CN116984040A - 一种干式双极电化学发光微流控芯片及其在蛋白与核酸检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干式双极电化学发光微流控芯片及其在蛋白与核酸检测中的应用，所述的芯片包括依次层叠的底板、电极片、检测片、结合片和加样片；所述电极片的一体化双性电极呈“一”字形，具有一个以上的双性电极阳极和一个双性电极阴极；多个双性电极阳极为串联关系；所述报告通道数量与双性电极阳极数量一致；所述加样片上的缓冲液通道和待测样品通道与结合片上的通道位置对应；所述加样片上的待测样品通道为一个或多个。本发明提出的双极电化学发光微流控芯片，不仅可以用于同一样本中多个生物标志物的同时检测，也可以用于不同样本中单一或多个生物标志物的同时检测，满足不同场景下不同的应用需求。
Description
技术领域
本发明属于微流控芯片领域，具体涉及一种干式双极电化学发光微流控芯片及其在蛋白与核酸检测中的应用。
背景技术
微流控技术旨在将进样、样品处理、检测等集成在一张微小芯片上完成。与传统检测方法和检测仪器相比，微流控芯片具有流体可控性、样品和试剂消耗低、分析速度快等特点。近年来，双性电极结合电化学发光技术已经取得了多样化的发展，从单一检测到高通量检测、多元检测等，在微流控芯片上双性电极常常被设计为不同的形状及尺寸以实现不同的检测需求。电化学发光技术用于免疫检测或核酸检测，通常在抗体(或抗原)、核酸上标记电化学发光探针，在电触发下引发特异性的电化学发光反应，从而实现蛋白质、核酸生物标志物的快速、敏感、特异性检测。双极电化学发光微流控芯片有潜力为体外诊断、即时检测等领域提供快速分析工具。
使用单一检测平台同时识别同一样品中的两类分析物，不仅可以带来经济效益，而且对疾病诊断、术后评价、药物发现、精准医疗和早期诊断都非常有帮助。早期同时检测核酸和蛋白质的方法包括多参数细胞分析系统、DNA阵列联合聚合酶链式反应、蛋白阵列联合酶联免疫技术。然而，这些分析方法通常采用湿化学(湿式)分析技术，需要多次加液、冲洗等步骤，操作复杂、分析时间长，而且还需要大型分析仪器和专业操作人员，这些因素限制其在现场、即时检测中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种面向蛋白与核酸检测的干式双极电化学发光微流控芯片，解决同一样本不同生物标志物的检测，或不同样本中生物标志物的检测。干化学分析技术与微流控芯片相结合，将反应所需的试剂固定在微流控芯片上，检测时只需加入待测样品和少量缓冲液，操作简单、检测快速，为即时检测提供了一种新思路。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种干式双极电化学发光微流控芯片，包括底板、电极片、检测片、结合片和加样片。
所述电极片包括一体化双性电极，驱动电极正、负极，报告通道和支持通道；一体化双性电极呈“一”字形，具有一个以上(在本申请中也称“多个”)的双性电极阳极和一个双性电极阴极；多个双性电极阳极为串联关系；所述报告通道数量与双性电极阳极数量一致；
每个双性电极阳极通过各自对应的报告通道与驱动电极负极连通，双性电极阴极通过支持通道与驱动电极正极连通。
所述的检测片叠放在电极片双性电极之上；所述检测片含有与电极片上报告通道、支持通道位置和数量对应的亲水通道，其中与电极片上支持通道对应的亲水通道为缓冲液通道，其余为待测样品通道；
所述的结合片叠放在检测片之上，含有与检测片上亲水通道位置和数量对应的亲水通道，同样区分为缓冲液通道和待测样品通道；
所述的加样片叠放在结合片之上；所述加样片上的缓冲液通道和待测样品通道与结合片上的通道位置对应；
所述加样片上的待测样品通道可为一个(与结合片上的多个待测样品通道连通)，用于进行同一样本中不同生物标志物的检测；
所述加样片上的待测样品通道的数量与结合片上的一致(为多个)，用于进行不同样本中生物标志物的检测；
