JPH0815217A - マンニトール測定方法 - Google Patents
マンニトール測定方法Info
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- JPH0815217A JPH0815217A JP6142093A JP14209394A JPH0815217A JP H0815217 A JPH0815217 A JP H0815217A JP 6142093 A JP6142093 A JP 6142093A JP 14209394 A JP14209394 A JP 14209394A JP H0815217 A JPH0815217 A JP H0815217A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 速く、正確なマンニトール測定法を提供す
る。 【構成】 マンニトールを含み得る試料、マンニト
ール脱水素酵素、補酵素酸化体Ｃox、補酵素還元体
Ｃred と第２の脱水素酵素の基質酸化体Ｙoxより基質還
元体Ｙred と補酵素酸化体Ｃoxを生成する第２の脱水素
酵素、及び第２の脱水素酵素の基質酸化体Ｙoxを含む
反応系で、第２の脱水素酵素の基質還元体Ｙred を生成
させるＡ工程、並びに、生成した基質還元体Ｙred を測
定するＢ工程を有するマンニトール測定方法。
る。 【構成】 マンニトールを含み得る試料、マンニト
ール脱水素酵素、補酵素酸化体Ｃox、補酵素還元体
Ｃred と第２の脱水素酵素の基質酸化体Ｙoxより基質還
元体Ｙred と補酵素酸化体Ｃoxを生成する第２の脱水素
酵素、及び第２の脱水素酵素の基質酸化体Ｙoxを含む
反応系で、第２の脱水素酵素の基質還元体Ｙred を生成
させるＡ工程、並びに、生成した基質還元体Ｙred を測
定するＢ工程を有するマンニトール測定方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素反応を利用した測
定方法であり、特にマンニトール測定方法に関する。
定方法であり、特にマンニトール測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵素試薬を用いた測定法は、化学反応を
用いる検出法に比較して、酸、塩基や有機溶剤等の危険
な試薬を使用せず、加熱、抽出等の繁雑な反応操作を行
うことがなく、また廃液の処理等もほとんど考慮する必
要が無い等、安全で環境にもやさしい分析方法である。
また酵素は基質特異性が高く選択性に優れ、反応条件も
穏やかであるという利点がある。
用いる検出法に比較して、酸、塩基や有機溶剤等の危険
な試薬を使用せず、加熱、抽出等の繁雑な反応操作を行
うことがなく、また廃液の処理等もほとんど考慮する必
要が無い等、安全で環境にもやさしい分析方法である。
また酵素は基質特異性が高く選択性に優れ、反応条件も
穏やかであるという利点がある。
【０００３】そのため従来より酵素反応を利用した各種
の分析方法が知られている。例えば、基質と酸素より酸
化酵素の作用で基質酸化体と過酸化水素が生成する反応
を利用して減少した酸素や増加した過酸化水素を電極法
で検知する方法や、生成した過酸化水素を比色法で定量
する方法が一般的である。また、脱水素酵素を用いた測
定法では、基質に補酵素を添加し脱水素酵素の作用で基
質と補酵素間の酸化還元反応が起こるのを利用して増減
する補酵素を比色法で検出する方法が一般的である。
の分析方法が知られている。例えば、基質と酸素より酸
化酵素の作用で基質酸化体と過酸化水素が生成する反応
を利用して減少した酸素や増加した過酸化水素を電極法
で検知する方法や、生成した過酸化水素を比色法で定量
する方法が一般的である。また、脱水素酵素を用いた測
定法では、基質に補酵素を添加し脱水素酵素の作用で基
質と補酵素間の酸化還元反応が起こるのを利用して増減
する補酵素を比色法で検出する方法が一般的である。
【０００４】これらの方法のうち最終検出手段が比色法
による場合は、試料の濁り、着色が正確な測定を妨げた
り、これらの除去のため繁雑な前処理が必要となる等の
問題があった。
による場合は、試料の濁り、着色が正確な測定を妨げた
り、これらの除去のため繁雑な前処理が必要となる等の
問題があった。
【０００５】また、酸化酵素を用いて電極で検出する測
定法は、濁りや着色物質による影響を受けないが、実用
に適する充分な活性を有する酸化酵素の種類が限定され
ているので、多様な測定要求に応えることができなかっ
た。脱水素酵素に関しては、例えば、アルコール脱水素
酵素はエタノールに比べメタノールにはあまり作用しな
いので、メタノールの混在する系でエタノールを測定す
る場合に用いられる。しかし、脱水素酵素の補酵素とし
て利用されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下ＮＡＤと略す）等を再現性よく電極法で測定する
ことは困難であり、単純に脱水素酵素を利用することは
できない。
定法は、濁りや着色物質による影響を受けないが、実用
に適する充分な活性を有する酸化酵素の種類が限定され
ているので、多様な測定要求に応えることができなかっ
た。脱水素酵素に関しては、例えば、アルコール脱水素
酵素はエタノールに比べメタノールにはあまり作用しな
いので、メタノールの混在する系でエタノールを測定す
る場合に用いられる。しかし、脱水素酵素の補酵素とし
て利用されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（以下ＮＡＤと略す）等を再現性よく電極法で測定する
ことは困難であり、単純に脱水素酵素を利用することは
できない。
【０００６】様々な測定対象の中には、化学反応による
検出では測定が困難なものもある。例えばマンニトール
は、フラクトースが還元された糖アルコールで、タマネ
ギやキノコ、コンブ等の藻類に含まれている。また、マ
ンニトールの用途としては低カロリー甘味料、食品や化
粧品の品質改良剤、安定化剤等が挙げられる。そのた
め、マンニトールを測定する要求は高まっているが、他
の糖アルコールや糖が共存する系で、糖アルコールの性
