CN112362709B - 一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法 - Google Patents

一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法。所述的微流体生物传感器由微流控底板ITO导电玻璃，微流控芯片，丝网印刷微电极三部分组成，其中，微流控芯片包括电极槽用于安置对电极，参比电极，工作电极，进样口及微通道，出样口及微通道；将ITO导电玻璃进行刻蚀，并依次进行Ag/AgCI浆料丝网印刷和Bi2Ga4O9/AgI纳米材料修饰得到微参比电极和微工作电极的底板；将阴极光电化学三电极集成到微流体生物传感器上，利用泵的控制，可以实现自动检测，无需人为干扰可快速得到准确的检测结果。该阴极光电化学微流体生物传感器可以实现对非小细胞肺癌标志物Cyfra 21‑1的快速、高效、灵敏、自动化检测。

Description

一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生 物传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种阴极光电化学微流体生物传感器，具体的说，设计一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法。
背景技术
肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌约占肺癌总发病率的80％，男性患病率明显高于女性，肺癌病人男女之比约4:1。非小细胞肺癌指的是源于支气管黏膜上皮或肺泡上皮的恶性肿瘤，是一种最常见的肺癌类型，大多数患者年龄都在65岁以上，但近年发病有年轻化倾向。但是早期发现、早期治疗，治愈率可大大提高；因此早期诊断对非小细胞肺癌的预防和治疗具有重要的临床意义。
Cyfra 21-1是非小细胞肺癌最有价值的血清标志物之一，尤其对鳞状细胞癌患者的早期诊断、疗效观察、预后监测有重要意义。目前，对于非小细胞肺癌标志物的检测方法很多，如放射免疫分析法、酶联免疫分析法、电化学发光分析法等，但多数检测方法繁琐，操作复杂，费用昂贵，检出限高，因此，建立一种快速、简便、灵敏的检测方法有重要意义。
本发明构建的阴极光电化学微流体生物传感器是基于微流体传感技术和光电转换来确定待测物浓度的一类检测技术，微流体传感器具有体积小，试剂消耗少，仪器自动化，灵敏度高等优点，近年来，微流体传感器作为一种新型的分析平台具有微型化、自动化、集成化、快速和便携等优点，已经在很多领域获得了广泛的应用，例如分析化学、材料学、细胞生物学等领域。然而，基于微流体的阴极光电化学传感器，通过可见光LED的照射，激发光电材料电子空穴对的分离，通过转化为电信号检测被测物质的浓度，并且阴极光电化学抗还原性物质干扰能力强。本发明将阴极光电化学传感器技术集成到微流控芯片上，实现了对非小细胞肺癌标志物Cyfra 21-1的快速、高效、灵敏的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、快速、低成本、高灵敏的新型微流体阴极光电化学传感器的制备方法，并将其应用于非小细胞肺癌标志物Cyfra 21-1的检测。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）用计算机设计软件AUTOCAD设计和绘制微流控的通道图形；
（2）利用设计的图形绘制掩模，并且用标准的软光刻技术加工微流控聚二甲基硅氧烷PDMS芯片；
（3）将5 cm × 4 cm的ITO导电玻璃，依次用丙酮、乙醇和超纯水分别超声清洗30min，氮气吹干，并将洗净的ITO导电玻璃依次进行刻蚀，Ag/AgCI浆料丝网印刷得到微工作电极1和微参比电极2的底板；
（4）将20 µL、5.0 ~ 10.0 mg/mL的铋镓氧Bi2Ga4O9溶液滴涂在微工作电极上，室温下晾干，继续滴涂15 µL、4.0 ~ 8.0 mg/mL的碘化银AgI溶液，室温下晾干，再继续滴涂8 µL、8.0 ~ 10 mmol/L的巯基乙酸溶液，室温下晾干，滴加10 μL含1×10-2 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺EDC和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液以活化羧基，得到羧基化Bi2Ga4O9/AgI修饰的微工作电极的底板；