所述电极片和结合片优选以棉布为衬底；所述检测片优选以吸水纸为衬底，具有较好的透光性；所述加样片优选以无纺布为衬底，具有较好的液体流动性；
一种微流控芯片检测盒，包括所述的干式双极电化学发光微流控芯片、透明盖片和外壳；
所述外壳包括上盖和下盖；
所述上盖设有加样孔、缓冲液添加孔、观察窗和电极接触区；
所述加样孔与加样片上的待测样品通道对应，所述缓冲液添加孔与加样片上的缓冲液通道对应，所述观察窗与检测片上的待测样品通道对应；
所述下盖设有芯片固定区，用于放置微流控芯片；
所述透明盖片覆盖在微流控芯片上方(包括加样片与结合片重叠部分、结合片、检测片和电极片；不影响加样)，避免纤维微流控芯片与外界直接接触。
所述的干式双极电化学发光微流控芯片和微流控芯片检测盒可用于同一样本不同生物标志物的检测，或不同样本中生物标志物的检测；
所述的生物标志物为蛋白质和/或核酸。
所述的干式双极电化学发光微流控芯片，用于对生物标志物的检测，包括以下步骤：
(1)在检测片和结合片的待测样品通道上滴加处理液，然后在检测片待测样品通道中固定可与生物标志物特异性结合的捕获抗体(或捕获探针)，在结合片待测样品通道中干化固定可与生物标志物特异性结合的标记抗体(或信号探针)；
当同时检测不同生物标志物时，在检测片上不同的待测样品通道中分别固定与生物标志物特异性结合的捕获抗体或捕获探针，在结合片上不同的待测样品通道中分别干化固定与生物标志物特异性结合的标记抗体或信号探针；
所述的检测片和结合片上的待测样品通道经过处理液预处理，以增加芯片的亲水性和储存稳定性；
进一步地，所述的处理液含有0.1％吐温-20、50mg/mL蔗糖、10mg/mL牛血清白蛋白和10mg/mL聚乙烯吡咯烷酮。
进一步地，所述的标记抗体或信号探针上含有电化学发光基团以及与待测生物标志物特异性结合的抗体或核酸链；
进一步地，所述的电化学发光基团为电化学发光发光物质(如联吡啶钌)与分子内共反应试剂(如聚赖氨酸)的偶联复合物。
(2)向加样孔滴加待测样品溶液，溶液由加样片流至结合片，生物标志物与结合片上的标记抗体(或信号探针)特异性结合，形成“标记抗体-生物标志物”(或“信号探针-生物标志物”)复合物；该复合物进一步随液体流至检测片，并与检测片上的捕获抗体(或捕获探针)进行特异性结合，形成“标记抗体-生物标志物-捕获抗体”(或“信号探针-生物标志物-捕获探针”)复合物；待测样品溶液添加后，向缓冲液添加孔滴加缓冲液，缓冲液流至电极片并充满电极片上的支持通道；
(3)向加样孔滴加一定体积的冲洗缓冲液，促进“标记抗体-生物标志物-捕获抗体”(或“信号探针-生物标志物-捕获探针”)复合物进一步生成，同时冲洗检测片上未结合的物质并充满电极片上的报告通道；
优选地，在步骤(2)滴加待测样品溶液4min后，步骤(3)开始滴加冲洗缓冲液；
(4)将干式双极电化学发光微流控芯片推入电化学发光分析仪中，向驱动电极施加驱动电压以触发检测片上待测样品通道上的电化学发光反应，产生的光信号被相机采集并传送至数据分析与储存单元，实现生物标志物的检测；
所述的驱动电压优选为8V；
所述的冲洗缓冲液为含有0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液(10×PBS，pH值7.2-7.4)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明提出了一种干式双极电化学发光微流控芯片，克服了传统电化学发光生物传感器电极难以修饰、多次加液、反复冲洗等缺点，简化了芯片修饰、检测过程。
2、目前绝大多数的诊断方法都是单独检测蛋白质或核酸。本发明中纤维微流控芯片具有多个待测样本液体通路，互不影响，可同时进行蛋白质免疫反应和核酸杂交反应，以进行蛋白质和核酸的同时检测。
3、目前已开发的蛋白质和核酸同时检测的生物传感器大多基于比色、荧光、电化学等方法，具有灵敏度不高、受背景光源影响、信号不易区分等缺点。本发明所提出的干式双极电化学发光微流控芯片克服了以上缺点，灵敏度高、背景低、易控制，尤其是多个发光信号在物理位置上分开，没有信号交叉干扰，增加了检测结果的准确性。
