CN118240922A - 一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法 - Google Patents

一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN118240922A
CN118240922A CN202410421802.3A CN202410421802A CN118240922A CN 118240922 A CN118240922 A CN 118240922A CN 202410421802 A CN202410421802 A CN 202410421802A CN 118240922 A CN118240922 A CN 118240922A
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection
sheet
region
probe
electrode
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410421802.3A
Other languages
English (en)
Inventor
章春笋
刘晓雅
黄嘉妮
高梓曦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Normal University
Original Assignee
South China Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Normal University filed Critical South China Normal University
Priority to CN202410421802.3A priority Critical patent/CN118240922A/zh
Publication of CN118240922A publication Critical patent/CN118240922A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G01N21/763—Bioluminescence

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Pathology (AREA)

Abstract

本申请公开了一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法，该方法包括以下步骤：根据靶DNA序列设计C区捕获探针和信号探针，以及T区的捕获探针和信号探针；在检测试剂条结合片的亲水通道A滴涂有偶联三联吡啶钌‑聚赖氨酸复合物的信号探针；将含捕获探针的混合溶液通过划线方式分别在对应的区域修饰固定C区捕获探针和T区捕获探针；先后向检测试剂条加样片的亲水通道A滴加待测样品溶液和缓冲溶液；同时向亲水通道B上滴加缓冲溶液连通电路，触发电化学发光反应；采集电化学发光信号，实现检测。本发明的检测方法采用自增强电化学发光探针作为信号探针，并修饰在结合片上以放大电化学发光信号，从而实现对T‑DNA的超灵敏定量检测。

Description

一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法
技术领域
本发明属于微流控检测领域，具体涉及一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法。
背景技术
微流控技术是一种可精确控制和操控微尺度流体的技术，可实现分析处理全过程的自动化和高效化，因其具有检测试剂消耗量少、灵敏度高和分析成本低等优点，近年来已成为即时检验(point-of-care testing，POCT)领域的研究热点。目前，基于微流控技术与各种检测技术相结合，已经开发出多种快速简便的传染病检测方法，并在体外诊断领域表现出巨大的应用潜力。
基因是遗传的基本单元，携带有遗传信息的DNA或RNA序列，通过复制把遗传信息传递给下一代。基因检测是指通过血液或其他体液对基因进行检验的技术。在许多感染性疾病中，病原体量化已经被证明是一项有用的预后指标和监测治疗反应的重要参考。目前，一些常用的基因检测方法有电化学发光法、电化学法、荧光分析法、比色分析法等。