（5）将上述步骤（2）中制备的微流控芯片和步骤（4）中Bi2Ga4O9/AgI修饰的微工作电极底板一起进行氧气等离子体处理，然后将微流控芯片与底板键合，即完成微流体芯片制备；
（6）通过进样口5用注射泵以20 ~ 40 µL/min注射20 µg/mL的非小细胞肺癌标志物抗体Ab1，到微流体芯片工作电极槽中Bi2Ga4O9/AgI，4℃冰箱中孵育30 ~ 60 min，并且通过进样口5注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1；
（7）通过进样口6用注射泵以20 ~ 40 µL/min注射质量分数为0.1 ~ 1.0 %的牛血清蛋白BSA溶液到工作电极槽中Bi2Ga4O9/AgI/Ab1，以封闭电极表面上未结合Ab1的非特异性活性位点，4℃冰箱中晾干，并且从进样口6注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA；
（8）通过进样口7用注射泵以20 ~ 40 µL/min注射10 pg/mL ~ 100 ng/mL不同浓度的非小细胞肺癌标志物Cyfra 21-1标准溶液到微工作电极Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA，4℃冰箱中孵育30 ~ 60 min，进样口7注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra21-1；
（9）通过进样口8用注射泵以20 ~ 40 µL/min注射20 µL、1.0 ~ 4.0 mg/mL超氧化物歧化酶负载蜂窝锰氧化物的二抗标记物溶液SODs@hMnO2-Ab2到微工作电极Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1，4℃冰箱中孵育30 ~ 60 min，进样口8注射缓冲溶液进行洗涤，得到修饰完全的Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1/SODs@hMnO2-Ab2阴极光电化学微流体生物传感器，即一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法。
优选地，第（2）步中，所述的微流控图形绘制掩模，其尺寸大小电极槽直径为3000~ 4000 µm，连接三电极微通道宽度为1000 ~ 2000 µm，进样口直径为1000 ~ 1200 µm，进样通道宽度为800 ~ 1000 µm，出样口直径为1400 ~ 1600 µm，出样口通道宽度为1000 ~1200 µm，所述微流控通道的进样口和出样口均具有弧度设计，保证液体流畅通过。所述微流控通道的进样口和出样口均具有弧度设计，保证液体流畅通过。
优选地，第（3）步中，ITO导电玻璃是工作电极，同时也是微流控芯片的底板。
优选地，第（5）步中，等离子体处理时间为40s ~ 60s，且最后键合的微流控芯片放入烘箱80 ℃下加热10分钟，使芯片间的键合更加牢固。
本发明的有益成果
(1) 本发明制备的阴极光电化学微流体生物传感器可以克服传统光电化学传感器电解质需求量大、重复性差、使用寿命短等缺点，能定量的进行小分子、蛋白质的光电化学检测，具有广阔的应用前景。
(2) 本发明制备的阴极光电化学微流体生物传感器抗还原性物质干扰能力强，具有检测灵敏度高和检出限低等优点。
(3) 本发明制备的微流体生物传感器同时将微工作电极、微参比电极和对电极三电极体系在微流控传感器上集成化、缩小化，利用泵的控制，可以实现传感器的自动检测，无需人为干扰即可快速得到准确的检测结果。
(4) 本发明采用自组装的LED作为激发光源，实现对非小细胞肺癌标志物Cyfra21-1的灵敏检测，该发明为在微流控芯片上实现阴极光电化学传感器提供了重要的基础和技术突破。
附图说明
图1是本发明提供的阴极微流体传感器的示意图；
附图标记说明
1 微工作电极；2微参比电极槽；3 对电极槽；4 出样口及微通道；5 非小细胞肺癌标志物抗体Ab1进样口及微通道；6 牛血清蛋白BSA进样口及微通道；7 Cyfra 21-1标准溶液进样口及微通道；8 超氧化物歧化酶负载蜂窝锰氧化物的二抗标记物溶液进样口及微通道；9 Tris-HCI溶液进样口及微通道。
具体实施方式
实施例1
一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法，制备步骤如下：
（1）用计算机设计软件AUTOCAD设计和绘制微流控的通道图形；
（2）利用设计的图形绘制掩模，并且用标准的软光刻技术加工微流控聚二甲基硅氧烷PDMS芯片；