質を利用した化学反応でマンニトールだけを選択的に測
定することは難しい。このような各種の糖や糖アルコー
ルを含む場合では前処理を行った後、ＨＰＬＣ（高速液
体クロマトグラフ）等により測定しなければならずマン
ニトールだけを簡便に測定するのには不向きである。
検出では測定が困難なものもある。例えばマンニトール
は、フラクトースが還元された糖アルコールで、タマネ
ギやキノコ、コンブ等の藻類に含まれている。また、マ
ンニトールの用途としては低カロリー甘味料、食品や化
粧品の品質改良剤、安定化剤等が挙げられる。そのた
め、マンニトールを測定する要求は高まっているが、他
の糖アルコールや糖が共存する系で、糖アルコールの性
質を利用した化学反応でマンニトールだけを選択的に測
定することは難しい。このような各種の糖や糖アルコー
ルを含む場合では前処理を行った後、ＨＰＬＣ（高速液
体クロマトグラフ）等により測定しなければならずマン
ニトールだけを簡便に測定するのには不向きである。
【０００７】このようにマンニトールだけを選択的に測
定するには、酵素を利用した測定法が望ましく、マンニ
トール脱水素酵素を利用することができるが、マンニト
ール脱水素酵素を利用した反応であっても最終検出手段
が比色法である場合は前記のような問題があった。
定するには、酵素を利用した測定法が望ましく、マンニ
トール脱水素酵素を利用することができるが、マンニト
ール脱水素酵素を利用した反応であっても最終検出手段
が比色法である場合は前記のような問題があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の酸化
酵素のみを利用した電気化学的測定では充分な活性を有
する酵素の種類が少なく、測定対象が限られていた等、
前記の問題を解決し、マンニトールを精度良く簡便に測
定することができる方法を提供する。
酵素のみを利用した電気化学的測定では充分な活性を有
する酵素の種類が少なく、測定対象が限られていた等、
前記の問題を解決し、マンニトールを精度良く簡便に測
定することができる方法を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、下記の各態様
を含むが、これらに限定されるものではない。
を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１０】（１） マンニトールを含み得る試料、
マンニトールと補酵素（ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸）の酸化体よりフラクトースと補酵素還元体を生
成する反応を触媒するマンニトール脱水素酵素、前記
補酵素酸化体、補酵素還元体と第２の脱水素酵素の基
質酸化体Ｙoxより基質還元体Ｙred と補酵素酸化体を生
成する第２の脱水素酵素、第２の脱水素酵素の基質酸
化体Ｙoxを含む反応系で、第２の脱水素酵素の基質還元
型Ｙred を生成させるＡ工程、並びに、生成したＹred
を測定するＢ工程、を有する試料中のマンニトール測定
方法。
マンニトールと補酵素（ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸）の酸化体よりフラクトースと補酵素還元体を生
成する反応を触媒するマンニトール脱水素酵素、前記
補酵素酸化体、補酵素還元体と第２の脱水素酵素の基
質酸化体Ｙoxより基質還元体Ｙred と補酵素酸化体を生
成する第２の脱水素酵素、第２の脱水素酵素の基質酸
化体Ｙoxを含む反応系で、第２の脱水素酵素の基質還元
型Ｙred を生成させるＡ工程、並びに、生成したＹred
を測定するＢ工程、を有する試料中のマンニトール測定
方法。
【００１１】（２） 生成した基質還元体Ｙred を測定
する工程が、Ｙred の酸化反応を触媒する酸化酵素の固
定化体に接触させ、減少または増加する電極活性物質の
変化量を電気化学的に検出することによる（１）記載の
測定方法。
する工程が、Ｙred の酸化反応を触媒する酸化酵素の固
定化体に接触させ、減少または増加する電極活性物質の
変化量を電気化学的に検出することによる（１）記載の
測定方法。
【００１２】（３） 更に試料中に元来存在していたＹ
red を測定するＣ工程を有し、前記第２の脱水素酵素の
基質還元体Ｙred を生成させるＡ工程の後に前記Ｂ工程
を行い求めた基質還元体Ｙred の測定値からＣ工程で求
めた試料中に元来存在していたＹred 量を補正する
（１）記載の測定方法。 （４） 酸化酵素の反応により減少または増加する物質
が酸素または過酸化水素である（２）記載の測定方法。
red を測定するＣ工程を有し、前記第２の脱水素酵素の
基質還元体Ｙred を生成させるＡ工程の後に前記Ｂ工程
を行い求めた基質還元体Ｙred の測定値からＣ工程で求
めた試料中に元来存在していたＹred 量を補正する
（１）記載の測定方法。 （４） 酸化酵素の反応により減少または増加する物質
が酸素または過酸化水素である（２）記載の測定方法。
【００１３】（５） （１）において、第２の脱水素酵
素がＬ−乳酸脱水素酵素であり、その基質酸化体Ｙoxが
ピルビン酸であり、基質酸化体Ｙred がＬ−乳酸である
マンニトール測定方法。 （６） （２）において、Ｙred がＬ−乳酸であり、酸
化酵素がＬ−乳酸酸化酵素であるマンニトール測定方
法。
素がＬ−乳酸脱水素酵素であり、その基質酸化体Ｙoxが
ピルビン酸であり、基質酸化体Ｙred がＬ−乳酸である
マンニトール測定方法。 （６） （２）において、Ｙred がＬ−乳酸であり、酸
化酵素がＬ−乳酸酸化酵素であるマンニトール測定方
法。
【００１４】（７） マンニトールを含み得る試料、
マンニトール脱水素酵素、補酵素酸化体Ｃox、補
酵素還元体Ｃred と第２の脱水素酵素の基質酸化体Ｙox
より基質還元体Ｙred と補酵素酸化体Ｃoxを生成する第
２の脱水素酵素、及び第２の脱水素酵素の基質酸化体
Ｙoxを含む反応系で、第２の脱水素酵素の基質還元体Ｙ
red を生成させるＡ工程、並びに生成した基質還元体Ｙ
red を測定するＢ工程、を有する試料中のマンニトール
測定方法。
