pitoisuus 0,1 , 1,0,3,0 , 10,0 , 25 30,0 , 100,0 mIU/1) oli valmistettu koeputkissa laimentamalla TSH:n standardiliuoksesta (Wallac, DELFIA hTSH kit, 324 mIU/ml TSH,) laimennosliuoksella (50 mM Trizma base, 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,5 % BSA, 1 mM CaCl2*H20, pH 7,7 säädetty HCklla). Pesut ja mittaus suoritettiin kuten esimerkissä 2 on kuvattu paitsi, että inkubointiaika oli 15 minuuttia koko ajan sekoittaen. 30 Standardikuvaaja heterogeenisestä hTSH-immunomäärityksestä on esitetty kuvassa 16.

ESIMERKKI 8. TSH-immunomääritys heterogeenisesti seeruminäytteellä.

21

Heterogeeninen hTSH-immunomääritys tehtiin käytännön suoritukseltaan samalla tavalla kuin CRP-määritys esimerkissä 2. Testiliuskaan kiinnitetyt Si-anturit oli valmistettu samoin kuin on esitetty esimerkissä 1. Si-antureiden vasta-ainepinnoitusliuoksen koostumus oli 0,1 M MES, 0,03 M H3BO3, 0,5 mM K-sitraatti, 5 0,025% glutaraldehydi, 0,05% bovine-gamma-globulin, jossa 6,87 mg/ml vasta-ainetta (anti hTSH Medix Biotech Inc. USA) ja saturointiliuoksen 50 mM Trizma base, 0,1% BSA, 0,1 % NaN3, 0,1% Tween 20, pH 7,5 säädetty HiSCLdla. Samoin leimavasta-aine (anti-hTSH, Medix Biochemica Oy Ab), joka oli leimattu Tb- 2,6-bis[N,N-bis(karboksimetyyli)aminometyyli]-4-bentsoyylifenoli -kelaatilla oli kuivattu 10 testiliuskan huokolevyosaan kuten edellä on esitetty.

Immunomäärityksessä tarvittavat seerumistandardit (TSH-pitoisuus 1,0 , 3,0 , 10,0 , 30,0 , 100,0 mIU/1) valmistettiin laimentamalla seerumilla TSH:n standardiliuosta (Scripps Laboratories, Inc., San Diego, USA) Seerumin TSH-pitoisuus oli 0.45 mU/L. 15 Pesut ja mittaus suoritettiin kuten esimerkissä 2 on kuvattu paitsi, että inkubointiaika oli 15 minuuttia koko ajan sekoittaen. Standardikuvaaja hTSH-immunomäärityksestä on esitetty kuvassa 17.

ESIMERKKI 9. TSH-immunomääritys heterogeenisesti koko verinäytteellä.

20

Heterogeeninen hTSH-immunomääritys tehtiin käytännön suoritukseltaan samalla tavalla kuin esimerkissä 7. Immunomäärityksessä tarvittavat kokoveristandardit (TSH-pitoisuus 1,0 , 3,0 , 10,0 , 30,0 mIU/1) valmistettiin laimentamalla hepariinisoidulla kokoverellä TSH:n standardiliuosta (Scripps Laboratories, Inc., San Diego, USA ) 25 Kokoveren TSH-pitoisuus oli 0.5 mU/L. Pesut ja mittaus suoritettiin kuten esimerkissä 5.. Standardikuvaaja kokoveren hTSH-immunomäärityksestä on esitetty kuvassa 18.

ESIMERKKI 10. CRP-immunomääritys vasta-aineella pinnoitetulla nitroselluloosa-huokolevyllä Si-katodeita käyttämällä.

30

Nitroselluloosahuokolevy (7x4mm, Schleicher & Schuell, 12 pm) pinnoitettiin anti-CRP-vasta-aineella (10 pg/ml) inkuboimalla puskuriliuoksessa (50 mM Tris-HCl, pH

7,8, 0,05% NaN3, 0.9% NaCl) huoneen lämpötilassa yli yön. Tämän jälkeen nitroselluloosahuokolevy pestiin kyllästysliuoksella (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 0,05% 22

NaN3, 0.9% NaCl, 0,1% BSA, 6% D-sorbitol, 1 mM CaCl2) ja lopuksi huokolevyä seisotettiin tässä kyllästysliuoksessa yli yön huoneen lämpötilassa. Kyllästämisen jälkeen huokolevy kuivattiin suodatinpaperin päällä.

5 Vasta-aineella pinnoitettu nitoselluloosahuokolevy asetettiin laitteeseen vaihdettuun läpivirtauskennoon (kuva 19) ja päälle lisättiin 50 pl CRP- standardia. Inkuboinnin jälkeen (5 min) huokolevy pestiin kennossa 1 ml:lla pesu- ja mittausliuosta (50 mM boraattipuskuri, pH 7.9, 0,1% NaN3, 0,003 % Tween 20) ja päälle lisättiin Tb-kelaatilla leimattu vasta-aine 50 μΐ. Inkuboinnin jälkeen (5 min) huokolevy pestiin 1 mklla pesu-10 ja mittausliuosta. Pesun jälkeen EKL mitattiin 500 piissä pesu- ja mittausliuista (f = 5 Hz, Q = 20 μΑ8, pulssiaika 250 ps, 500 pulssia, U=34,8 V). Tyypillinen standardikuvaaja on esitetty kuvassa 20.

ESIMERKKI 11. Elektrodin pinnoitus Langmuir-Blodget (LB) -kalvoilla ja pintojen 15 molekulaarinen tarkastelu.