电化学发光是一种由电化学激发的化学发光现象。早在1991年，Bard等人就将基于Ru(bpy)3 2+的电化学发光应用于免疫测定和DNA分析。随着研究的不断深入，电化学发光凭借背景低、灵敏度高、检测范围宽和可控性好等优势，已发展成为一种广泛应用于生物传感领域的强大分析技术，其在基础研究、环境监测、临床诊断、免疫分析和食品安全等领域已经取得诸多实质性进展。
侧向流检测方法能够用于检测样品(尿液、唾液、汗液、血清、血浆、全血等)中是否存在目标物，具有能够在数分钟内提供定量、半定量或定性结果，无需特定且昂贵的设备的优势。这种检测方法成本低、使用简单、检测时间较短、能够稳定储存，非常适合用于医疗诊断、家庭测试、POCT或实验室应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法。该方法解决了目前核酸检测过程中操作复杂、成本高、耗时长等难题，可实现病原体的快速定量以及高特异性、高灵敏度检测。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法，是基于侧向流基因检测试剂条和/或检测试剂盒；
所述的侧向流基因检测试剂条，包括电极和两条亲水通道A和B，电极与两条亲水通道有部分重叠；
所述的亲水通道A和B分布在加样片、结合片、检测片和吸收片上；
所述加样片用于滴加待测样品溶液，并使待测样品溶液流向检测片；
所述结合片用于干化标记有电化学发光物质的信号探针，它一端连接检测片，另一端连接加样片；
所述的电极位于电极片上；
所述的电极包括一体化双性电极和一对驱动电极(正极和负极)；所述的一体化双性电极包括阴极和并联的至少两个阳极；其中，靠近加样片的一体化双性电极阳极称为质控阳极，靠近吸收片的一体化双性电极阳极称为检测阳极；
加样检测时，一体化双性电极的阳极与对应的驱动电极负极位于报告通道中，一体化双性电极的阴极与对应的驱动电极阳极位于支持通道中；
所述的检测片与一体化双性电极重叠；其中，与一体化双性电极阳极重叠的称为亲水通道A，另一条亲水通道则为亲水通道B。
所述亲水通道A中与质控阳极重叠的部分称为质控区(C区)，亲水通道A中与检测阳极重叠的部分称为检测区(T区)，C区和T区分别用于修饰固定质控区的捕获探针和检测区的捕获探针，以用于监测试剂条可行性和生物标志物浓度。
所述的检测片由硝酸纤维素膜制成。
在加样片、结合片、检测片、电极片和吸收片下可以装有底板。
所述的侧向流基因检测试剂盒，含有上述的检测试剂条；
所述的检测试剂盒还包括上盖、透明盖板和下盖。
所述的试剂条固定在下盖上，所述透明盖板覆盖在试剂条的结合片、检测片、电极片和吸收片(部分覆盖)上；
所述上盖覆盖在透明盖板上；
所述上盖设有加样孔、缓冲液添加孔、观察窗和电极接触区；
所述的加样孔和缓冲液添加孔分别对应于加样片上的亲水通道A和亲水通道B；
所述的观察窗对应于检测片上位于亲水通道A的质控区和检测区；
所述的电极接触区对应于驱动电极。
所述的闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法，包括以下步骤：
(1)设计探针DNA序列
根据靶DNA(T-DNA)序列设计C区捕获探针和信号探针，以及T区的捕获探针和信号探针；
所述的C区捕获探针，其5'端修饰生物素；
所述的C区信号探针，其5'端修饰氨基；
所述的T区捕获探针，其3'端修饰生物素；
所述的T区信号探针，其5'端修饰氨基；
所述T-DNA的5'端与T区捕获探针的3'端互补；
所述T-DNA的3'端与T区信号探针的5'端互补；
所述C区捕获探针与C区信号探针序列完全互补；
所述的T-DNA与T区信号探针和捕获探针互补的碱基对数优选18bp；
(2)检测试剂条预处理和修饰
在检测试剂条加样片的亲水通道A滴加处理液，并烘干，滴加处理液用于改善加样片亲水性，提升加样片对待测样品溶液的吸收速度；
在检测试剂条结合片的亲水通道A滴加处理液并烘干，然后在检测试剂条结合片的亲水通道A滴涂有偶联三联吡啶钌-聚赖氨酸复合物的信号探针，在25℃-37℃下真空干燥，其中滴加处理液是用来提高信号探针的稳定性，使信号探针能够更好、更快地释放，消除非特异性吸附；
检测试剂条的检测片经表面活性剂溶液浸泡处理，37℃恒温恒湿烘干，将含捕获探针的混合溶液通过划膜仪划线方式分别在对应的区域修饰固定C区捕获探针和T区捕获探针，修饰宽度优选2mm，使用表面活性剂溶液进行预处理是为了使待测样品溶液能够在检测片上均匀扩散，使发光效果更稳定；
在检测试剂条吸收片的亲水通道A滴加处理液，并烘干，滴加处理液是为了提高液体的流动性；