マンニトール脱水素酵素、補酵素酸化体Ｃox、補
酵素還元体Ｃred と第２の脱水素酵素の基質酸化体Ｙox
より基質還元体Ｙred と補酵素酸化体Ｃoxを生成する第
２の脱水素酵素、及び第２の脱水素酵素の基質酸化体
Ｙoxを含む反応系で、第２の脱水素酵素の基質還元体Ｙ
red を生成させるＡ工程、並びに生成した基質還元体Ｙ
red を測定するＢ工程、を有する試料中のマンニトール
測定方法。
【００１５】
【作用】本発明はＡ工程として、マンニトール脱水素酵
素の反応と別の第２の脱水素酵素の反応を複合させて、
試料中のマンニトール量に対応した量のＹred を生成さ
せる。まずマンニトール脱水素酵素の反応式は以下のよ
うに示される。ただし、補酵素はニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）あるいはニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰ
と略す）であり、それぞれ補酵素酸化体ＣOXはＮＡＤま
たはＮＡＤＰ、還元体Ｃred はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ
Ｈで例示される。
素の反応と別の第２の脱水素酵素の反応を複合させて、
試料中のマンニトール量に対応した量のＹred を生成さ
せる。まずマンニトール脱水素酵素の反応式は以下のよ
うに示される。ただし、補酵素はニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）あるいはニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰ
と略す）であり、それぞれ補酵素酸化体ＣOXはＮＡＤま
たはＮＡＤＰ、還元体Ｃred はＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ
Ｈで例示される。
【００１６】マンニトール脱水素酵素反応 マンニトール＋ＮＡＤ（Ｐ）→フラクトース＋ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ
（Ｐ）Ｈ
【００１７】この反応は可逆的であり、反応平衡に達す
ると反応は見かけ上停止するので、すべてのマンニトー
ルがすべてフラクトースに変換されるものではない。そ
のため、生成してきたフラクトースもしくはＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを別の物質に変換し平衡をずらして反応を進行
させる必要がある。またこのフラクトースもしくはＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈの消費反応はマンニトール脱水素酵素の反応
と同時に行わなければ効果が無いので、同様の条件で反
応させることができる酵素を使用することが考えられ
る。そして、本発明ではマンニトール脱水素酵素の反応
に利用される補酵素を共有する第２の脱水素酵素を利用
する。還元された補酵素を再酸化する反応を組み合せ
て、補酵素をリサイクルし、高価な補酵素の使用量を少
なくすることにより、分析コストを低減させることがで
きる。
ると反応は見かけ上停止するので、すべてのマンニトー
ルがすべてフラクトースに変換されるものではない。そ
のため、生成してきたフラクトースもしくはＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを別の物質に変換し平衡をずらして反応を進行
させる必要がある。またこのフラクトースもしくはＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈの消費反応はマンニトール脱水素酵素の反応
と同時に行わなければ効果が無いので、同様の条件で反
応させることができる酵素を使用することが考えられ
る。そして、本発明ではマンニトール脱水素酵素の反応
に利用される補酵素を共有する第２の脱水素酵素を利用
する。還元された補酵素を再酸化する反応を組み合せ
て、補酵素をリサイクルし、高価な補酵素の使用量を少
なくすることにより、分析コストを低減させることがで
きる。
【００１８】また、脱水素酵素であれば反応の平衡状態
が、ほとんどの場合基質還元体Ｙred と補酵素酸化体Ｎ
ＡＤ（Ｐ）が生成する方向へ偏っているので使用するこ
とができる。上記のマンニトール脱水素酵素の反応系に
更に第２の脱水素酵素とその基質酸化体Ｙoxを添加し、
第２の脱水素酵素の反応を複合させる。
が、ほとんどの場合基質還元体Ｙred と補酵素酸化体Ｎ
ＡＤ（Ｐ）が生成する方向へ偏っているので使用するこ
とができる。上記のマンニトール脱水素酵素の反応系に
更に第２の脱水素酵素とその基質酸化体Ｙoxを添加し、
第２の脱水素酵素の反応を複合させる。
【００１９】第２脱水素酵素反応 Ｙox＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→Ｙred ＋ＮＡＤ（Ｐ） 本発明ではマンニトールと当mole以上のＹoxを添加する
ものであり、１moleのマンニトールより１moleのＹred
を生成させることができる。
ものであり、１moleのマンニトールより１moleのＹred
を生成させることができる。
【００２０】次にＢ工程として、生成したＹred を測定
すれば、試料中のマンニトール量を求めることができ
る。Ｙred の定量にはＹred に特異的に作用する酸化酵
素を使用する方法が好ましい。酸化酵素はＹred を溶存
酸素の存在下で基質酸化体Ｚoxに酸化し過酸化水素を生
成する。酸化酵素の代表的な反応は下記に例示されてい
る。
すれば、試料中のマンニトール量を求めることができ
る。Ｙred の定量にはＹred に特異的に作用する酸化酵
素を使用する方法が好ましい。酸化酵素はＹred を溶存
酸素の存在下で基質酸化体Ｚoxに酸化し過酸化水素を生
成する。酸化酵素の代表的な反応は下記に例示されてい
る。
【００２１】酸化酵素反応 Ｙred ＋Ｏ2 →Ｚox＋Ｈ2 Ｏ2 この酸化酵素の反応は酸素より過酸化水素を生成する一
方向の反応であり、Ｚoxが共存していても反応には影響
がなく、またＮＡＤ（Ｐ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが共存して
いても影響がない。マンニトール脱水素酵素及び第２の
脱水素酵素は酸化酵素の反応を阻害したり、酸化酵素の
反応によって阻害されないので失活させる必要はない。
方向の反応であり、Ｚoxが共存していても反応には影響
がなく、またＮＡＤ（Ｐ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが共存して
いても影響がない。マンニトール脱水素酵素及び第２の
脱水素酵素は酸化酵素の反応を阻害したり、酸化酵素の
反応によって阻害されないので失活させる必要はない。
【００２２】酸化酵素反応の検出方法は電気化学的検出
等があるが、これについては後に記載する。本発明にお
いて補酵素酸化体ＮＡＤ（Ｐ）がマンニトール脱水素酵
素の反応で還元されＮＡＤ（Ｐ）Ｈになり、さらに第２
の脱水素酵素の反応で酸化されＮＡＤ（Ｐ）に戻る。こ
のため見かけ上補酵素は反応に関与していないかのよう
であるが、電子伝達体としてリサイクルしている。した
がって、本発明では反応系にＮＡＤ（Ｐ）を添加する
が、たとえＮＡＤ（Ｐ）量が試料中のマンニトール量よ
り少ない場合でもマンニトールを完全にＹred に変換す
ることができる。
等があるが、これについては後に記載する。本発明にお
いて補酵素酸化体ＮＡＤ（Ｐ）がマンニトール脱水素酵
素の反応で還元されＮＡＤ（Ｐ）Ｈになり、さらに第２
の脱水素酵素の反応で酸化されＮＡＤ（Ｐ）に戻る。こ
のため見かけ上補酵素は反応に関与していないかのよう
であるが、電子伝達体としてリサイクルしている。した
がって、本発明では反応系にＮＡＤ（Ｐ）を添加する
が、たとえＮＡＤ（Ｐ）量が試料中のマンニトール量よ
り少ない場合でもマンニトールを完全にＹred に変換す
ることができる。
【００２３】測定を行う上でマンニトールと基質還元体
Ｙred の間の変換係数は必ずしも１００％である必要は
なく、予め決められた係数に従って計算ができる。つま
り、１００％反応が終了するまでに反応を停止させ、速
度論的にマンニトール濃度を求めることもできる。ただ
し反応を完結させることにより正確な反応時間の制御が
不必要となるため実用的に好ましい。
Ｙred の間の変換係数は必ずしも１００％である必要は
なく、予め決められた係数に従って計算ができる。つま
り、１００％反応が終了するまでに反応を停止させ、速
度論的にマンニトール濃度を求めることもできる。ただ
し反応を完結させることにより正確な反応時間の制御が
不必要となるため実用的に好ましい。
【００２４】このような反応条件を達成するためには、
反応系に加える基質酸化体Ｙoxの量は試料マンニトール
量より多くなくては、すべてのマンニトールを酸化させ
ることはできない。試料がマンニトール以外に基質還元
体Ｙred を含む場合は、Ｃ工程として試料中の基質還元
体Ｙred 量をまず測定しておき、次に試料中のマンニト
ールからＹred への変換反応を行なった後のＹred を測
定し、両者の差からＹred の増加量を求めてから、マン
ニトールの量を求める必要がある。
反応系に加える基質酸化体Ｙoxの量は試料マンニトール
量より多くなくては、すべてのマンニトールを酸化させ
ることはできない。試料がマンニトール以外に基質還元
体Ｙred を含む場合は、Ｃ工程として試料中の基質還元
体Ｙred 量をまず測定しておき、次に試料中のマンニト
ールからＹred への変換反応を行なった後のＹred を測
定し、両者の差からＹred の増加量を求めてから、マン
ニトールの量を求める必要がある。
【００２５】マンニトール脱水素酵素と第２の脱水素酵
素の反応は同時に進行させるが、酸化酵素の反応は別段
階で行うのでＹred の酸化により生成するＺoxはＹoxと
同一であってもかまわない。また、マンニトールは反応
系にＮＡＤ（Ｐ）を添加するので酸化酵素により生成す
るＺoxとは反応しない。このためマンニトールのリサイ
クルは起こらない。
素の反応は同時に進行させるが、酸化酵素の反応は別段
階で行うのでＹred の酸化により生成するＺoxはＹoxと
同一であってもかまわない。また、マンニトールは反応
系にＮＡＤ（Ｐ）を添加するので酸化酵素により生成す
るＺoxとは反応しない。このためマンニトールのリサイ
クルは起こらない。
【００２６】本発明においては測定対象はマンニトール
であるが、第２の脱水素酵素には各種のものを組み合わ
せることができ、その例を表１に示す。
であるが、第２の脱水素酵素には各種のものを組み合わ
せることができ、その例を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】選択する第２脱水素酵素の種類により、Ｙ
oxは自動的に決定され、同時に測定するＹred および酸
化酵素も決まる。この方法により、酸化酵素を利用した
Ｙred （例えばＤ−グルコース、Ｌ−乳酸等）の測定、
及びマンニトールの測定を連続的に行うことも可能とな
る。尚、第２脱水素酵素には、マンニトール脱水素酵素
と同じ補酵素つまりＮＡＤまたはＮＡＤＰに反応するも
のを選ばなければならない。
oxは自動的に決定され、同時に測定するＹred および酸
化酵素も決まる。この方法により、酸化酵素を利用した
Ｙred （例えばＤ−グルコース、Ｌ−乳酸等）の測定、
及びマンニトールの測定を連続的に行うことも可能とな
る。尚、第２脱水素酵素には、マンニトール脱水素酵素
と同じ補酵素つまりＮＡＤまたはＮＡＤＰに反応するも
のを選ばなければならない。
【００２９】本発明において用いるマンニトール脱水素
酵素および第２の脱水素酵素の種類、由来についてはと
くに限定されない。また、マンニトール脱水素酵素およ
び第２の脱水素酵素の活性量についてもとくに限定され
ない。しかし、活性量が少なすぎると反応に時間がかか
りすぎ、また単位時間あたりの変化量が少なく測定が困
難になる場合がある。また活性量が多いと反応は速い
が、分析コストが上昇する。そのため実用的にはマンニ
トール脱水素酵素０．１〜２０Ｕ／ｍｌ、第２の脱水素