（3）将5 cm × 4 cm的ITO导电玻璃，依次用丙酮、乙醇和超纯水分别超声清洗30min，氮气吹干，并将洗净的ITO导电玻璃依次进行刻蚀，Ag/AgCI浆料丝网印刷得到微工作电极1和微参比电极2的底板；
（4）将20 µL、6.0 mg/mL的铋镓氧Bi2Ga4O9溶液滴涂在微工作电极上，室温下晾干，继续滴涂15 µL、5.0 mg/mL的碘化银AgI溶液，室温下晾干，再继续滴涂8 µL、8.0 mmol/L的巯基乙酸溶液，室温下晾干，滴加10 μL 含 1×10-2 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺EDC和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液以活化羧基，得到羧基化Bi2Ga4O9/AgI修饰的微工作电极的底板；
（5）将上述步骤（2）中制备的微流控芯片和步骤（4）中Bi2Ga4O9/AgI修饰的微工作电极底板一起进行氧气等离子体处理，然后将微流控芯片与底板键合，即完成微流体芯片制备；
（6）通过进样口5用注射泵以20 µL/min注射20 µg/mL的非小细胞肺癌标志物抗体Ab1，到微流体芯片工作电极槽中Bi2Ga4O9/AgI，4℃冰箱中孵育40 min，并且通过进样口5注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1；
（7）通过进样口6用注射泵以20 µL/min注射质量分数为0.5 %的牛血清蛋白BSA溶液到工作电极槽中Bi2Ga4O9/AgI/Ab1，以封闭电极表面上未结合Ab1的非特异性活性位点，4℃冰箱中晾干，并且从进样口6注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA；
（8）通过进样口7用注射泵以20 µL/min注射10 pg/mL ~ 100 ng/mL不同浓度的非小细胞肺癌标志物Cyfra 21-1标准溶液到微工作电极Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA，4℃冰箱中孵育40 min，进样口7注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1；
（9）通过进样口8用注射泵以20 µL/min注射20 µL、2.0 mg/mL超氧化物歧化酶负载蜂窝锰氧化物的二抗标记物溶液SODs@hMnO2-Ab2到微工作电极Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1，4℃冰箱中孵育40 min，进样口8注射缓冲溶液进行洗涤，得到修饰完全的Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1/SODs@hMnO2-Ab2阴极光电化学微流体生物传感器，即一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法。
实施例2
一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法，制备步骤如下：
（1）用计算机设计软件AUTOCAD设计和绘制微流控的通道图形；
（2）利用设计的图形绘制掩模，并且用标准的软光刻技术加工微流控聚二甲基硅氧烷PDMS芯片；
（3）将5 cm × 4 cm的ITO导电玻璃，依次用丙酮、乙醇和超纯水分别超声清洗30min，氮气吹干，并将洗净的ITO导电玻璃依次进行刻蚀，Ag/AgCI浆料丝网印刷得到微工作电极1和微参比电极2的底板；
（4）将20 µL、8.0 mg/mL的铋镓氧Bi2Ga4O9溶液滴涂在微工作电极上，室温下晾干，继续滴涂15 µL、6.0 mg/mL的碘化银AgI溶液，室温下晾干，再继续滴涂8 µL、9.0 mmol/L的巯基乙酸溶液，室温下晾干，滴加10 μL含1×10-2 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺EDC和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液以活化羧基，得到羧基化Bi2Ga4O9/AgI修饰的微工作电极的底板；
（5）将上述步骤（2）中制备的微流控芯片和步骤（4）中Bi2Ga4O9/AgI修饰的微工作电极底板一起进行氧气等离子体处理，然后将微流控芯片与底板键合，即完成微流体芯片制备；
（6）通过进样口5用注射泵以30 µL/min注射20 µg/mL的非小细胞肺癌标志物抗体Ab1，到微流体芯片工作电极槽中Bi2Ga4O9/AgI，4℃冰箱中孵育50 min，并且通过进样口5注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1；