4、目前大多数检测方法检测模式单一。本发明提出的双极电化学发光微流控芯片，不仅可以用于同一样本中多个生物标志物的同时检测，也可以用于不同样本中单一或多个生物标志物的同时检测，满足不同场景下不同的应用需求。
5、本发明提出的干式双极电化学发光微流控芯片，在检测时仅需要滴加待测样品和缓冲液便可在6min内快速获得检测结果。与传统电化学发光分析仪相比，检测更便捷、时间更短，适用于现场快速检测。
附图说明
图1为干式双极电化学发光微流控芯片(具有结构A加样片)的结构分解示意图；
图2为干式双极电化学发光微流控芯片(具有结构A加样片)的结构整体示意图；
图3为微流控芯片检测盒(具有结构A加样片)的结构分解示意图；
图4为微流控芯片检测盒(具有结构A加样片)的结构整体示意图；
图5为微流控芯片(具有结构B加样片)的结构分解示意图；
图6为微流控芯片(具有结构B加样片)的结构整体示意图；
图7为微流控芯片(具有结构A加样片)上电化学发光强度值与AD7c-NTP浓度的关系图；
图8为微流控芯片(具有结构A加样片)上电化学发光强度值与同一样本中AD7c-NTP和ApoEε4浓度的关系图；
图9为对比芯片的结构分解示意图；
图10为对比芯片的结构整体示意图；
图11为对比芯片上电化学发光强度值与同一样本中AD7c-NTP和ApoEε4浓度的关系图；
1-加样片；1-1,1-2-加样片待测样品通道；1-3-加样片缓冲液通道；2-结合片；2-1,2-2-结合片待测样品通道；2-3-结合片缓冲液通道；3-检测片；3-1,3-2-检测片待测样品通道；3-3-检测片缓冲液通道；4-电极片；4-1,4-2-闭合式双性电极阳极；4-3-闭合式双性电极阴极；4-4,4-5-报告通道；4-6-支持通道；4-7-驱动电极负极；4-8-驱动电极正极；5-底板；6-上盖；6-1-加样孔；6-2-缓冲液添加孔；6-3-观察窗；6-4-电极接触区；7-透明盖板；8-纤维微流控芯片；9-下盖；9-1-芯片固定区。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
干式双极电化学发光微流控芯片，其制备过程如下：
1、使用绘图软件Adobe Illustrator CS6设计微流控芯片构型(包括加样片1、结合片2、检测片3和电极片4)，碳电极(包括驱动电极和闭合式双性电极)由碳墨丝网印刷技术制作而成，亲水通道(包括支持通道、报告通道、待测样品通道和缓冲液通道)由尼龙油墨丝网印刷技术制作而成。
2、使用绘图软件Solidworks 2020设计外壳结构(上盖6和下盖9)，外壳由3D打印机打印而成。
所得的微流控芯片如图1、图2、图5、图6所示，包括加样片1、结合片2、检测片3、电极片4和底板5；加样片1、结合片2、检测片3、电极片4分别以无纺布、棉布、吸水纸、棉布为衬底；
电极片4包括一体化双性电极，驱动电极负极4-7、正极4-8，报告通道4-4、4-5和支持通道4-6；一体化双性电极呈“一”字形，具有两个双性电极阳极4-1、4-2和一个双性电极阴极4-3；两个双性电极阳极4-1和4-2为串联关系；双性电极阳极4-1、4-2通过对应的报告通道4-4、4-5与驱动电极负极4-7连通，双性电极阴极4-3通过支持通道4-6与驱动电极正极4-8连通；
检测片3叠放在电极片4双性电极之上；检测片3设计有三条亲水通道3-1、3-2和3-3，其中一条为缓冲液通道3-3，其余两条为待测样品通道3-1、3-2；检测片3上的缓冲液通道3-3与电极片4上的双性电极阴极4-3对应并重叠；检测片3上的待测样品通道3-1、3-2分别与电极片4上的双性电极阳极4-1、4-2对应并重叠；
结合片2叠放在检测片3之上；结合片2设计有三条亲水通道2-1、2-2和2-3，其中一条为缓冲液通道2-3，其余两条为待测样品通道2-1、2-2；结合片2上的缓冲液通道2-3与检测片3上的缓冲液通道3-3对应并有1.5mm重叠；结合片2上的待测样品通道2-1、2-2分别与检测片3上的待测样品通道3-1、3-2对应并有1.5mm重叠；