酵素については用いる脱水素酵素の種類により異なる
が、表記活性でマンニトール脱水素酵素の１００分の１
から１００倍程度が好ましい。
酵素および第２の脱水素酵素の種類、由来についてはと
くに限定されない。また、マンニトール脱水素酵素およ
び第２の脱水素酵素の活性量についてもとくに限定され
ない。しかし、活性量が少なすぎると反応に時間がかか
りすぎ、また単位時間あたりの変化量が少なく測定が困
難になる場合がある。また活性量が多いと反応は速い
が、分析コストが上昇する。そのため実用的にはマンニ
トール脱水素酵素０．１〜２０Ｕ／ｍｌ、第２の脱水素
酵素については用いる脱水素酵素の種類により異なる
が、表記活性でマンニトール脱水素酵素の１００分の１
から１００倍程度が好ましい。
【００３０】また測定に用いるＮＡＤまたはＮＡＤＰに
ついては同様に、少量でも存在すれば反応は進行する
が、速度は遅い。そして、多量に存在すると反応は速く
なるが、分析コストが上昇するので、０．１〜２０ｍＭ
程度が好ましい。そして、第２の脱水素酵素の基質酸化
体Ｙoxは、マンニトール測定上限の１．０〜５倍量あれ
ばよい。
ついては同様に、少量でも存在すれば反応は進行する
が、速度は遅い。そして、多量に存在すると反応は速く
なるが、分析コストが上昇するので、０．１〜２０ｍＭ
程度が好ましい。そして、第２の脱水素酵素の基質酸化
体Ｙoxは、マンニトール測定上限の１．０〜５倍量あれ
ばよい。
【００３１】次に、第２の脱水素酵素の反応により生成
したＹred を酸化酵素反応を利用して定量するＢ工程を
具体的に説明する。勿論試料中に元来存在していたＹre
d を測定するＣ工程も手法としては同じである。酸化酵
素の反応で生成した過酸化水素の定量は、例えば、パー
オキシダーゼと２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベン
ツチアゾリン）−６−スルホン酸または４−アミノアン
チピリンをもちいた方法（トリンダー法）等により、可
視部の吸光度を測定することにより測定できる。可視部
の吸光度測定は補酵素の定量に使用する紫外部の吸光度
測定に比べ、濁りの影響を受けにくい。しかし、分光光
度計をもちいる測定は試料の濁りや、着色物質を含んで
いる場合には正確な測定が困難であり、そのために前処
理を必要とする。
したＹred を酸化酵素反応を利用して定量するＢ工程を
具体的に説明する。勿論試料中に元来存在していたＹre
d を測定するＣ工程も手法としては同じである。酸化酵
素の反応で生成した過酸化水素の定量は、例えば、パー
オキシダーゼと２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベン
ツチアゾリン）−６−スルホン酸または４−アミノアン
チピリンをもちいた方法（トリンダー法）等により、可
視部の吸光度を測定することにより測定できる。可視部
の吸光度測定は補酵素の定量に使用する紫外部の吸光度
測定に比べ、濁りの影響を受けにくい。しかし、分光光
度計をもちいる測定は試料の濁りや、着色物質を含んで
いる場合には正確な測定が困難であり、そのために前処
理を必要とする。
【００３２】この方法に比較して、減少した酸素、また
は生成した過酸化水素を電極によって電流値に変換して
測定する電気化学的測定法は操作が簡単で濁りや着色物
質の影響を受けにくく優れた検出手段である。消費され
た酸素を測定する酸素電極は、ガルバニ型、クラーク型
等各種公知のものを利用できる。
は生成した過酸化水素を電極によって電流値に変換して
測定する電気化学的測定法は操作が簡単で濁りや着色物
質の影響を受けにくく優れた検出手段である。消費され
た酸素を測定する酸素電極は、ガルバニ型、クラーク型
等各種公知のものを利用できる。
【００３３】生成する過酸化水素を測定する過酸化水素
電極としては、アノード基体に炭素、白金、ニッケル、
パラジウム等を用い、カソード側に銀等を用いた公知の
ものを利用できる。一般にアノードとしては、過電圧が
低く高感度が得られるという理由から白金を用いること
が多い。そして電極表面にポリシロキサン膜、アクリル
樹脂膜、蛋白膜、アセチルセルロース膜、アルブミン膜
等の選択透過膜を有している形式の電極が妨害物除去の
観点から望ましい。
電極としては、アノード基体に炭素、白金、ニッケル、
パラジウム等を用い、カソード側に銀等を用いた公知の
ものを利用できる。一般にアノードとしては、過電圧が
低く高感度が得られるという理由から白金を用いること
が多い。そして電極表面にポリシロキサン膜、アクリル
樹脂膜、蛋白膜、アセチルセルロース膜、アルブミン膜
等の選択透過膜を有している形式の電極が妨害物除去の
観点から望ましい。
【００３４】また、ジクロロインドフェノール、フェリ
シアン化カリウム、ベンゾキノン等の電子伝達体、所謂
メディエーター等を介在させた電極で測定することもで
きる。電極系は作用電極、対極より構成される２電極の
過酸化水素電極や酸素電極が利用できるが、安定性、精
度の点から作用電極、参照電極、対極より構成される３
電極のものがより望ましい。
シアン化カリウム、ベンゾキノン等の電子伝達体、所謂
メディエーター等を介在させた電極で測定することもで
きる。電極系は作用電極、対極より構成される２電極の
過酸化水素電極や酸素電極が利用できるが、安定性、精
度の点から作用電極、参照電極、対極より構成される３
電極のものがより望ましい。
【００３５】尚、溶液状の酸化酵素を利用することもで
きるが、酸化酵素を固定化して用いると酵素の繰り返し
利用が可能となり、酵素の反応条件を規定し易い等の利
点がある。また、酸化酵素固定化体を、増減する酸素ま
たは過酸化水素等の変化量を検出する電極と組み合せて
使用するとＹred の検出を１段階で短時間に行うことが
でき、好ましい。
きるが、酸化酵素を固定化して用いると酵素の繰り返し
利用が可能となり、酵素の反応条件を規定し易い等の利
点がある。また、酸化酵素固定化体を、増減する酸素ま
たは過酸化水素等の変化量を検出する電極と組み合せて
使用するとＹred の検出を１段階で短時間に行うことが
でき、好ましい。
【００３６】酵素の固定化法は、特に限定されず、吸着