所述加样片处理液为含1％SDS、0.5％PVP、0.5％BSA的缓冲液(pH 7.4)；
所述结合片处理液为含0.5％明胶、2.5％海藻糖、1％ BSA、0.1％ Triton X-100、0.1％ Proclin300防腐剂的缓冲液(pH 7.4)；所述结合片上修饰信号探针的用量为6μL；
所述检测片的表面活性剂溶液为含0.5％ S9(Tetronic1307)和0.9％ NaCl的混合溶液；所述的含捕获探针的混合溶液为5％蔗糖，5％海藻糖，0.5mg/mL链霉亲和素和50μM捕获探针的混合溶液；
所述吸收片处理液为含0.5％吐温的缓冲液。
(3)样品检测
向检测试剂条加样片的亲水通道A滴加待测样品溶液，等待数分钟后，向加样片上的亲水通道A滴加缓冲溶液，一方面冲洗掉检测区未结合上的信号探针，另一方面使亲水通道A充满溶液；同时向亲水通道B上滴加缓冲溶液连通电路，然后将检测试剂条的驱动电极正极和负极与电源相连，施加适当电压以触发电化学发光反应；
电化学发光信号以图片和视频的形式采集，并进一步通过程序分析，实现对病原体核酸的定性和定量检测；
所述闭合式双极电化学发光的驱动电压优选为8.5V；所述杂交反应时间优选为3min；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)；所述的电化学发光侧向流基因检测方法可以用于检测核酸、扩增产物、CRISPR/Cas的顺式和反式切割产物、蛋白和小分子标记物的一种。
本发明的基本原理是：
将修饰有生物素的捕获探针和链霉亲和素室温孵育，通过划膜仪划线的方式将捕获探针修饰在检测片上的对应区域，生物素和链霉亲和素的亲和作用使得捕获探针固定在检测片上，提高了捕获探针的固定效率和稳定性；固定后的捕获探针与T-DNA进行杂交反应，从而使最终形成的杂交复合物固定在检测区。
当含有T-DNA的待测样品溶液滴加到试剂条的加样片上，溶液流经结合片，T-DNA与结合片上修饰的T区信号探针杂交形成“T区信号探针-T-DNA”复合物；再进一步流至检测片，经充分杂交反应形成“T区信号探针-T-DNA-T区捕获探针”杂交复合物；同时C区信号探针与C区捕获探针杂交形成“C区信号探针-C区捕获探针”杂交复合物；待反应结束后，向加样片的亲水通道A滴加缓冲溶液，一方面冲洗掉检测区未结合上的信号探针，另一方面使亲水通道A充满溶液；同时，向亲水通道B滴加缓冲溶液，连通电路；最后将试剂条的驱动电极正极和负极与电源相连，并施加适当电压以触发电化学发光反应。
杂交复合物中的自增强电化学发光探针偶联了三联吡啶钌-聚赖氨酸复合物，其富集了大量的发光基团，能够有效放大电化学发光信号，实现对生物标志物T-DNA的超灵敏定量检测。
本发明相对于现有技术具有以下优点及效果：
1.本发明检测试剂条的检测片采用硝酸纤维素膜，与传统电化学发光芯片相比，修饰操作简单，反应快速、灵敏，检测结果更稳定，在一定程度上避免溶液残留而导致的假阳性结果。
2.本发明检测试剂条除检测片之外，能采用布、纸、玻璃纤维等材料作为衬底材料，材料简单易得且环保，成本更加低廉，便于批量生产。
3.本发明检测试剂条的电极片是一种闭合式双极电极，两个双性电极阳极呈并联式对称分布，这种设计不仅缩小了电极和亲水通道的面积，而且还缩减了电极的占据空间、减少了印刷材料和试剂的消耗，降低了成本。
4.本发明检测试剂条的电极片具有排列多个检测阳极的潜力，能实现多路多元检测。
5.本发明的检测方法采用自增强电化学发光探针作为信号探针，并修饰在结合片上以放大电化学发光信号，从而实现对T-DNA的超灵敏定量检测。
6.本发明的检测方法可用于检测扩增产物，CRISPR/Cas产物，蛋白，小分子标记物等，检测方法、检测模式多元化，具有较好的通用性和实用性。
7.本发明的检测试剂条和试剂盒小巧便携，不需要大型仪器作为检测基础，与传统电化学发光分析仪相比，操作简单，便于携带，可用于不同场景的POCT应用，并且满足家用式自检试剂盒的需求。
附图说明
图1为闭合式双极电化学发光侧向流基因检测试剂条的结构分解示意图。
图2为闭合式双极电化学发光侧向流基因检测试剂条的结构整体示意图。
图3为闭合式双极电化学发光侧向流基因检测试剂条电极片的组成结构示意图。
图4为闭合式双极电化学发光侧向流基因检测试剂盒的结构分解示意图。
图5为闭合式双极电化学发光侧向流基因检测试剂盒的结构整体示意图。
图6为不同浓度PCR扩增产物的CRISPR/Cas12a顺式切割产物的电化学发光T/C数值柱状图。