加样片1叠放在结合片2之上；加样片1设计有两条亲水通道1-1、1-3(结构A)，其中一条为缓冲液通道1-3，另外一条为“T”字形待测样品通道1-1；加样片1上的缓冲液通道1-3与结合片2上的缓冲液通道2-3对应并有1.5mm重叠；加样片1上的待测样品通道1-1较宽部分与结合片2上的待测样品通道2-1、2-2对应并有1.5mm重叠(图1、图2)；
加样片1进一步可以设计有三条亲水通道1-1、1-2、1-3(结构B)，其中一条为缓冲液通道1-3，其余两条为待测样品通道1-1、1-2；加样片1上的缓冲液通道1-3与结合片2上的缓冲液通道2-3对应并有1.5mm重叠；加样片1上的待测样品通道1-1、1-2分别与结合片2上的待测样品通道2-1、2-2对应并有1.5mm重叠(图5、图6)；
所得的外壳(图3、图4)包括上盖6和下盖9；上盖6设有加样孔6-1、缓冲液添加孔6-2、观察窗6-3和电极接触区6-4，加样孔6-1与加样片1上的待测样品通道1-1较窄部分(结构A)或加样片1上的待测样品通道1-1、1-2(结构B)对应，缓冲液添加孔6-2与加样片1上的缓冲液通道1-3对应，观察窗6-3与检测片3上的待测样品通道3-1、3-2对应，电极接触区6-4与电极片4上的驱动电极正极4-8、负极4-7同时对应；下盖9设有芯片固定区9-1，用于放置微流控芯片8；透明盖片7覆盖在纤维微流控芯片8上方，避免纤维微流控芯片8与外界直接接触。
实施例2
实施例1的干式双极电化学发光微流控芯片(具有结构A加样片)用于蛋白质的精准检测，包括如下步骤：
(1)微流控芯片修饰
向结合片2的两条待测样品通道2-1、2-2分别滴加3μL处理液(0.1％吐温-20、50mg/mL蔗糖、10mg/mL牛血清白蛋白、10mg/mL聚乙烯吡咯烷酮的混合物)，于37℃真空干燥30min；接着分别滴加3μL抗阿尔兹海默病相关神经丝蛋白(AD7c-NTP)的标记抗体(70μg/mL)，于37℃下真空干燥；标记抗体含有聚赖氨酸-联吡啶钌复合物。
向检测片3的两条待测样品通道3-1、3-2分别滴加3μL处理液，于37℃真空干燥30min；接着分别滴加3μL抗AD7c-NTP的捕获抗体(120μg/mL)，于37℃孵育30min，利用壳聚糖-戊二醛化学键共价结合将捕获抗体固定在两条待测样品通道3-1、3-2中。
(2)芯片组装
如图2所示，所述的底板5是单面带胶的，将电极片4、检测片3、结合片2和加样片1依次叠加、固定在底板5上，以组装完成微流控芯片8。
如图3、图4所示，组装完成的微流控芯片8放置于下盖9的芯片固定区9-1内；透明盖片7覆盖在微流控芯片8上方，避免微流控芯片8与外界直接接触；压紧上盖6，组装完成干式双极电化学发光微流控芯片。
(3)蛋白质免疫反应
向加样孔6-1滴加20μL待测样品溶液(包含AD7c-NTP)，溶液由加样片1的待测样品通道1-1流至结合片2的两条待测样品通道2-1、2-2，目标蛋白AD7c-NTP与结合片2上的标记抗体特异性结合，形成“标记抗体-AD7c-NTP”复合物；该复合物进一步流至检测片3，并与检测片3上的捕获抗体进行特异性结合，形成“标记抗体-AD7c-NTP-捕获抗体”复合物；待测样品溶液添加后，向缓冲液添加孔6-2滴加20μL磷酸盐缓冲液，缓冲液流至电极片4并充满电极片4的支持通道4-6；
随后，等待蛋白免疫反应4min，向加样孔6-1滴加20μL冲洗缓冲液(含有0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液)，促进“标记抗体-AD7c-NTP-捕获抗体”复合物进一步生成，同时冲洗检测片3上未结合的物质并充满电极片4的两个报告通道4-4、4-5。
(4)电化学发光检测