Koe suoritettiin tavallisella Langmuir-altaalla. Pintapaine mitattiin 0,2 mN/m tarkkuudella Wilhelmi-levyllä. Proteiinifilmien valmistus tapahtui kirjallisuusviiteiden Nagagawa T. (1991) Thin Solid Films, 202, 151 ja Owaku, K., (1989) Thin Solid Films 20 180, 61 mukaisesti. Valmistetut proteiinifilmit siirrettiin elektrodilevyille Langmuir-

Shaefer menetelmällä. Pinnoituksessa käytettävä proteiini oli monoklonaalinen hiiren vasta-aine hepatiitti B viruksen pinta-antigeenille. LB-filmit muodostettiin vesi-ilma rajapinnalle käyttäen Tris-HCl puskuria (lOmM, pH 8.2) ja alkyloitua polyetyleeni-iminiä (Aldrich, Saksa).

25

Atomivoima/tunnelointi kuvat LB-pinnoitetuista pinnoista saatiin käyttäen laitetta Nanoscope II FM (Digital Instruments). Laite toimi joko vakiovirtatoiminnalla (tunnelointi) tai vakiopoikkeutus (atomivoima). Kuvat, jotka olivat stabiileja vähintään 30 minuuttia rekisteröitiin käyttäen suodatusta ja 2D Fourier muunnosta. Piilevyllä 30 havaittiin pyöreitä kuvioita 25x15 nm suuruudeltaan jotka identifioitiin vasta-aineksi. Pintatiheydeksi arvioitiin 1x10 molekyyliä /m" . Vertailutulokset kuvissa 21 ja 22.

Claims (12)

1. Analytiikassa käytettävä elektroluminesenssia hyväksi käyttävä laite, jossa työelektrodin materiaalina on eristepintainen (102) johde (101) tai 5 eristepintainen vahvasti seostettu degeneroitu puolijohde, laitteen työelektrodi on tuettu rakenteisiin, jota kautta työelektrodi voidaan yhdistää sähköisesti luminesenssimittalaitteen virityselektroniikkaan, työelektrodi toimii laitteen katodina, tunnettu siitä, että työelektrodin pinnalla on tai sen pinnalle on tuotavissa huokolevy (103), jolla analysoitava 10 näyte ja muut huokolevylle ja/tai työelektrodille tuotavat reagenssit voivat reagoida keskenään ja jonka huokolevyn paksuus on alle 100 pm.

2. Vaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että katodinen työelektrodi on valmistettu piistä tai alumiinista ja sen pinnalla on oksidieriste. 15

3. Vaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että huokolevyn paksuus on 1-20 pm.

4. Vaatimusten 1-3 mukainen laite, tunnettu siitä, että joko työelektrodin pinta 20 tai huokolevy, tai niiden yhdistelmä on pinnoitettu analyyttia sitovilla bioaffiniteettimolekyyleillä.

5. Vaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että ainakin osa huokolevyllä reagoivista molekyyleistä on kuivattu huokolevylle etukäteen. 25

6. Vaatimusten 1-5 mukainen laite, tunnettu siitä, että ainakin laitteen työelektrodi on sisällytetty testiliuskan rakenteeseen, työelektrodi on pinnoitettu bioadsorbentilla, elektrodin päälle on saatettu huokolevy, joka sisältää leimatun biomolekyylin. 30

7. Minkä tahansa vaatimusten 1-6 mukainen laite, tunnettu siitä, että katodisen työelektrodin pinnalla on mekaanisesti liikuteltavissa oleva huokolevy.

8. Vaatimuksen 7 mukainen laite, tunnettu siitä, että huokolevyä liikuttava primaarinen voima on saatu kimmoisasta materiaalista.

9. Analytiikassa käytettävä, elektroluminesenssia hyväksi käyttävä menetelmä, 5 jossa menetelmässä käytetään laitetta, jossa työelektrodin materiaalina on eristepintainen (102) johde (101) tai eristepintainen vahvasti seostettu degeneroitu puolijohde, laitteen työelektrodi on tuettu rakenteisiin, jota kautta työelektrodi voidaan yhdistää sähköisesti luminesenssimittalaitteen virityselektroniikkaan, 10. työelektrodi toimii laitteen katodina, jolloin työelektrodin pinnalla on tai sen pinnalle tuodaan huokolevy (103), jonka paksuus on alle 100 pm, jolle menetelmälle on ominaista, että huokolevylle tuodaan analysoitava näyte, näytteen ja muiden huokolevylle ja/tai katodille tuotujen tarvittavien reagenssien 15 annetaan reagoida keskenään, työelektrodille annettujen sähköisten virityspulssien jälkeen analysoitavasta näytteestä saadaan luminesenssisignaali, joka on verrannollinen analyytin määrään.

10. Vaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että työelektrodin pinnalla olevan huokolevyn paksuus on suosituimmasti 1-20 pm ja huokolevyn ja elektrodin väliin aikaansaadaan bioaffiniteettireaktion ja elektroluminesenssimittauksen ajaksi nesteliitos.

11. Vaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että huokolevy poistetaan luminesenssimittauksen suorittamiseksi.

12. Vaatimusten 9-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ainakin laitteen työelektrodi on sisällytetty testiliuskan rakenteeseen, 30. työelektrodi on pinnoitettu bioadsorbentilla, elektrodin päälle on saatettu huokolevy, joka sisältää leimatun biomolekyylin, huokolevyn päälle tuodaan nestemäistä näytettä ja /tai puskuriliuosta bioaffiniteettireaktion aloittamiseksi, bioaffiniteettireaktion annetaan tapahtua, bioaffiniteettireaktio lopetetaan huokolevy poistetaan työelektrodilta, ja suoritetaan mittaus luminesenssimittalaitteella.