图7为对流PCR产物在不同稀释倍数时的电化学发光T/C数值柱状图。
图8为不同扩增时间的对流PCR扩增产物经过100倍稀释时的电化学发光T/C数值柱状图。
其中：1-加样片；2-结合片；3-检测片；4-电极片；5-吸收片；6-底板；7-支持通道；8-报告通道；9-双性电极质控阳极；10-双性电极检测阳极；11-驱动电极负极；12-驱动电极正极；13-双性电极阴极；14-上盖；15-透明盖板；16-闭合式双极电化学发光侧向流基因检测试剂条；17-下盖；18-加样孔；19-缓冲液添加孔；20-观察窗；21-电极接触区。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
电化学发光侧向流基因检测试剂条和试剂盒的设计和制作，包括以下步骤：
(1)试剂条的设计
所述的电化学发光侧向流基因检测试剂条包括电极和两条亲水通道A和B，如图1和图2所示，电极与两条亲水通道有部分重叠；
所述的亲水通道A和B分布在加样片1、结合片2、检测片3和吸收片5上；
加样片1用于滴加待测样品溶液，可对待测样品溶液进行层析过滤，快速吸收待测样品溶液并流向结合片2；
结合片2用于干化标记有电化学发光发光物质的信号探针，它一端连接检测片3，另一端连接加样片1，构建了良好的待测样品流动通道；
所述的电极位于电极片4上；
所述的电极包括一体化双性电极和一对驱动电极(负极11和正极12)，如图3所示；所述的一体化双性电极包括阴极(13)和并联的至少两个阳极(9和10)；其中，靠近加样片1的一体化双性电极阳极称为质控阳极9，靠近吸收片5的一体化双性电极阳极称为检测阳极10；
加样检测时，一体化双性电极的阳极(9和10)与对应的驱动电极负极11位于报告通道8中，一体化双性电极的阴极13与对应的驱动电极正极12位于支持通道7中；
所述的检测片3与一体化双性电极重叠；其中，与一体化双性电极阳极(9和10)重叠的称为亲水通道A，另一条亲水通道则为亲水通道B。
所述亲水通道A中与质控阳极9对应的部分称为质控区(C区)，亲水通道A中与检测阳极10对应的部分称为检测区(T区)，C区和T区分别用来修饰固定质控区的捕获探针(即C区捕获探针)和检测区的捕获探针(即T区捕获探针)，以用于监测试剂条可行性和T-DNA浓度。
在加样片1、结合片2、检测片3、电极片4和吸收片5下可以装有底板6。
(2)试剂条的制作
使用绘图软件Adobe Illustrator CS6设计加样片1、结合片2、检测片3、电极片4和吸收片5中亲水通道和电极的形状，据此制作300目聚酯微通道网板和电极网板。
加样片1、结合片2和吸收片5由PP油墨网印技术制得，通过油墨网印无纺布形成由疏水油墨围成的亲水通道；检测片3由硝酸纤维素膜裁剪成特定尺寸制得；电极片4由导电碳墨网印疏水布而制得。
(3)电化学发光侧向流基因检测试剂盒的结构
所述电化学发光侧向流基因检测试剂盒的结构如图4和图5所示，包括上盖14、透明盖板15、试剂条16和下盖17。
所述试剂条16固定在下盖17上，所述透明盖板15覆盖在试剂条16的结合片2、检测片3、电极片4和吸收片5(部分覆盖)上；
所述上盖14覆盖在透明盖板15上；
所述上盖14设有加样孔18、缓冲液添加孔19、观察窗20和电极接触区21；
所述的加样孔18和缓冲液添加孔19分别对应于亲水通道A和亲水通道B的加样片1；
所述的观察窗20对应于检测片3上位于亲水通道A的C区和T区；
所述的电极接触区21对应于驱动电极(负极11和正极12)。
实施例2
本发明的闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法在检测CRISPR/Cas12a顺式切割产物中的应用，具体流程如下：
(1)DNA提取
将待测菌株进行培养，使用磁珠法提取出大肠杆菌O157:H7的DNA，将得到的DNA溶液放于-20℃储存、备用。
(2)聚合酶链式反应(PCR)扩增
取一PCR管，往其中加入5μL DNA溶液，5μL Taq缓冲液(10×)，4μLdNTP(2.5mM)，0.24μL Taq酶(5U/μL)，各1μL的上下游引物(10μM)混匀后放置于普通PCR仪中进行扩增。扩增参数设置为95℃条件下2min热变性，接着进行35个热循环(95℃，15s；60℃，30s)，循环结束后将温度降为4℃并维持一段时间。得到的PCR扩增产物经过紫外分光光度计测得浓度为460μg/μL，将得到的扩增产物放于-20℃储存、备用。
所述的引物序列如下：