（7）通过进样口6用注射泵以30 µL/min注射质量分数为0.8 %的牛血清蛋白BSA溶液到工作电极槽中Bi2Ga4O9/AgI/Ab1，以封闭电极表面上未结合Ab1的非特异性活性位点，4℃冰箱中晾干，并且从进样口6注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA；
（8）通过进样口7用注射泵以30 µL/min注射10 pg/mL ~ 100 ng/mL不同浓度的非小细胞肺癌标志物Cyfra 21-1标准溶液到微工作电极Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA，4℃冰箱中孵育50 min，进样口7注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1；
（9）通过进样口8用注射泵以30 µL/min注射20 µL、3.0 mg/mL超氧化物歧化酶负载蜂窝锰氧化物的二抗标记物溶液SODs@hMnO2-Ab2到微工作电极Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1，4℃冰箱中孵育50 min，进样口8注射缓冲溶液进行洗涤，得到修饰完全的Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1/SODs@hMnO2-Ab2阴极光电化学微流体生物传感器，即一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法。
实施例3
一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法，制备步骤如下：
（1）用计算机设计软件AUTOCAD设计和绘制微流控的通道图形；
（2）利用设计的图形绘制掩模，并且用标准的软光刻技术加工微流控聚二甲基硅氧烷PDMS芯片；
（3）将5 cm × 4 cm的ITO导电玻璃，依次用丙酮、乙醇和超纯水分别超声清洗30min，氮气吹干，并将洗净的ITO导电玻璃依次进行刻蚀，Ag/AgCI浆料丝网印刷得到微工作电极1和微参比电极2的底板；
（4）将20 µL、10.0 mg/mL的铋镓氧Bi2Ga4O9溶液滴涂在微工作电极上，室温下晾干，继续滴涂15 µL、8.0 mg/mL的碘化银AgI溶液，室温下晾干，再继续滴涂8 µL、10 mmol/L的巯基乙酸溶液，室温下晾干，滴加10 μL含1×10-2 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺EDC和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液以活化羧基，得到羧基化Bi2Ga4O9/AgI修饰的微工作电极的底板；
（5）将上述步骤（2）中制备的微流控芯片和步骤（4）中Bi2Ga4O9/AgI修饰的微工作电极底板一起进行氧气等离子体处理，然后将微流控芯片与底板键合，即完成微流体芯片制备；
（6）通过进样口5用注射泵以40 µL/min注射20 µg/mL的非小细胞肺癌标志物抗体Ab1，到微流体芯片工作电极槽中Bi2Ga4O9/AgI，4℃冰箱中孵育60 min，并且通过进样口5注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1；
（7）通过进样口6用注射泵以40 µL/min注射质量分数为1.0 %的牛血清蛋白BSA溶液到工作电极槽中Bi2Ga4O9/AgI/Ab1，以封闭电极表面上未结合Ab1的非特异性活性位点，4℃冰箱中晾干，并且从进样口6注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA；
（8）通过进样口7用注射泵以40 µL/min注射10 pg/mL ~ 100 ng/mL不同浓度的非小细胞肺癌标志物Cyfra 21-1标准溶液到微工作电极Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA，4℃冰箱中孵育60 min，进样口7注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1；