将干式双极电化学发光微流控芯片推入电化学发光分析仪(专利申请号202210518683.4)中，按下检测开始按钮，向驱动电极负极4-7、正极4-8施加8V驱动电压以同时触发检测片3上两个待测样品通道3-1、3-2上的电化学发光反应，产生的光信号被相机采集并传送至数据分析与储存单元，实现样品溶液中AD7c-NTP精准检测。
电化学发光强度与AD7c-NTP浓度的关系如图7所示，可以看出干式双极电化学发光微流控芯片具有对蛋白质进行精准检测的能力。
实施例3
实施例1的干式双极电化学发光微流控芯片(具有结构A加样片)用于同一样本中蛋白质和核酸的同时检测，包括如下步骤：
(1)纤维微流控芯片修饰
向结合片2的两条待测样品通道2-1、2-2分别滴加3μL处理液，于37℃真空干燥30min；接着分别滴加3μL抗AD7c-NTP的标记抗体(70μg/mL)和3μL与载脂蛋白E基因(ApoEε4)互补的信号探针(0.7μM)，于37℃真空干燥30min。标记抗体和信号探针都含有聚赖氨酸-联吡啶钌复合物。
向检测片3的两条待测样品通道3-1、3-2分别滴加3μL处理液，于37℃真空干燥30min；接着分别滴加3μL抗AD7c-NTP的捕获抗体(120μg/mL)和3μL与ApoEε4互补的捕获探针(1μM)，于37℃孵育30min，利用壳聚糖-戊二醛化学键共价结合将捕获抗体和捕获探针分别固定在待测样品通道3-1、3-2中。
(2)芯片组装同实施例2
(3)蛋白质免疫反应和核酸杂交反应
向加样孔6-1滴加20μL待测样品溶液(包含AD7c-NTP和ApoEε4)，溶液由加样片1的待测样品通道1-1流至结合片2的两条待测样品通道2-1、2-2，目标蛋白AD7c-NTP和目标核酸ApoEε4分别与结合片2上的标记抗体和信号探针特异性结合，相应形成“标记抗体-AD7c-NTP”和“信号探针-ApoEε4”复合物；复合物进一步流至检测片3，并与检测片3上的捕获抗体和捕获探针进行特异性结合，相应形成“标记抗体-AD7c-NTP-捕获抗体”和“信号探针-ApoEε4-捕获探针”复合物；待测样品溶液添加后，向缓冲液添加孔6-2滴加20μL磷酸盐缓冲液，缓冲液流至电极片4并充满电极片4的支持通道4-6；
随后，等待蛋白免疫反应和核酸杂交反应进行4min，向加样孔6-1滴加20μL冲洗缓冲液，促进“标记抗体-AD7c-NTP-捕获抗体”和“信号探针-ApoEε4-捕获探针”复合物进一步生成，同时冲洗检测片3上未结合的物质并充满电极片4的报告通道4-4、4-5。
(4)电化学发光检测
将干式双极电化学发光微流控芯片推入电化学发光分析仪中，按下检测开始按钮，向驱动电极负极4-7、正极4-8施加8V驱动电压以同时触发检测片3上两个待测样品通道3-1、3-2上的电化学发光反应，产生的光信号被相机采集并传送至数据分析与储存单元，实现同一样本中AD7c-NTP和ApoEε4的同时检测。
电化学发光强度与AD7c-NTP浓度和ApoEε4浓度之间的关系如图8所示，可以看出干式双极电化学发光微流控芯片具有对同一样本蛋白质和核酸进行同时检测的能力。
对比例
干式双极电化学发光微流控芯片(专利申请号202210518635.5，简称对比芯片)用于同一样本中的蛋白质和核酸的同时检测，包括如下步骤：
(1)对比芯片的制备
使用绘图软件Adobe Illustrator CS6设计芯片构型，碳电极(包括驱动电极和闭合式双性电极)由碳墨丝网印刷技术制作而成，亲水通道(包括支持通道、报告通道、待测样品通道和缓冲液通道)由尼龙油墨丝网印刷技术制作而成。
所得的对比芯片如图9、图10所示，包括加样片1、结合片2、检测片3、电极片4和底板5，加样片1、结合片2、检测片3、电极片4分别以无纺布、棉布、吸水纸、棉布为衬底；。
电极片4包括一体化双性电极，驱动电极正极4-8、负极4-7，报告通道4-4和支持通道4-6；一体化双性电极呈“E”字形，具有双性电极阳极4-1、4-2和一个双性电极阴极4-3；两个双性电极阳极4-1、4-2为并联关系；双性电极阳极4-1、4-2通过报告通道4-4与驱动电极负极4-7连通，双性电极阴极4-3通过支持通道4-6与驱动电极正极4-8连通；