上游引物：5'-ttctttttcttatacatttact-3'(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5'-tacagacctgagttgcacctaa-3'(SEQ ID NO.2)。
(3)CRISPR/Cas12a顺式切割
取一个PCR管，往其中加入2μL反应缓冲液(10×)，2μL crRNA(2μM)，2μL Cas12a(1mM)，12μL无核酸酶水，接着加入2μL扩增产物(460，46或4.6μg/μL)，混匀后放置在45℃下反应3min，然后升温至95℃使Cas蛋白失活，3min后立即放于冰上，防止切割后的产物重新形成双链结构，将得到CRISPR/Cas12a顺式切割产物的溶液放于-20℃储存，以备后续检测使用。
所述的PCR扩增产物序列如SEQ ID NO.3所示；
所述crRNA序列如下：
5'-taatttctactaagtgtagatccaaccgtcattgacaggaa-3'(SEQ ID NO.4)；
所述的CRISPR/Cas12a顺式切割产物序列如下：
5'-aggtatatcggaaggagatgaagttattgttccaacactgacat-3'(SEQ ID NO.5)。
(4)根据CRISPR/Cas12a顺式切割产物序列来设计基因检测试剂条所需的DNA序列，包括C区信号探针S1、T区信号探针S2、C区捕获探针CP1和T区捕获探针CP2。
所设计的DNA序列如下：
S1：5'-NH2-(CH2)6-ggcacaaacacgcacctc-3'(SEQ ID NO.6)；
CP1：5'-Biotin-gaggtgcgtgtttgtgcc-3'(SEQ ID NO.7)；
S2：5'-NH2-(CH2)6-tacagacctgagttgcacctaa-3'(SEQ ID NO.8)；
CP2：5'-ttctttttcttatacatttact-Biotin-3'(SEQ ID NO.9)。
(5)检测试剂条预处理和修饰
在检测试剂条加样片1的亲水通道A滴加处理液，进行预处理并烘干；在检测试剂条结合片2的亲水通道A滴加处理液进行预处理并烘干，然后往预处理的结合片2的亲水通道A中滴加6μL信号探针溶液(C区信号探针S1和T区信号探针S2的混合溶液)，放置于37℃真空干燥30min左右，信号探针偶联有三联吡啶钌-聚赖氨酸复合物(可参考中国专利申请2023107087058)；检测试剂条的检测片3经表面活性剂溶液浸泡处理，37℃恒温恒湿烘干，将含捕获探针的混合溶液通过划膜仪划线方式分别在对应的区域修饰固定C区捕获探针CP1和T区捕获探针CP2，修饰宽度优选2mm；在检测试剂条吸收片5的亲水通道A滴加处理液，进行预处理并烘干。
所述加样片1处理液为含1％SDS、0.5％PVP、0.5％BSA的PBS(pH 7.4)；所述结合片2处理液为含0.5％明胶、2.5％海藻糖、1％BSA、0.1％Triton X-100、0.1％Proclin300防腐剂的PBS(pH 7.4)，所述结合片2上修饰信号探针的用量为6μL；所述检测片3的表面活性剂溶液为含0.5％S9(Tetronic1307)和0.9％NaCl的混合溶液；所述的含捕获探针的混合溶液为5％蔗糖，5％海藻糖，0.5mg/mL链霉亲和素和50μM捕获探针的混合溶液；所述吸收片5处理液为含0.5％吐温的PBS。
(6)检测试剂盒组装
如图1所示，所述检测试剂条以单面带胶的底板6为基底，由吸收片5、电极片4、检测片3、结合片2、加样片1依次层叠组装而成。
如图4、5所示，组装后的试剂条16放置于外壳下盖17中，透明盖板15覆盖在试剂条16上方，用于固定试剂条和提供稳定检测环境，压紧上盖14以组装完成闭合式双极电化学发光侧向流基因检测试剂盒。
(7)电化学发光检测
取20μL CRISPR/Cas12a顺式切割产物溶液通过加样孔18滴加到加样片1上，溶液流至并充满检测片3后等待杂交反应3min，通过加样孔18滴加30μLPBS至加样片1，一方面冲洗掉检测区上未结合的信号探针，另一方面使报告通道8充满溶液；同时，通过缓冲液添加孔19向支持通道7滴加20μL PBS，连通电路。然后，将电极片5的驱动电极负极11、正极12通过鳄鱼夹导线连接到直流电源，通电施加8.5V电压，触发电化学发光反应。
(8)数据采集与处理