法、化学結合法、包括法等を用いることができる。中で
も強固な固定化体を作成できる化学結合法が望ましい。
固定化にもちいる担体にはケイソウ土、シリカゲル、ガ
ラスビーズ、アルミナ、セラミック、カーボン、活性
炭、モレキュラーシーブ、シリコンゴム、セルロース、
アガロース、アミノ酸系ポリマー等が使用できる。化学
結合法としては、担体表面にアミノシラン化試薬でアミ
ノ基を導入し、さらにグルタルアルデヒド等の多官能性
アルデヒドを用いてホルミル化を行った後、酵素を接触
させて固定化する方法が好適な例として挙げられる。固
定化酵素の形態は、担体に固定化しカラム等のリアクタ
ーに充填する方法が考えられる。
法、化学結合法、包括法等を用いることができる。中で
も強固な固定化体を作成できる化学結合法が望ましい。
固定化にもちいる担体にはケイソウ土、シリカゲル、ガ
ラスビーズ、アルミナ、セラミック、カーボン、活性
炭、モレキュラーシーブ、シリコンゴム、セルロース、
アガロース、アミノ酸系ポリマー等が使用できる。化学
結合法としては、担体表面にアミノシラン化試薬でアミ
ノ基を導入し、さらにグルタルアルデヒド等の多官能性
アルデヒドを用いてホルミル化を行った後、酵素を接触
させて固定化する方法が好適な例として挙げられる。固
定化酵素の形態は、担体に固定化しカラム等のリアクタ
ーに充填する方法が考えられる。
【００３７】また、酸化酵素をグルタルアルデヒド、ホ
ルムアルデヒド、サクシニルアデヒド等の架橋剤で固定
した膜を電極に取りつけて使用することもできる。膜状
に固定化する際にはアルブミン、グロブリン、ゼラチン
等の他のタンパク質を添加して酸化酵素を架橋すること
もできる。測定に使用する緩衝液は酸化酵素に適したｐ
Ｈで緩衝能があり、電極に電気化学的な影響を及ぼさな
いものならよい。
ルムアルデヒド、サクシニルアデヒド等の架橋剤で固定
した膜を電極に取りつけて使用することもできる。膜状
に固定化する際にはアルブミン、グロブリン、ゼラチン
等の他のタンパク質を添加して酸化酵素を架橋すること
もできる。測定に使用する緩衝液は酸化酵素に適したｐ
Ｈで緩衝能があり、電極に電気化学的な影響を及ぼさな
いものならよい。
【００３８】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさら
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。
【００３９】実施例１ マンニトール水溶液にマンニトール脱水素酵素、ＮＡ
Ｄ、Ｌ−乳酸脱水素酵素、ピルビン酸（ＹOX）を接触さ
せ一定時間反応させた後に（Ａ工程）、生成したＬ−乳
酸（Ｙred ）を測定した（Ｂ工程）。Ｌ−乳酸測定は、
以下に説明するＬ−乳酸測定装置を用い、生成した過酸
化水素を白金電極で測定する方法で行った。
Ｄ、Ｌ−乳酸脱水素酵素、ピルビン酸（ＹOX）を接触さ
せ一定時間反応させた後に（Ａ工程）、生成したＬ−乳
酸（Ｙred ）を測定した（Ｂ工程）。Ｌ−乳酸測定は、
以下に説明するＬ−乳酸測定装置を用い、生成した過酸
化水素を白金電極で測定する方法で行った。
【００４０】（１）Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラムの製
造方法 焼成したケイソウ土である耐火レンガ（３０〜６０メッ
シュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸
漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうして
アミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒド
に１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ
７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換
え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル
化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液にＬ−乳酸酸化酵素（シグマ社製）５０ユ
ニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触さ
せ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化
担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填し
Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラムとする。
造方法 焼成したケイソウ土である耐火レンガ（３０〜６０メッ
シュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸
漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうして
アミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒド
に１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ
７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換
え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル
化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液にＬ−乳酸酸化酵素（シグマ社製）５０ユ
ニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触さ
せ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化
担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填し
Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラムとする。
【００４１】（２）過酸化水素電極の製造 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化して選択透過膜を形成し、これを過酸化水素電極と
する。
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化して選択透過膜を形成し、これを過酸化水素電極と
する。
【００４２】また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照
電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
【００４３】（３）Ｌ−乳酸測定装置 図１に示すフロー型Ｌ−乳酸測定装置によってＬ−乳酸
の測定を行った。緩衝液（１）をポンプ（２）により送
液し、オートサンプラ（３）より試料５μｌを注入す
る。試料中のＬ−乳酸より、恒温槽（４）中のＬ−乳酸
酸化酵素固定化カラム（５）によって過酸化水素が生成
し、過酸化水素電極（６）により電流値の変化が捕らえ
られ検出器（７）により検出される。さらに信号をコン
ピュータ（１０）に送ることもできる。
の測定を行った。緩衝液（１）をポンプ（２）により送
液し、オートサンプラ（３）より試料５μｌを注入す
る。試料中のＬ−乳酸より、恒温槽（４）中のＬ−乳酸
酸化酵素固定化カラム（５）によって過酸化水素が生成
し、過酸化水素電極（６）により電流値の変化が捕らえ
られ検出器（７）により検出される。さらに信号をコン
ピュータ（１０）に送ることもできる。
【００４４】緩衝液の組成は１００ｍＭリン酸ナトリウ
ム、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウムを
含みｐＨ７．０である。
ム、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウムを
含みｐＨ７．０である。
【００４５】（４）測定方法 反応系での最終濃度がＮＡＤ５ｍＭ、ピルビン酸１０ｍ
Ｍ、マンニトール脱水素酵素（シグマ社製）１ユニット
／ｍｌ、Ｌ−乳酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）１０
ユニット／ｍｌ、リン酸ナトリウムを含みｐＨ７．５
で、マンニトール１ｍＭ、マンニトール２ｍＭ、
マンニトール５ｍＭ、を含む溶液をそれぞれ、２５℃に
おいて約６０分反応させた（Ａ工程）。
Ｍ、マンニトール脱水素酵素（シグマ社製）１ユニット
／ｍｌ、Ｌ−乳酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）１０
ユニット／ｍｌ、リン酸ナトリウムを含みｐＨ７．５
で、マンニトール１ｍＭ、マンニトール２ｍＭ、
マンニトール５ｍＭ、を含む溶液をそれぞれ、２５℃に
おいて約６０分反応させた（Ａ工程）。
【００４６】上記の反応液と蒸留水をブランクに用い
て、Ｌ−乳酸の１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭを上記（３）に
記載のＬ−乳酸測定装置を用いて測定し得られた電流値
（ｎＡ）を求めた。
て、Ｌ−乳酸の１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭを上記（３）に
記載のＬ−乳酸測定装置を用いて測定し得られた電流値
（ｎＡ）を求めた。
【００４７】（５）結果 マンニトールの反応液とＬ−乳酸標準液のそれぞれの電
流値は表２のようになった。
流値は表２のようになった。
【００４８】
【表２】
【００４９】Ｌ−乳酸、マンニトールのそれぞれの検量
線は以下のようになった。ただし、ｒは相関係数、Ｙは
濃度Ｘ（ｍＭ）のときの電流値（ｎＡ）である。 Ｌ−乳酸 検量線 ｒ＝０．９９９９ Ｙ＝２３．８２Ｘ＋０．７８ マンニトール 検量線 ｒ＝１．００００ Ｙ＝２３．７４Ｘ−０．０４
線は以下のようになった。ただし、ｒは相関係数、Ｙは
濃度Ｘ（ｍＭ）のときの電流値（ｎＡ）である。 Ｌ−乳酸 検量線 ｒ＝０．９９９９ Ｙ＝２３．８２Ｘ＋０．７８ マンニトール 検量線 ｒ＝１．００００ Ｙ＝２３．７４Ｘ−０．０４
【００５０】Ｌ−乳酸の検量線もマンニトールの検量線
もほぼ等しく、反応が進行するとマンニトールの酸化が
完了し、ピルビン酸が還元されＬ−乳酸が生成してい
る。そのため、反応終了後のＬ−乳酸量を測定すると、
マンニトールの測定が可能である。
もほぼ等しく、反応が進行するとマンニトールの酸化が
完了し、ピルビン酸が還元されＬ−乳酸が生成してい
る。そのため、反応終了後のＬ−乳酸量を測定すると、
マンニトールの測定が可能である。
【００５１】実施例２ 実施例１と同様のＬ−乳酸測定装置をもちいてＬ−乳酸
とマンニトールの混合液を測定した。 （１）測定方法 Ｌ−乳酸標準液とマンニトール標準液を混合した試料溶
液と、酵素と補酵素等を含む反応試薬を容量比１：１で
混合し、２５℃の室温で１時間反応させた。反応試薬の
組成は、ＮＡＤ１０ｍＭ、ピルビン酸２０ｍＭ、マンニ
トール脱水素酵素（シグマ社製）２ユニット／ｍｌ、Ｌ
−乳酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）２０ユニット／
ｍｌ、リン酸ナトリウムを含みｐＨ７．５である。
とマンニトールの混合液を測定した。 （１）測定方法 Ｌ−乳酸標準液とマンニトール標準液を混合した試料溶
液と、酵素と補酵素等を含む反応試薬を容量比１：１で
混合し、２５℃の室温で１時間反応させた。反応試薬の
組成は、ＮＡＤ１０ｍＭ、ピルビン酸２０ｍＭ、マンニ
トール脱水素酵素（シグマ社製）２ユニット／ｍｌ、Ｌ
−乳酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）２０ユニット／
ｍｌ、リン酸ナトリウムを含みｐＨ７．５である。
【００５２】〔Ａ〕試料をそのまま（Ｃ工程）、及び