检测片3叠放在电极片4之上；检测片3设计有三条亲水通道3-1、3-2、3-3，其中一条为缓冲液通道3-3，其余两条为待测样品通道3-1、3-2；检测片3上的缓冲液通道3-3与电极片4上的双性电极阴极4-3对应并重叠；检测片3上的待测样品通道3-1、3-2分别与电极片4上的双性电极阳极4-1、4-2对应并重叠；
结合片2叠放在检测片3之上；结合片2设计有两条亲水通道2-1、2-3，其中一条为缓冲液通道2-3，另一条为待测样品通道2-1；结合片2上的缓冲液通道2-3与检测片3上的缓冲液通道3-3对应并有1.5mm重叠；结合片2上的待测样品通道2-1同时与检测片3上的两条待测样品通道3-1、3-2对应并有1.5mm重叠；
加样片1叠放在结合片2之上；加样片1设计有两条亲水通道1-1、1-3，其中一条为缓冲液通道1-3，另一条为待测样品通道1-1；加样片1上的缓冲液通道1-3与结合片2上的缓冲液通道2-3对应并部分重叠；加样片1上的待测样品通道1-1与结合片2上的待测样品通道2-1对应并有1.5mm重叠；
(2)对比芯片修饰
向结合片2的待测样品通道2-1滴加5μL处理液，于37℃真空干燥30min；接着滴加6μL标记抗体和信号探针的混合物(含抗AD7c-NTP的标记抗体(70μg/mL)和与ApoEε4互补的信号探针(0.7μM))，于37℃真空干燥30min。标记抗体和信号探针都含有聚赖氨酸-联吡啶钌复合物。
向检测片3的两条待测样品通道3-1、3-2分别滴加3μL处理液，于37℃真空干燥30min；接着分别滴加3μL抗AD7c-NTP的捕获抗体(120μg/mL)和3μL与ApoEε4互补的捕获探针(1μM)，于37℃孵育30min，利用壳聚糖-戊二醛化学键共价结合将捕获抗体和捕获探针分别固定在待测样品通道3-1、3-2中。
(3)对比芯片组装
如图10所示，所述的底板5是单面带胶的，将电极片4、检测片3、结合片2和加样片1依次叠加、固定在底板5上，组装完成微流控芯片8。
将组装完成的微流控芯片8放置于下盖9的芯片固定区9-1内；透明盖片7覆盖在纤维微流控芯片8上方，避免纤维微流控芯片8与外界直接接触；压紧上盖6，组装完成干式双极电化学发光微流控芯片。
(4)蛋白质免疫反应和核酸杂交反应
向加样孔6-1滴加20μL待测样品溶液(包含AD7c-NTP和ApoEε4)，溶液由加样片1的待测样品通道1-1流至结合片2的待测样品通道2-1，目标蛋白AD7c-NTP和目标核酸ApoEε4分别与结合片2上的标记抗体和信号探针特异性结合，形成“标记抗体-AD7c-NTP”和“信号探针-ApoEε4”复合物；复合物进一步流至检测片3的两个待测样品通道3-1、3-2，分别与待测样品通道3-1、3-2上的捕获抗体和捕获探针进行特异性结合，相应形成“标记抗体-AD7c-NTP-捕获抗体”和“信号探针-ApoEε4-捕获探针”复合物；待测样品溶液添加后，向缓冲液添加孔6-2滴加20μL磷酸盐缓冲液，缓冲液流至电极片4并充满电极片4的支持通道4-6；
随后，等待蛋白免疫反应和核酸杂交反应进行4min，向加样孔6-1滴加20μL冲洗缓冲液，促进“标记抗体-AD7c-NTP-捕获抗体”和“信号探针-ApoEε4-捕获探针”复合物进一步生成，同时冲洗检测片3上未结合的物质并充满电极片4的报告通道4-4。
(5)电化学发光检测过程同实施例3
图11是电化学发光强度与AD7c-NTP浓度和ApoEε4浓度之间的关系。从图可以看出，相同浓度下对应的发光强度约为图8中发光强度的二分之一。这种现象的可能原因之一是对比例中结合片2的待测样品通道2-1上的标记抗体和信号探针可以同时流入检测片3的待测样品通道3-1、3-2上，从而导致标记抗体、信号探针无法全部流入检测片3上对应的待测样品通道3-1、3-2，使得发光强度大大降低。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种干式双极电化学发光微流控芯片，包括底板、电极片、检测片、结合片和加样片；所述电极片包括一体化双性电极，驱动电极正、负极，报告通道和支持通道；所述的检测片叠放在电极片双性电极之上；所述的结合片叠放在检测片之上；所述的加样片叠放在结合片之上；
其特征在于：所述电极片的一体化双性电极呈“一”字形，具有一个以上的双性电极阳极和一个双性电极阴极；多个双性电极阳极为串联关系；所述报告通道数量与双性电极阳极数量一致；
所述检测片含有与电极片上报告通道、支持通道位置和数量对应的亲水通道，其中与电极片上支持通道对应的亲水通道为缓冲液通道，其余为待测样品通道；
所述的结合片含有与检测片上亲水通道位置和数量对应的亲水通道；
所述加样片上的缓冲液通道和待测样品通道与结合片上的通道位置对应；所述加样片上的待测样品通道为一个或多个。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述电极片上，每个双性电极阳极通过各自对应的报告通道与驱动电极负极连通，双性电极阴极通过支持通道与驱动电极正极连通。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述检测片以吸水纸为衬底。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述加样片以无纺布为衬底。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述电极片和结合片以棉布为衬底。
6.权利要求1-5任一项所述的微流控芯片在同一样本不同生物标志物检测中的应用，和在不同样本生物标志物检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的生物标志物为蛋白质和/或核酸。
8.权利要求1-5任一项所述的微流控芯片用于对生物标志物的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在检测片和结合片的待测样品通道上滴加处理液，然后在检测片待测样品通道中固定可与生物标志物特异性结合的捕获抗体(或捕获探针)，在结合片待测样品通道中干化固定可与生物标志物特异性结合的标记抗体(或信号探针)；
(2)向加样孔滴加待测样品溶液，溶液由加样片流至结合片，生物标志物与结合片上的标记抗体(或信号探针)特异性结合，形成“标记抗体-生物标志物”(或“信号探针-生物标志物”)复合物；该复合物进一步随液体流至检测片，并与检测片上的捕获抗体(或捕获探针)进行特异性结合，形成“标记抗体-生物标志物-捕获抗体”(或“信号探针-生物标志物-捕获探针”)复合物；待测样品溶液添加后，向缓冲液添加孔滴加缓冲液，缓冲液流至电极片并充满电极片上的支持通道；
(3)向加样孔滴加一定体积的冲洗缓冲液，促进“标记抗体-生物标志物-捕获抗体”(或“信号探针-生物标志物-捕获探针”)复合物进一步生成，同时冲洗检测片上未结合的物质并充满电极片上的报告通道；
(4)将干式双极电化学发光微流控芯片推入电化学发光分析仪中，向驱动电极施加驱动电压以触发检测片上待测样品通道上的电化学发光反应，产生的光信号被相机采集并传送至数据分析与储存单元，实现生物标志物的检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)，当同时检测不同生物标志物时，在检测片上不同的待测样品通道中分别固定与生物标志物特异性结合的捕获抗体或捕获探针，在结合片上不同的待测样品通道中分别干化固定与生物标志物特异性结合的标记抗体或信号探针。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的标记抗体或信号探针上含有电化学发光基团以及与待测生物标志物特异性结合的抗体或核酸链。
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