通过仪器(发明专利申请号202210518683.4)采集发光图像并分析，将所得数据导入Origin软件进一步分析处理，可得到T/C数值(T区发光强度与C区发光强度的比值)与PCR扩增产物浓度之间的数据关系(每个数据点均采用5次重复实验计算所得)。
测试结果如图6所示，可以看出：随着PCR扩增产物浓度的增加，T/C数值逐渐增大，并且不同浓度之间的T/C数值区分明显，可以看出本发明的闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法具有检测CRISPR/Cas12a顺式切割产物的能力。
实施例3
本发明的闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法在检测对流PCR产物中的应用，具体流程如下：
(1)DNA提取
将待测菌株进行培养，使用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取大肠杆菌O157:H7的DNA，用超纯水稀释100倍，将得到的DNA溶液放于-20℃储存、备用。
(2)对流PCR扩增
取一PCR管，分别加入2μL 10×PCR缓冲液(含Mg2+)，1μL dNTP(2.5mM)，各1.6μL上下游引物(2.5μM)，0.16μL Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1.6μL DNA溶液和12.24μL超纯水，均匀混合。离心后将溶液转移到对流管中，再次离心后加入2μL硅油，从而完成对流管中反应溶液配制。接着，将对流管放置于对流PCR仪恒温加热数分钟进行PCR扩增。PCR完成后，将扩增产物吸出，并加入超纯水稀释到相应倍数。得到的扩增产物稀释液通过高温98℃加热4min解链，接着迅速将高温加热后的产物转移到冰上，得到的单链扩增产物放置于-20℃储存，以供后续检测使用。
所述的引物序列如下：
上游引物：5'-tgtccacacgatgccaatg-3'(SEQ ID NO.10)；
下游引物：5'-ctgaggatcttggttggcg-3'(SEQ ID NO.11)。
所述的对流PCR扩增产物序列如下：
5'-cgccaaccaagatcctcagctatagggtgcttttgatatttttccgagtacattggcatcgtgtggaca-3'
(SEQ ID NO.12)。
(3)根据对流PCR扩增产物序列来设计基因检测试剂条所需的DNA序列，包括T区信号探针S3和T区捕获探针CP3(C区信号探针S1和捕获探针CP1同实施例2)。
所设计的T区信号探针S3和T区捕获探针CP3序列如下：
S3：5'-NH2-(CH2)6-atgtactcggaaaaatat-3'(SEQ ID NO.13)；
CP3：5'-caaaagcaccctatagct-Biotin-3'(SEQ ID NO.14)。
(4)试剂条预处理和修饰
预处理和修饰过程类似于实施例2，所采用的探针如下：C区信号探针S1，T区信号探针S3；C区捕获探针CP1，T区捕获探针CP3。
(5)检测试剂盒组装同实施例2
(6)电化学发光检测同实施例2
(7)数据采集与处理同实施例2
对对流PCR扩增产物的不同倍数稀释液进行检测。对流PCR扩增时间为35min，扩增产物的稀释倍数分别为10，102，103，104倍，所对应的电化学发光检测结果如图7所示，可以看出：随着对流PCR扩增产物稀释倍数增加，T/C数值呈逐渐下降的趋势，这表明该发明的闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法具有检测对流PCR扩增产物的潜力。
对不同扩增时间的对流PCR扩增产物进行检测。对流PCR扩增时间分别为35min，30min，25min，20min，15min和10min，获得的扩增产物被稀释100倍，所对应的电化学发光检测结果如图8所示，通过图中T/C数值的变化可以得：一方面，在25min内，随着扩增时间逐渐延长，扩增产物数量呈逐渐增加的趋势，并在25min后基本达到平台期。另一方面，即时扩增时间为10min，且对扩增产物稀释100倍，其对应的电化学发光强度远高于背景值，这表明该发明的闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法对对流PCR具有快速检测的潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法，其特征在于：是基于侧向流基因检测试剂条和/或检测试剂盒；
