JP4083213B2 - 電気化学的免疫測定チップ - Google Patents
電気化学的免疫測定チップ Download PDFInfo
- Publication number
- JP4083213B2 JP4083213B2 JP2007535937A JP2007535937A JP4083213B2 JP 4083213 B2 JP4083213 B2 JP 4083213B2 JP 2007535937 A JP2007535937 A JP 2007535937A JP 2007535937 A JP2007535937 A JP 2007535937A JP 4083213 B2 JP4083213 B2 JP 4083213B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chip
- solution
- reaction
- malate
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 title claims description 11
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims description 36
- -1 potassium ferricyanide Chemical compound 0.000 claims description 25
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 22
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 17
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 17
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 10
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims description 8
- WPUMTJGUQUYPIV-JIZZDEOASA-L disodium (S)-malate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](O)CC([O-])=O WPUMTJGUQUYPIV-JIZZDEOASA-L 0.000 claims description 6
- 235000019265 sodium DL-malate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000001394 sodium malate Substances 0.000 claims description 6
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 2
- 239000001415 potassium malate Substances 0.000 claims description 2
- SVICABYXKQIXBM-UHFFFAOYSA-L potassium malate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O SVICABYXKQIXBM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 235000011033 potassium malate Nutrition 0.000 claims description 2
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 71
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 58
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 50
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 33
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 25
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 23
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 19
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 16
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 13
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 13
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 6
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 6
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 description 5
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 4
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 4
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(6+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+6].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007650 screen-printing Methods 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-L NADH(2-) Chemical group C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-L 0.000 description 1
- 239000004642 Polyimide Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920001721 polyimide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
Description
本発明は、免疫測定法を用いて、標的物質の量を電気化学的に測定するチップに関する。
免疫測定法は、抗原と抗体の結合性、すなわち抗原抗体反応、を利用することにより、標的物質の量を測定する方法である。抗原抗体反応は、これまでに知られている生物現象の中で最も種類が多く、かつ標的物質の識別性が最も高い。このため、免疫測定法は、膨大な種類の生体分子が混在する生体試料に含有された標的物質の量を、当該標的物質の単離精製作業を必要とせずに、生体試料から直接測定できる方法として注目されている。
図１は、免疫測定法の一例について説明するための工程図である。この例では、まず、標的物質４を含む試料溶液５を、抗体２が固定された槽１内に添加する（Ａ１）。抗体２は、標的物質４に対する抗原結合部位を有している。このため、当該添加により、標的物質４と抗体２との間で抗原抗体反応が進行する。次に、バッファー溶液などを用いて槽１内を洗浄する（Ａ２）。これにより、試料溶液に含有され得る夾雑物質３が、槽１内から除去される。その後、第２の抗体７を槽１内に添加する（Ａ３）。第２の抗体７は、抗体２とは異なる抗原結合部位を含む。このため、当該添加により、抗体２に結合した状態にある標的物質４と第２の抗体７との間で、抗原抗体反応が進行する。第２の抗体７は、蛍光物質、放射性物質、酵素などの公知の標識体６により標識された状態にある。続いて、再度、バッファー溶液などを用いて槽１内を洗浄する（Ａ４）。これにより、標的物質４に結合していない第２の抗体７が、槽１内から除去される。その後、槽１内に残存した、抗体２、標識物質４および第２の抗体７の複合体の量、より具体的には当該複合体における第２の抗体７を標識した状態にある標識体６の量、を測定することにより、標的物質４の量を算出する（Ａ５）。
図２は、免疫測定法の別例について説明するための工程図である。この例では、標的物質４ａを含む試料溶液とともに、標識化標的物質を所定濃度で含有するように調製された溶液を、槽１内に添加する（Ｂ１）。標識化標的物質は、標的物質４ａと共通する抗原部位を有し、標識体６によって標識された状態にある、擬似的な標的物質４ｂである。当該添加により、槽１内において、抗体２、標的物質４ａおよび標識化標的物質の三者間で競合的な抗原抗体反応が進行する。次に、バッファー溶液などを用いて槽１内を洗浄する（Ｂ２）。これにより、試料溶液に含有され得る夾雑物質３および未反応の標識化標的物質などが、槽１内から除去される。その後、槽１内に残存した、抗体２および標識化標的物質の複合体の量、より具体的には当該複合体における標識化標的物質を標識した状態にある標識体６の量、を測定し、標識化標的物質の添加量に基づいて、標的物質４ａの量を算出する（Ｂ３）。
免疫測定法には、上述の二例以外にも様々なパタンが存在する。しかし、いずれのパタンにおいても、試料溶液中の標的物質の量は、当該量を反映した標識体の量に基づいて算出される。標識体の量を測定する方法としては、光学的な測定手段を用いる方法があるが、光源および輝度検出器を必要とするため、測定装置を小型化および低コスト化することが難しい。
測定装置を小型化および低コスト化するとともに、測定を、安全かつ容易に、また、高い精度で実施する観点から、電気化学的な測定手段を用いる方法が注目されている。例えば、特開平２−０６２９５２号公報および特開平９−２９７１２１号公報は、アルカリホスファターゼを標識体とし、ヘキサシアノ鉄（III）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）を電子伝達体として用いる酵素サイクリング反応系を利用して、試料中の標的物質の量を電気化学的に測定するバイオセンサを開示する。
図３は、特開平２−０６２９５２号公報および特開平９−２９７１２１号公報に記載のバイオセンサにおいて利用される、酵素サイクリング反応系について説明するための図である。この酵素サイクリング反応系は、アルカリホスファターゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（ＮＡＤＰ）、エタノール、アルコール脱水素酵素、ジアホラーゼ、およびジアホラーゼの基質となるフェリシアン化カリウムを含有する反応溶液において誘導される、第１〜第３の反応によって構成されている。第１の反応は、ＮＡＤＰが、アルカリホスファターゼにより脱リン酸化され、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（ＮＡＤ）へと変換される反応である。第２の反応は、第１の反応によって生成したＮＡＤが、エタノールとともに、アルコール脱水素酵素の触媒作用による酸化還元反応を受けて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）へと還元される反応である。第３の反応は、第２の反応によって生成したＮＡＤＨが、ジアホラーゼの触媒作用によってフェリシアン化カリウムと反応し、ＮＡＤへと酸化されるとともに、フェリシアン化カリウムがヘキサシアノ鉄（II）酸カリウム（フェロシアン化カリウム）へと変換される反応である。なお、ＮＡＤＰは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）であってもよい。フェロシアン化カリウムは、反応溶液中に電圧を印加することにより、フェリシアン化カリウムに変換される。反応溶液中のアルカリホスファターゼの量は、上記の第１〜３の反応を経ることにより、第３の反応において生成したフェロシアン化カリウムの量に反映される。これにより、フェロシアン化カリウムからフェリシアン化カリウムへの変換に伴って生じる酸化電流量を測定することで、アルカリホスファターゼの量を測定できる。