（9）通过进样口8用注射泵以40 µL/min注射20 µL、4.0 mg/mL超氧化物歧化酶负载蜂窝锰氧化物的二抗标记物溶液SODs@hMnO2-Ab2到微工作电极Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1，4℃冰箱中孵育30 ~ 60 min，进样口8注射缓冲溶液进行洗涤，得到修饰完全的Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1/SODs@hMnO2-Ab2阴极光电化学微流体生物传感器，即一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法。
实施例4
所述微流控微通道尺寸大小电极槽直径为3000 µm，连接三电极微通道宽度为1000 µm，进样口直径为1000 µm，进样通道宽度为800 µm，出样口直径为1400 µm，出样口通道宽度为1000 µm，所述微流控通道的进样口和出样口均具有弧度设计，保证液体流畅通过。
实施例5
所述微流控微通道尺寸大小电极槽直径为3500 µm，连接三电极微通道宽度为1500 µm，进样口直径为1100 µm，进样通道宽度为900 µm，出样口直径为1500 µm，出样口通道宽度为1100 µm，所述微流控通道的进样口和出样口均具有弧度设计，保证液体流畅通过。
实施例6
所述微流控微通道尺寸大小电极槽直径为4000 µm，连接三电极微通道宽度为2000 µm，进样口直径为1200 µm，进样通道宽度为1000 µm，出样口直径为1600 µm，出样口通道宽度为1200 µm，所述微流控通道的进样口和出样口均具有弧度设计，保证液体流畅通过。
实施例7
所述的阴极光电化学微流体生物传感器用于非小细胞肺癌标志物的检测的步骤如下：
(1) 使用电化学工作站以三电极体系进行测试，将对电极插入电极槽3，将pH=7.4含0.1 mol/L的Tris-HCI溶液通过进样口9注入，并且充满电极槽，在LED灯照射下进行测试；
(2) 用时间-电流法对Cyfra 21-1进行检测，设置电压为0 V，运行时间200 s；
(3) 当背景电流趋于稳定后，每隔15 s开灯持续照射15 s，然后记录光电流变化，绘制工作曲线；
(4) 用血清样品溶液代替Cyfra 21-1标准溶液，检测结果通过工作曲线查得。
实施例8
所述的阴极光电化学微流体生物传感器用于非小细胞肺癌标志物的检测的步骤如下：
(1) 使用电化学工作站以三电极体系进行测试，将对电极插入电极槽3，将pH=7.4含0.1 mol/L的Tris-HCI溶液通过进样口9注入，并且充满电极槽，在LED灯照射下进行测试；
(2) 用时间-电流法对Cyfra 21-1进行检测，设置电压为0 V，运行时间200 s；
(3) 当背景电流趋于稳定后，每隔20 s开灯持续照射20 s，然后记录光电流变化，绘制工作曲线；
(4) 用血清样品溶液代替Cyfra 21-1标准溶液，检测结果通过工作曲线查得。
实施例9
所述的阴极光电化学微流体生物传感器用于非小细胞肺癌标志物的检测的步骤如下：
(1) 使用电化学工作站以三电极体系进行测试，将对电极插入电极槽3，将pH=7.4含0.1 mol/L的Tris-HCI溶液通过进样口9注入，并且充满电极槽，在LED灯照射下进行测试；
(2) 用时间-电流法对Cyfra 21-1进行检测，设置电压为0 V，运行时间200 s；
(3) 当背景电流趋于稳定后，每隔25 s开灯持续照射25 s，然后记录光电流变化，绘制工作曲线；
(4) 用血清样品溶液代替Cyfra 21-1标准溶液，检测结果通过工作曲线查得。
实施例10实施例1~3所述阴极光电化学微流体生物传感器对非小细胞肺癌标志物Cyfra 21-1的检测范围为10 pg/mL~100 ng/mL，检测限为2.6 pg/mL；可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。

Claims (5)

1.一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法，其特征在于，所述阴极光电化学微流体生物传感器的制备步骤如下：
（1）用计算机设计软件AUTOCAD设计和绘制微流控的通道图形；
（2）利用设计的图形绘制掩模，并且用标准的软光刻技术加工微流控聚二甲基硅氧烷PDMS芯片；
（3）将5 cm × 4 cm的ITO导电玻璃，依次用丙酮、乙醇和超纯水分别超声清洗30 min，氮气吹干，并将洗净的ITO导电玻璃依次进行刻蚀，Ag/AgCI浆料丝网印刷得到微工作电极1和微参比电极2的底板；
（4）将20 µL、5.0 ~ 10.0 mg/mL的铋镓氧Bi2Ga4O9溶液滴涂在微工作电极上，室温下晾干，继续滴涂15 µL、4.0 ~ 8.0 mg/mL的碘化银AgI溶液，室温下晾干，再继续滴涂8 µL、8.0~ 10 mmol/L的巯基乙酸溶液，室温下晾干，滴加10 μL含1×10-2 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺EDC和2×10-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合溶液以活化羧基，得到羧基化Bi2Ga4O9/AgI修饰的微工作电极的底板；
（5）将上述步骤（2）中制备的微流控芯片和步骤（4）中Bi2Ga4O9/AgI修饰的微工作电极底板一起进行氧气等离子体处理，然后将微流控芯片与底板键合，即完成微流体芯片制备；
（6）通过进样口5用注射泵以20 ~ 40 µL/min注射20 µg/mL的非小细胞肺癌标志物抗体Ab1，到微流体芯片工作电极槽中Bi2Ga4O9/AgI，4℃冰箱中孵育30 ~ 60 min，并且通过进样口5注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1；
（7）通过进样口6用注射泵以20 ~ 40 µL/min注射质量分数为0.1 ~ 1.0 %的牛血清蛋白BSA溶液到工作电极槽中Bi2Ga4O9/AgI/Ab1，以封闭电极表面上未结合Ab1的非特异性活性位点，4℃冰箱中晾干，并且从进样口6注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA；
（8）通过进样口7用注射泵以20 ~ 40 µL/min注射10 pg/mL ~ 100 ng/mL不同浓度的非小细胞肺癌标志物Cyfra 21-1标准溶液到微工作电极Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA，4℃冰箱中孵育30 ~ 60 min，进样口7注射缓冲溶液进行洗涤，得到Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1；
（9）通过进样口8用注射泵以20 ~ 40 µL/min注射20 µL、1.0 ~ 4.0 mg/mL超氧化物歧化酶负载蜂窝锰氧化物的二抗标记物溶液SODs@hMnO2-Ab2到微工作电极Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1，4℃冰箱中孵育30 ~ 60 min，进样口8注射缓冲溶液进行洗涤，得到修饰完全的Bi2Ga4O9/AgI/Ab1/BSA/Cyfra 21-1/SODs@hMnO2-Ab2阴极光电化学微流体生物传感器，即一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法。
2.如权利要求1所述的一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法，其特征在于，所述微流控微通道尺寸大小电极槽直径为3000 ~ 4000 µm，连接三电极微通道宽度为1000 ~ 2000 µm，进样口直径为1000 ~ 1200 µm，进样通道宽度为800 ~ 1000 µm，出样口直径为1400 ~ 1600 µm，出样口通道宽度为1000 ~ 1200 µm，所述微流控通道的进样口和出样口均具有弧度设计，保证液体流畅通过。
3.如权利要求1所述的一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法，其特征在于，所述阴极光电化学的三电极集成于小型微流控传感器上。
4.如权利要求1所述的一种用于非小细胞肺癌标志物检测的阴极光电化学微流体生物传感器的制备方法，其特征在于，所述非小细胞肺癌标志物为细胞角蛋白19片段21-1Cyfra21-1。
5.如权利要求4所述的制备方法得到阴极光电化学微流体生物传感器用于非小细胞肺癌标志物的检测，其特征在于，所述检测的具体步骤如下：
(1) 使用电化学工作站以三电极体系进行测试，将对电极插入电极槽3，将pH=7.4含0.1 mol/L的Tris-HCI溶液通过进样口9注入，并且充满电极槽，在LED灯照射下进行测试；
(2) 用时间-电流法对Cyfra 21-1进行检测，设置电压为0 V，运行时间200 s；
(3) 当背景电流趋于稳定后，每隔15 ~ 25 s开灯持续照射15 ~ 25 s，然后记录光电流变化，绘制工作曲线；
(4) 用血清样品溶液代替Cyfra 21-1标准溶液，检测结果通过工作曲线查得。
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