所述的侧向流基因检测试剂条包括电极和两条亲水通道A和B，电极与两条亲水通道有部分重叠；
所述的亲水通道A和B分布在加样片、结合片、检测片和吸收片上；
所述的电极包括一体化双性电极和一对驱动电极；所述的一体化双性电极包括阴极和并联的至少两个阳极；其中，靠近加样片的一体化双性电极阳极称为质控阳极，靠近吸收片的一体化双性电极阳极称为检测阳极；
所述的检测片与一体化双性电极重叠；其中，与一体化双性电极阳极重叠的称为亲水通道A，另一条亲水通道则为亲水通道B；
所述的检测试剂盒含有所述的侧向流基因检测试剂条。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)设计探针DNA序列
根据靶DNA(T-DNA)序列设计C区捕获探针和信号探针，以及T区的捕获探针和信号探针；
(2)检测试剂条预处理和修饰
在检测试剂条加样片的亲水通道A滴加处理液，并烘干；
在检测试剂条结合片的亲水通道A滴加处理液并烘干，然后滴涂有偶联三联吡啶钌-聚赖氨酸复合物的信号探针，真空干燥；
检测试剂条的检测片经表面活性剂溶液浸泡处理，烘干，将含捕获探针的混合溶液通过划线方式分别在对应的区域修饰固定C区捕获探针和T区捕获探针；
在检测试剂条吸收片的亲水通道A滴加处理液，并烘干；
(3)样品检测
向检测试剂条加样片的亲水通道A滴加待测样品溶液，等待数分钟后，向加样片上的亲水通道A滴加缓冲溶液；同时向亲水通道B上滴加缓冲溶液连通电路，然后将检测试剂条的驱动电极正极和负极与电源相连，施加适当电压以触发电化学发光反应；
电化学发光信号以图片和视频的形式采集，并进一步通过程序分析，实现对病原体核酸的定性和定量检测。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：
所述的C区捕获探针，其5'端修饰生物素；
所述的C区信号探针，其5'端修饰氨基；
所述的T区捕获探针，其3'端修饰生物素；
所述的T区信号探针，其5'端修饰氨基。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：
所述T-DNA的5'端与T区捕获探针的3'端互补；
所述T-DNA的3'端与T区信号探针的5'端互补；
所述C区捕获探针与C区信号探针序列完全互补。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：
所述加样片处理液为含1％SDS、0.5％PVP、0.5％BSA的缓冲液，pH 7.4；
所述结合片处理液为含0.5％明胶、2.5％海藻糖、1％BSA、0.1％Triton X-100、0.1％Proclin300防腐剂的缓冲液，pH 7.4。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：
所述检测片的表面活性剂溶液为含0.5％S9和0.9％NaCl的混合溶液；所述的含捕获探针的混合溶液为5％蔗糖，5％海藻糖，0.5mg/mL链霉亲和素和50μM捕获探针的混合溶液；
所述吸收片处理液为含0.5％吐温的缓冲液。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的侧向流基因检测试剂条，加样检测时，所述一体化双性电极的阳极与对应的驱动电极负极位于报告通道中，所述一体化双性电极的阴极与对应的驱动电极正极位于支持通道中。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的侧向流基因检测试剂条，所述亲水通道A中与质控阳极重叠的部分称为质控区，亲水通道A中与检测阳极重叠的部分称为检测区。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的检测试剂盒还包括上盖、透明盖板和下盖。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述的试剂条固定在下盖上，所述透明盖板覆盖在试剂条的结合片、检测片、电极片和吸收片上；
所述上盖覆盖在透明盖板上。