バイオセンサをチップ化するためには、酵素サイクリング反応に必要な試薬をチップ内に長期的に保持させることが重要である。アルコール脱水素酵素を利用する酵素サイクリング反応系では、上記のとおりエタノールを用いる必要がある。エタノールは、高い揮発性を有するために、チップ内に長期的に保持させることが難しい。このため、アルコール脱水素酵素を含む酵素サイクリング反応系を利用して、バイオセンサをチップ化することは容易ではない。
本発明者は、これまでに、揮発性の高い試薬を必要としない新規な酵素サイクリング反応系の確立を進めてきた。図４は、この新規な酵素サイクリング反応系について説明するための図である。基本的な反応メカニズムは図３に示す酵素サイクリング反応系と同様であるが、本発明者が提案する酵素サイクリング反応系は、図４に示すように、アルコール脱水素酵素に代えてリンゴ酸脱水素酵素を、また、エタノールに代えてリンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種を用いる。この酵素サイクリング反応系は、エタノールのような揮発性の高い試薬を含まない。
図４に示す新規な酵素サイクリング反応系は、脂質修飾酵素が関与しない反応系である。従来、基質を含有しない試料液に対する酸化電流値（ブランク値）の発生を抑制する側面から、脂質修飾酵素が関与しない酵素サイクリング反応系を利用する場合、酵素および電子伝達体を完全に分離した状態でチップ内に保持させることが望ましいと考えられていた（例えば、特開２００５−０４６００１号公報）。
ところが、本発明者が検討したところ、図４に示す新規な酵素サイクリング反応系を利用する場合、後述する比較例に示すように、酵素および電子伝達体を完全に分離した状態でチップに保持させることによっては、ブランク値の発生は抑制できるものの、チップの測定精度を実用に十分な程度にまで向上することはできない。
本発明者は、図４に示す反応系に関与する試薬群を、一部の電子伝達体（フェリシアン化カリウム）のみを酵素から分離した状態でチップに保持させ、他の一部の電子伝達体（ＮＡＤＰまたはＮＡＤＰＨ）を酵素と同一の場所に固定することによって、ブランク値の発生を抑制できるとともに、チップの測定精度を実用に十分な程度にまで向上できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、免疫測定法を用いて電気化学的に標的物質の量を測定するチップであって、前記チップは、作用極および対極からなる電極、または作用極、対極、および参照極からなる電極を有し、該チップ内に、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも１種、リンゴ酸脱水素酵素、該リンゴ酸脱水素酵素の基質、フェリシアン化カリウムならびにジアホラーゼが固定され、前記リンゴ酸脱水素酵素と、前記ＮＡＤＰおよび前記ＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも１種と、前記基質とが混合された状態で同一の場所に固定され、前記リンゴ酸脱水素酵素と、前記フェリシアン化カリウムとが離間した状態で固定されたチップを提供する。
本発明によれば、揮発性の高い試薬を必要とせずに、高精度な免疫学的測定を実施できるチップを提供できる。
図５および図６は、図４に示す酵素サイクリング反応系を利用して試料溶液中の標的物質の量を測定するチップの一例について説明するための図である。
チップ１００は、図５に示すように、試料溶液をチップ内に導入するための試料導入口８、試料溶液中の標的物質の量を反映した量のアルカリホスファターゼ標識化物質を含む溶液を得るための反応槽９、試薬固定槽１０、および定電位測定が可能な電極が保持された電極槽１３を有している。試薬固定槽１０と電極槽１３は流路１４ａにより連通されている。反応層９と試薬固定槽１０は流路１４ｂにより連通されている。試料導入口８と反応層９は流路１４ｃにより連通されている。チップ２００は、図６に示すように、試料導入口８、試薬固定槽１０および電極槽１３を有している。試薬固定槽１０と電極槽１３は流路１４ａにより、また、試料導入口８と試薬固定槽１０は流路１４ｄにより連通されている。これらの槽や流路などは、チップ基板２０上に形成されている。チップ基板の材料としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が例示できる。チップ基板の材料は、ポリカーボネート、ポリイミドおよびポリプロピレンなどに代表される、ＰＥＴ以外の樹脂材料であっても、また、ガラスであっても構わない。
試薬固定槽１０には、フェリシアン化カリウム１１と、試薬混合物１２とが、離間した状態で、かつ乾燥した状態で、固定されている。試薬混合物１２は、リンゴ酸脱水素酵素、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも１種、ならびにリンゴ酸脱水素酵素の基質を含有する。試薬固定槽１０には、ジアホラーゼも乾燥状態で固定されている。なお、本明細書において試薬がチップ内に固定されている状態とは、チップに多少の衝撃が加わっても、所定の位置からずれない程度の強固さで試薬がチップ内に保持されている状態をいう。こうした状態にある試薬は、試料溶液に対して容易に溶解する状態にある。リンゴ酸脱水素酵素の基質としては、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種が例示できる。リンゴ酸塩としては、リンゴ酸ナトリウムおよびリンゴ酸カリウムから選ばれる少なくとも１種を例示できる。このように、本発明のチップ１００、２００は、チップ基板２０と、チップ基板２０上に固定されたフェリシアン化カリウム１１および試薬混合物１２とを有し、フェリシアン化カリウム１１と試薬混合物１２とが、互いに離間した状態にある。チップ１００、２００は、さらに、試薬混合物１２の一部として、または別の成分として、チップ基板２０上に固定されたジアホラーゼを有する。
チップ１００では、試料導入口８から導入された試料溶液が、流路１４ｃを通じて反応槽９に送られる。反応槽９では、試料溶液中の標的物質の量を反映する、アルカリホスファターゼ標識された物質を含有する溶液が調製される。その後、当該溶液は、流路１４ｂを通じて試薬固定槽１０に送られる。当該溶液を得るための反応は、図１および２の工程図に代表されるように種々のパタンが存在する。このため、反応槽９は、反応のパタンに応じ、槽ならびに流路の数および配置パタンを適宜調整してよい。
チップ２００では、試料溶液中の標的物質の量を反映する、アルカリホスファターゼ標識された物質を含有する溶液を、流路１４ｄを通じて試料導入口８から試薬固定槽１０に導入する。当該溶液は、チップの使用者が、チップ内に導入する前に調製する。
チップ１００および２００のいずれにおいても、アルカリホスファターゼ標識された物質を含有する溶液が試薬固定槽１０に導入されると、当該溶液に、上記のフェリシアン化カリウムからジアホラーゼまでの試薬群が溶解する。これにより、試薬固定槽１０において、当該試薬群と、溶液中のアルカリホスファターゼとの間で、図４に示すサイクリング反応が進行する。サイクリング反応後の溶液は、流路１４ａを通じて電極槽１３に送られる。電極槽１３では、当該電極槽１３に導入された溶液に電圧が印加される。これにより、サイクリング反応によって得られたフェロシアン化カリウムがフェリシアン化カリウムに変換されるとともに、当該変換の際に流れる電流値が測定される（定電位測定）。そして、上記のとおり、定電位測定により得た電流値に基づいて、試料溶液中の標的物質の量が算出される。
図４に示す反応系に関与する試薬は、試薬固定槽１０に代えて、流路１４ａ、１４ｂ、１４ｄや電極槽１３において、試料溶液に溶解可能な状態で固定されていてもよい。電極槽１３における電極の構成は、作用極および対極からなる二極式としてもよいし、作用極、対極および参照極からなる三極式としてもよい。各槽間の送液は、例えば遠心力を利用することにより行ってもよいし、また例えばポンプなどを利用して流路内に圧力をかけることにより行ってもよい。
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
図７に示すチップ３００を用意した。チップ３００は、ＰＥＴにより構成されたチップ基板１５、チップ基板１５上に配置された対極および測定極からなる電極系１６、ならびにチップ基板１５上に配置された絶縁層１７を備える。電極系１６は、例えば、公知の導電性カーボンペーストを所定のパタンでチップ基板１５上にスクリーン印刷した後、加熱し、乾燥させることにより形成すればよい。絶縁層１７は、例えば、公知の絶縁性ペーストを、電極系１６の一部が露出した状態にある電極露出部位１９が形成され、また、チップ外から電極系１６に電圧を印加できる状態で電極系１６の他の一部が露出するように、チップ基板１５上にスクリーン印刷した後、加熱し、乾燥することにより形成すればよい。絶縁層１７の表面の一部の領域は、図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬群を乾燥状態で固定させる試薬固定部位１８として使用した。
（比較例１）
１Ｍのフェリシアン化カリウム溶液（１μＬ）、１０００Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ溶液（６．７μＬ）、４Ｍのリンゴ酸ナトリウム溶液（７．８μＬ）、５ｍＭのＮＡＤＰ溶液（１μＬ）、２５０００Ｕ／ｍＬのリンゴ酸脱水素酵素溶液（１μＬ）、および１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（５μＬ、ｐＨ９）を混合することにより、混合溶液を調製した。この混合溶液（２２．５μＬ）を、チップ３００の試薬固定部位１８上に配置した後、常温（２５℃）で３時間、真空乾燥させた。これにより、図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬群を、全て混合した状態で試薬固定部位１８上に乾燥固定した。
１Ｍのフェリシアン化カリウム溶液（１μＬ）、１０００Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ溶液（６．７μＬ）、４Ｍのリンゴ酸ナトリウム溶液（７．８μＬ）、５ｍＭのＮＡＤＰ溶液（１μＬ）、２５０００Ｕ／ｍＬのリンゴ酸脱水素酵素溶液（１μＬ）、および１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（５μＬ、ｐＨ９）を混合することにより、混合溶液を調製した。この混合溶液（２２．５μＬ）を、チップ３００の試薬固定部位１８上に配置した後、常温（２５℃）で３時間、真空乾燥させた。これにより、図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬群を、全て混合した状態で試薬固定部位１８上に乾燥固定した。
続いて、アルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体溶液（１００μＬ）を、試薬固定部位１８上に乾燥固定されている試薬群に添加し、当該溶液に試薬群を溶解させることにより、反応溶液を調製した。反応溶液は、アルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体の濃度が、０Ｍ、０．０８３ｎＭ、０．４１５ｎＭ、０．８３０ｎＭとなるように複数種を調製した。
反応溶液を３０℃で１０分間インキュベートした後、チップ３００の電極露出部位１９に移動させ、４００ｍＶの定電圧を反応溶液に印加する定電位測定を実施した。
図８は、比較例１における、反応溶液中のアルカリホスファターゼ標識ＣＲＰ抗体濃度（ＡＬＰ−Ａｂ濃度）と、電圧印加直後にそれぞれの反応溶液において流れた電流値との関係を示すグラフである。図８に示すように、定電位測定により検出された電流値は、ばらつきが大きく、また、ＡＬＰ−Ａｂ濃度との間の相関が非常に乏しかった。このように、比較例１のチップを使用して、標的物質の量を高精度に測定することは難しい。
（比較例２）
図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬群を、電子伝達体（フェリシアン化カリウムおよびＮＡＤＰ）と、酵素（リンゴ酸脱水素酵素およびジアホラーゼ）とを分離した状態で試薬固定部位１８上に乾燥固定したチップ３００を用いたこと以外は、比較例１と同様にして定電位測定を実施した。
図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬群を、電子伝達体（フェリシアン化カリウムおよびＮＡＤＰ）と、酵素（リンゴ酸脱水素酵素およびジアホラーゼ）とを分離した状態で試薬固定部位１８上に乾燥固定したチップ３００を用いたこと以外は、比較例１と同様にして定電位測定を実施した。
試薬群は、次のようにして乾燥固定した。１０００Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ溶液（６．７μＬ）、４Ｍのリンゴ酸ナトリウム溶液（７．８μＬ）、２５０００Ｕ／ｍＬのリンゴ酸脱水素酵素溶液（１μＬ）、および１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（５μＬ、ｐＨ９）を混合することにより、混合溶液を調製した。また、１Ｍのフェリシアン化カリウム溶液（１μＬ）、および５ｍＭのＮＡＤＰ溶液（１μＬ）を用意した。これらの混合溶液（２０．５μＬ）、フェリシアン化カリウム溶液（１μＬ）、およびＮＡＤＰ溶液（１μＬ）を、それぞれ試薬固定部位１８上の異なる領域に配置した後、常温で３時間、真空乾燥させた。
図９は、比較例２における、反応溶液中のＡＬＰ−Ａｂ濃度と、電圧印加直後にそれぞれの反応溶液において流れた電流値との関係を示すグラフである。図９に示すように、定電位測定により検出された電流値は、比較例１と比べてブランク値が抑制された状態にあったが、ばらつきが大きかった。また、当該電流値のプロットに対する近似線の傾き（検量線の傾き）は、比較例１と比べてさらに小さかった。このように、比較例２のチップを使用して、標的物質の量を高精度に測定することは難しい。
（実施例１）
図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬群を、電子伝達体のうちフェリシアン化カリウムのみを酵素およびその基質から分離した状態で、試薬固定部位１８上に乾燥固定したチップ３００を用いたこと以外は、比較例２と同様にして定電位測定を実施した。
図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬群を、電子伝達体のうちフェリシアン化カリウムのみを酵素およびその基質から分離した状態で、試薬固定部位１８上に乾燥固定したチップ３００を用いたこと以外は、比較例２と同様にして定電位測定を実施した。
試薬群は、次のようにして乾燥固定した。１０００Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ溶液（６．７μＬ）、４Ｍのリンゴ酸ナトリウム溶液（７．８μＬ）、５ｍＭのＮＡＤＰ溶液（１μＬ）、２５０００Ｕ／ｍＬのリンゴ酸脱水素酵素溶液（１μＬ）、および１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（５μＬ、ｐＨ９）を混合することにより、混合溶液を調製した。また、１Ｍのフェリシアン化カリウム溶液（１μＬ）を用意した。これらの混合溶液（２１．５μＬ）、およびフェリシアン化カリウム溶液（１μＬ）を、それぞれ試薬固定部位１８上の異なる領域に配置した後、常温で３時間、真空乾燥させた。
図１０は、実施例１における、反応溶液中のＡＬＰ−Ａｂ濃度と、電圧印加直後にそれぞれの反応溶液において流れた電流値との関係を示すグラフである。図１０に示すように、定電位測定により検出された電流値は、ＡＬＰ−Ａｂ濃度との間に高い相関が認められた。このように、実施例１のチップを使用すると、標的物質の量を高精度に測定できる。
（比較例３）
図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬群を、電子伝達体のうちＮＡＤＰのみを酵素およびその基質から分離した状態で、試薬固定部位１８上に乾燥固定したチップ３００を用いたこと以外は、比較例２と同様にして定電位測定を実施した。
図４に示す酵素サイクリング反応に関与する試薬群を、電子伝達体のうちＮＡＤＰのみを酵素およびその基質から分離した状態で、試薬固定部位１８上に乾燥固定したチップ３００を用いたこと以外は、比較例２と同様にして定電位測定を実施した。
試薬群は、次のようにして乾燥固定した。１Ｍのフェリシアン化カリウム溶液（１μＬ）、１０００Ｕ／ｍＬのジアホラーゼ溶液（６．７μＬ）、４Ｍのリンゴ酸ナトリウム溶液（７．８μＬ）、２５０００Ｕ／ｍＬのリンゴ酸脱水素酵素溶液（１μＬ）、および１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（５μＬ、ｐＨ９）を混合することにより、混合溶液を調製した。また、５ｍＭのＮＡＤＰ溶液（１μＬ）を用意した。これらの混合溶液（２１．５μＬ）、およびＮＡＤＰ溶液（１μＬ）を、それぞれ試薬固定部位１８上の異なる領域に配置した後、常温で３時間、真空乾燥させた。
図１１は、比較例３における、反応溶液中のＡＬＰ−Ａｂ濃度と、電圧印加直後にそれぞれの反応溶液において流れた電流値との関係を示すグラフである。図１１に示すように、定電位測定により検出された電流値のプロットに対する近似線の傾き（２１．６）は、実施例１において得られた近似線の傾き（７２．７）と比べて、１／３にも満たない程度に小さかった。このように、比較例３のチップでは、実施例１のチップを使用した場合に匹敵する程度の高精度で、標的物質の量を測定することは難しい。
本発明により、揮発性の高い試薬を必要とせずに、高精度な免疫学的測定を実施できるチップが提供される。
Claims (3)
- 免疫測定法を用いて電気化学的に標的物質の量を測定するチップであって、
前記チップは、作用極および対極からなる電極、または作用極、対極、および参照極からなる電極を有し、
該チップ内に、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも１種、リンゴ酸脱水素酵素、該リンゴ酸脱水素酵素の基質、フェリシアン化カリウムならびにジアホラーゼが固定され、
前記リンゴ酸脱水素酵素と、前記ＮＡＤＰおよび前記ＮＡＤＰＨから選ばれる少なくとも１種と、前記基質とが混合された状態で同一の場所に固定され、
前記リンゴ酸脱水素酵素と、前記フェリシアン化カリウムとが離間した状態で固定されたチップ。 - 前記リンゴ酸脱水素酵素の前記基質が、リンゴ酸およびリンゴ酸塩から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載のチップ。
- 前記リンゴ酸塩が、リンゴ酸ナトリウムおよびリンゴ酸カリウムから選ばれる少なくとも１種を含む、請求項２に記載のチップ。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006192581 | 2006-07-13 | ||
| JP2006192581 | 2006-07-13 | ||
| PCT/JP2007/060447 WO2008007499A1 (fr) | 2006-07-13 | 2007-05-22 | Puce a dosage immunologique electrochimique |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP4083213B2 true JP4083213B2 (ja) | 2008-04-30 |
| JPWO2008007499A1 JPWO2008007499A1 (ja) | 2009-12-10 |
Family
ID=38923068
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007535937A Active JP4083213B2 (ja) | 2006-07-13 | 2007-05-22 | 電気化学的免疫測定チップ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7585400B2 (ja) |
| JP (1) | JP4083213B2 (ja) |
| WO (1) | WO2008007499A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5500791B2 (ja) * | 2008-06-19 | 2014-05-21 | デンカ生研株式会社 | 新規検査方法及びそれに用いる検査キット |
| JP2021089141A (ja) * | 2018-03-26 | 2021-06-10 | Ｐｈｃホールディングス株式会社 | バイオセンサ |
| NO345437B1 (en) | 2018-06-01 | 2021-02-01 | Prores E&P As | Mud loss treatment drilling tool and method |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5853863B2 (ja) * | 1978-07-14 | 1983-12-01 | 松下電器産業株式会社 | 酵素電極系 |
| JPS59166084A (ja) * | 1983-03-11 | 1984-09-19 | Hitachi Chem Co Ltd | 安定な酵素試薬の製造法 |
| JP2502666B2 (ja) | 1988-01-29 | 1996-05-29 | 松下電器産業株式会社 | バイオセンサ及びその製造方法 |
| JPH0296649A (ja) * | 1988-10-04 | 1990-04-09 | Unitika Ltd | デヒドロゲナーゼ電極 |
| JP3214188B2 (ja) * | 1993-10-08 | 2001-10-02 | 松下電器産業株式会社 | バイオセンサおよびその製造法 |
| JPH08327852A (ja) | 1995-05-31 | 1996-12-13 | Sumitomo Electric Ind Ltd | 光ファイバカプラおよびその製造方法 |
| KR0156176B1 (ko) | 1995-06-01 | 1998-12-01 | 구자홍 | 전기화학식 면역 바이오센서 |
| JPH09297121A (ja) | 1996-03-07 | 1997-11-18 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | コレステロールセンサ |
| JP2005046001A (ja) * | 2001-06-15 | 2005-02-24 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 脂質修飾酵素の製造方法およびバイオセンサ |
| JP2004024254A (ja) * | 2002-04-30 | 2004-01-29 | Masao Umemoto | ミオイノシトールの簡易測定法 |
| WO2005108968A1 (ja) * | 2004-05-12 | 2005-11-17 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | バイオセンサ、バイオセンサ用容器、およびバイオセンサ測定装置 |
-
2007
- 2007-05-22 WO PCT/JP2007/060447 patent/WO2008007499A1/ja active Application Filing
- 2007-05-22 JP JP2007535937A patent/JP4083213B2/ja active Active
- 2007-10-30 US US11/976,950 patent/US7585400B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008007499A1 (fr) | 2008-01-17 |
| US7585400B2 (en) | 2009-09-08 |
| JPWO2008007499A1 (ja) | 2009-12-10 |
| US20080308419A1 (en) | 2008-12-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Adeloju | Progress and recent advances in phosphate sensors: A review | |
| Frew et al. | Electrochemical biosensors | |
| Scheller et al. | Biosensors | |
| EP0710358B1 (en) | Potentiometric biosensor and the method of its use | |
| US9040252B2 (en) | Method for increasing and regulating light emission from a chemiluminescent reaction | |
| EP1362920A1 (en) | Biosensor | |
| Laschi et al. | Screen‐printed electrochemical immunosensors for PCB detection | |
| JPWO2008072702A1 (ja) | 全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット | |
| US7169273B2 (en) | Enzyme electrode | |
| CN110408679B (zh) | 一种基于酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax-5a检测方法 | |
| CN109283234A (zh) | 一种去干扰纸基电化学传感器及其测试方法 | |
| Zhang et al. | A rapid competitive binding nonseparation electrochemical enzyme immunoassay (NEEIA) test strip for microcystin-LR (MCLR) determination | |
| JP4083213B2 (ja) | 電気化学的免疫測定チップ | |
| RU2005116827A (ru) | Способы и композиции для определения характеристик фермента окислительно-восстановительной системы реагентов | |
| US20060199187A1 (en) | Enzyme amplified electrochemical DNA detection | |
| Mieliauskiene et al. | Amperometric determination of acetate with a tri-enzyme based sensor | |
| KR102009455B1 (ko) | 산화환원 효소를 이용한 바이오센서 | |
| JP2005118014A (ja) | 分析方法およびそれに用いる試薬 | |
| JP4050308B2 (ja) | リンゴ酸デヒドロゲナーゼを基板上に固定する方法 | |
| CN208705267U (zh) | 一种去干扰纸基电化学传感器 | |
| KR101109857B1 (ko) | 더블 펄스 방식을 이용한 바이오센서 | |
| Bannister et al. | Development of amperometric biosensors for enzyme immunoassay | |
| JPH09257742A (ja) | アルコールセンサ | |
| JPH11108881A (ja) | 過酸化水素分析型酵素電極 | |
| JPH0815217A (ja) | マンニトール測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080121 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080212 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4083213 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110222 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120222 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130222 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130222 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140222 Year of fee payment: 6 |