〔Ｂ〕マンニトールの酸化が完了しピルビン酸が還元さ
れた状態の反応液（Ａ工程とＢ工程）の２点について実
施例１のＬ−乳酸測定装置を用いてＬ−乳酸濃度を測定
した。反応後の試料溶液〔Ｂ〕は２倍に希釈されている
ので、得られた測定値を２倍し、はじめの試料溶液
〔Ａ〕のＬ−乳酸濃度を差し引いてマンニトール濃度を
求めた。
〔Ｂ〕マンニトールの酸化が完了しピルビン酸が還元さ
れた状態の反応液（Ａ工程とＢ工程）の２点について実
施例１のＬ−乳酸測定装置を用いてＬ−乳酸濃度を測定
した。反応後の試料溶液〔Ｂ〕は２倍に希釈されている
ので、得られた測定値を２倍し、はじめの試料溶液
〔Ａ〕のＬ−乳酸濃度を差し引いてマンニトール濃度を
求めた。
【００５３】（２）結果 それぞれの試料のＬ−乳酸とマンニトール濃度は表３の
ようになり、Ｌ−乳酸、マンニトールとも正確に測定す
ることができた。
ようになり、Ｌ−乳酸、マンニトールとも正確に測定す
ることができた。
【００５４】
【表３】
【００５５】
【発明の効果】本発明の酵素反応を用いることにより、
マンニトールを簡便に、精度よく定量することが可能と
なった。また、第２の脱水素酵素の基質還元体Ｙred も
一連の操作で連続して測定することもできる。例えば、
マンニトールとＬ−乳酸の２成分を連続して簡便に測定
することが可能となった。
マンニトールを簡便に、精度よく定量することが可能と
なった。また、第２の脱水素酵素の基質還元体Ｙred も
一連の操作で連続して測定することもできる。例えば、
マンニトールとＬ−乳酸の２成分を連続して簡便に測定
することが可能となった。
【図１】図１は実施例で使用したフロー方式のＬ−乳酸
測定装置を示す。
測定装置を示す。
【図２】図２は本発明の酵素反応を示す。
１ 緩衝液槽 ２ ポンプ ３ サンプラ ４ 恒温槽 ５ Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラム ６ 過酸化水素電極 ７ 検出器 ８ シングルボードコンピュータ ９ ＲＳ２３２Ｃコード １０ パーソナルコンピュータ １１ サンプラ制御信号 １２ 送液ポンプ制御信号 １３ 廃液
Claims (3)
- 【請求項１】 マンニトールを含み得る試料、マン
ニトール脱水素酵素、補酵素酸化体Ｃox、補酵素還
元体Ｃred と第２の脱水素酵素の基質酸化体Ｙoxより基
質還元体Ｙred と補酵素酸化体Ｃoxを生成する第２の脱
水素酵素、及び第２の脱水素酵素の基質酸化体Ｙoxを
含む反応系で、第２の脱水素酵素の基質還元体Ｙred を
生成させるＡ工程、並びに生成した基質還元体Ｙred を
測定するＢ工程、を有する試料中のマンニトール測定方
法。 - 【請求項２】 生成した基質還元体Ｙred を測定する工
程が、Ｙred の酸化反応を触媒する酸化酵素の固定化体
に接触させ、減少または増加する電極活性物質の変化量
を電気化学的に検出することによる請求項１記載の測定
方法。 - 【請求項３】 更に試料中に元来存在していたＹred を
測定するＣ工程を有し、前記第２の脱水素酵素の基質還
元体Ｙred を生成させるＡ工程の後に前記Ｂ工程を行い
求めた基質還元体Ｙred の測定値からＣ工程で求めた試
料中に元来存在していたＹred 量で補正する請求項１記
載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14209394A JP3362509B2 (ja) | 1994-06-24 | 1994-06-24 | マンニトール測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14209394A JP3362509B2 (ja) | 1994-06-24 | 1994-06-24 | マンニトール測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0815217A true JPH0815217A (ja) | 1996-01-19 |
| JP3362509B2 JP3362509B2 (ja) | 2003-01-07 |
Family
ID=15307270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14209394A Expired - Fee Related JP3362509B2 (ja) | 1994-06-24 | 1994-06-24 | マンニトール測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3362509B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004077257A (ja) * | 2002-08-15 | 2004-03-11 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 化学物質の高感度電気化学検出方法、及び化学物質の高感度検出装置 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105158167A (zh) * | 2015-10-23 | 2015-12-16 | 广西裕源药业有限公司 | 一种甘露醇注射液含量的测定方法 |
-
1994
- 1994-06-24 JP JP14209394A patent/JP3362509B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004077257A (ja) * | 2002-08-15 | 2004-03-11 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 化学物質の高感度電気化学検出方法、及び化学物質の高感度検出装置 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3362509B2 (ja) | 2003-01-07 |
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