CN202410421802.3A 2024-04-09 2024-04-09 一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法 Pending CN118240922A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410421802.3A CN118240922A (zh) 2024-04-09 2024-04-09 一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410421802.3A CN118240922A (zh) 2024-04-09 2024-04-09 一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118240922A true CN118240922A (zh) 2024-06-25

Family

ID=91552987

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410421802.3A Pending CN118240922A (zh) 2024-04-09 2024-04-09 一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118240922A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. Electrochemical biosensors based on magnetic micro/nano particles
KR102378388B1 (ko) 개선된 분석 방법
D'Orazio Biosensors in clinical chemistry
US8236154B2 (en) Composite modified electrode strip
EP3132049B1 (en) Device and methods of using device for detection of aminoacidopathies
CN111505275B (zh) 一种基于Cas9核酸等温扩增的免疫层析多重基因检测方法
CA2954115C (en) Ultra-sensitive bioanalyte quantification from self-assembled quadruplex tags
EP0752099A1 (en) Diagnostic flow cell device
MX2011000417A (es) Sensor mejorado para inmunoanalisis.
KR100913148B1 (ko) 자성입자를 포함하는 자기력 기반 바이오 센서
KR100800436B1 (ko) 바이오 센서
WO2016136033A1 (ja) 標的核酸検出法、アッセイキットおよびプローブ固定基体
CN212845415U (zh) 一种用于肿瘤标志物检测的微流控芯片
CN114397343A (zh) 肿瘤标志物活性检测试剂盒、检测方法及其应用
CN116622805A (zh) 一种用于核酸检测的试剂盒
Wang et al. A signal on–off strategy based on the digestion of DNA cubes assisted by the CRISPR–Cas12a system for ultrasensitive HBV detection in solid-state nanopores
CN108841828B (zh) 一种特异性识别妥布霉素的单链dna适配体及其应用
Ma et al. based bipolar electrode electrochemiluminescence sensors for point-of-care testing
CN118240922A (zh) 一种闭合式双极电化学发光侧向流基因检测方法
CN116042914A (zh) 一种基于原位扩增的非洲猪瘟病毒的可抛式电化学传感器的制备方法及其用途
CN112362709B (zh) 一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法
JP4083213B2 (ja) 電気化学的免疫測定チップ
CN219744850U (zh) 一种微流控芯片干式电化学发光检测盒
CN113009134A (zh) 一种用于肿瘤标志物检测的微流控芯片及检测方法
CN116984040A (zh) 一种干式双极电化学发光微流控芯片及其在蛋白与核酸检测中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination