JPH0739395A - アンモニア測定方法及び測定装置 - Google Patents
アンモニア測定方法及び測定装置Info
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- JPH0739395A JPH0739395A JP5189952A JP18995293A JPH0739395A JP H0739395 A JPH0739395 A JP H0739395A JP 5189952 A JP5189952 A JP 5189952A JP 18995293 A JP18995293 A JP 18995293A JP H0739395 A JPH0739395 A JP H0739395A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、酵素反応を利用した迅速かつ簡便
なアンモニアの測定方法および測定装置に関する。 【構成】試料液をα−ケトグルタル酸、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド還元型とともにＬ−グルタミ
ン酸脱水素酵素４に作用させることにより、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド還元型を消費させ、次に
ピルビン酸とともにＬ−乳酸脱水素酵素５に作用させ
の反応で消費されずに残ったニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド還元型に対応する量のＬ−乳酸を生成さ
せ、さらに前記生成したＬ−乳酸をＬ−乳酸酸化酵素
６に作用させ、Ｌ−乳酸酸化酵素によりＬ−乳酸が酸化
される際に増加または減少する電極活性物質を検知する
ことによる、アンモニア測定方法。
なアンモニアの測定方法および測定装置に関する。 【構成】試料液をα−ケトグルタル酸、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド還元型とともにＬ−グルタミ
ン酸脱水素酵素４に作用させることにより、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド還元型を消費させ、次に
ピルビン酸とともにＬ−乳酸脱水素酵素５に作用させ
の反応で消費されずに残ったニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド還元型に対応する量のＬ−乳酸を生成さ
せ、さらに前記生成したＬ−乳酸をＬ−乳酸酸化酵素
６に作用させ、Ｌ−乳酸酸化酵素によりＬ−乳酸が酸化
される際に増加または減少する電極活性物質を検知する
ことによる、アンモニア測定方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素反応を利用した迅
速かつ簡便なアンモニアの測定方法および測定装置に関
する。
速かつ簡便なアンモニアの測定方法および測定装置に関
する。
【０００２】
【従来の技術】アンモニアはアミノ酸や尿素の分解反応
や高分子化合物の脱アミノ反応によって得られる化合物
であり、その定量法にも各種の方法が知られている。ま
たアンモニアを測定することができれば、あらかじめ存
在するアンモニア量を測定し、脱アミノ反応とを組み合
わせて各種成分の定量を行うことができるためその利用
価値が高い。
や高分子化合物の脱アミノ反応によって得られる化合物
であり、その定量法にも各種の方法が知られている。ま
たアンモニアを測定することができれば、あらかじめ存
在するアンモニア量を測定し、脱アミノ反応とを組み合
わせて各種成分の定量を行うことができるためその利用
価値が高い。
【０００３】アンモニアの定量法としては、インドフェ
ノール青による比色法が知られている。この方法では
酸、アルカリや金属イオン等を使用するため危険な操作
があり、また廃液処理が困難であった。また最終検出手
段が比色法であるため、特に、食品等の濁りの多い試料
や着色した試料では抽出や脱色等の前処理が必要となり
測定操作が煩雑であった。
ノール青による比色法が知られている。この方法では
酸、アルカリや金属イオン等を使用するため危険な操作
があり、また廃液処理が困難であった。また最終検出手
段が比色法であるため、特に、食品等の濁りの多い試料
や着色した試料では抽出や脱色等の前処理が必要となり
測定操作が煩雑であった。
【０００４】また近年、酵素を使用するアンモニア定量
方法が提案されている。この方法は酸、アルカリや金属
イオンを使用せず安全であり、また選択性も高いので多
く用いられている。なかでもα−ケトグルタル酸とニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（以下ＮＡＤ
Ｈと略す）を共存させグルタミン酸脱水素酵素（以下Ｇ
ＬＤＨと略す）を作用させ、ＮＡＤＨの減少による吸光
度の減少を測定するという方法が知られている。しか
し、この方法でも前述したとおり比色法による濁り、着
色等の問題があった。
方法が提案されている。この方法は酸、アルカリや金属
イオンを使用せず安全であり、また選択性も高いので多
く用いられている。なかでもα−ケトグルタル酸とニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（以下ＮＡＤ
Ｈと略す）を共存させグルタミン酸脱水素酵素（以下Ｇ
ＬＤＨと略す）を作用させ、ＮＡＤＨの減少による吸光
度の減少を測定するという方法が知られている。しか
し、この方法でも前述したとおり比色法による濁り、着
色等の問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、従来開
示されたアンモニアの測定方法では、充分実用的な測定
方法とは言い難い。本発明は、酵素反応と、電気化学的
検出器を利用することにより、アンモニアを簡便に測定
することができる測定装置および測定方法を提供するこ
とを目的とする。
示されたアンモニアの測定方法では、充分実用的な測定
方法とは言い難い。本発明は、酵素反応と、電気化学的
検出器を利用することにより、アンモニアを簡便に測定
することができる測定装置および測定方法を提供するこ
とを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の要旨は下記に示
す実施態様に例示されるが、これらに限定されるもので
はない。
す実施態様に例示されるが、これらに限定されるもので
はない。
【０００７】（１） 本発明は、試料液中のアンモニ
アをα−ケトグルタル酸、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド還元型とともにＬ−グルタミン酸脱水素酵素
に作用させることにより、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド還元型を消費させ、 次にピルビン酸とともにＬ−乳酸脱水素酵素（以下Ｌ
−ＬＤＨと略す）に作用させの工程で消費されずに残
ったニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型の量
に対応する量のＬ−乳酸を生成させ、 さらに生成した前記Ｌ−乳酸をＬ−乳酸酸化酵素（以
下ＬＯＤと略す）に作用させ、Ｌ−乳酸が酸化される際
に増加または減少する電極活性物質を検知することによ
る、アンモニア測定方法である。
アをα−ケトグルタル酸、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド還元型とともにＬ−グルタミン酸脱水素酵素
に作用させることにより、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド還元型を消費させ、 次にピルビン酸とともにＬ−乳酸脱水素酵素（以下Ｌ
−ＬＤＨと略す）に作用させの工程で消費されずに残
ったニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型の量
に対応する量のＬ−乳酸を生成させ、 さらに生成した前記Ｌ−乳酸をＬ−乳酸酸化酵素（以
下ＬＯＤと略す）に作用させ、Ｌ−乳酸が酸化される際
に増加または減少する電極活性物質を検知することによ
る、アンモニア測定方法である。
【０００８】（２） また、本発明は、Ｌ−乳酸脱水素
酵素固定化体、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体、及び前記Ｌ
−乳酸酸化酵素固定化体の作用により増加または減少す
る電極活性物質を検知する電極、を具備するニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド還元型の測定装置を開示す
る。
酵素固定化体、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体、及び前記Ｌ
−乳酸酸化酵素固定化体の作用により増加または減少す
る電極活性物質を検知する電極、を具備するニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド還元型の測定装置を開示す
る。
【０００９】（３） 本発明は、更にＬ−グルタミン酸
脱水素酵素固定化体を具備し、試料中のアンモニアを測
定することができる上記の測定装置を開示する。
脱水素酵素固定化体を具備し、試料中のアンモニアを測
定することができる上記の測定装置を開示する。
【００１０】（４） 試料中のアンモニアをα−ケト
グルタル酸、ＮＡＤＨとともにＧＬＤＨに作用させ（Ｎ
ＡＤＨを消費す）る機構、 前記反応液をピルビン酸とともにＬ−ＬＤＨに作用さ
せ（残ったＮＡＤＨに対応する量のＬ−乳酸を生成す）
る機構、 さらに前記反応液をＬＯＤ固定化体に作用させる機
構、 ＬＯＤにより試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加
または減少する電極活性物質を検知する電極、を具備す
る測定装置。
グルタル酸、ＮＡＤＨとともにＧＬＤＨに作用させ（Ｎ
ＡＤＨを消費す）る機構、 前記反応液をピルビン酸とともにＬ−ＬＤＨに作用さ
せ（残ったＮＡＤＨに対応する量のＬ−乳酸を生成す）
る機構、 さらに前記反応液をＬＯＤ固定化体に作用させる機
構、 ＬＯＤにより試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加
または減少する電極活性物質を検知する電極、を具備す
る測定装置。
【００１１】（５） （４）の測定装置において更にＬ
−ＬＤＨが固定化体である測定装置。
−ＬＤＨが固定化体である測定装置。
【００１２】（６） （５）の測定装置において更にＧ
ＬＤＨが固定化体であるアンモニア測定装置。
ＬＤＨが固定化体であるアンモニア測定装置。
【００１３】（７）基質酸化体とともに補酵素還元体を
脱水素酵素に作用させ補酵素還元体量に対応する量の基
質還元体を生成させ、更に生成した前記基質還元体を基
質還元体酸化酵素に作用させ、基質還元体が酸化される
際に増加または減少する電極活性物質を検知することに
よる補酵素還元体の測定方法。
脱水素酵素に作用させ補酵素還元体量に対応する量の基
質還元体を生成させ、更に生成した前記基質還元体を基
質還元体酸化酵素に作用させ、基質還元体が酸化される
際に増加または減少する電極活性物質を検知することに
よる補酵素還元体の測定方法。
【００１４】
【作用】本発明において利用するＧＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ
ならびにＬＯＤの酵素反応は以下のように示される。
ならびにＬＯＤの酵素反応は以下のように示される。
【００１５】ＧＬＤＨ反応：ＮＨ4 + ＋α−ケトグルタ
ル酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+→Ｌ−グルタミン酸＋Ｈ2 Ｏ＋Ｎ
ＡＤ+
ル酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+→Ｌ−グルタミン酸＋Ｈ2 Ｏ＋Ｎ
ＡＤ+
【００１６】Ｌ−ＬＤＨ反応：ピルビン酸＋ＮＡＤＨ＋
Ｈ+ →Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ+
Ｈ+ →Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ+
【００１７】ＬＯＤ反応：Ｌ−乳酸＋Ｏ2 →ピルビン酸
＋Ｈ2 Ｏ2
＋Ｈ2 Ｏ2
【００１８】まず、試料中のアンモニアからはα−ケト
グルタル酸とＮＡＤＨの存在下で、ＧＬＤＨによりＬ−
グルタミン酸とＮＡＤが生成する。一方、ピルビン酸か
らはＮＡＤＨの存在下でＬ−ＬＤＨによりＬ−乳酸が生
成する（図３）。
グルタル酸とＮＡＤＨの存在下で、ＧＬＤＨによりＬ−
グルタミン酸とＮＡＤが生成する。一方、ピルビン酸か
らはＮＡＤＨの存在下でＬ−ＬＤＨによりＬ−乳酸が生
成する（図３）。
【００１９】どちらの酵素もＮＡＤＨを消費する反応を
進行させる。測定においてはまず、一定濃度のＮＡＤＨ
を加えたアンモニアを含む試料をα−ケトグルタル酸の
存在下で、ＧＬＤＨに作用させる。この反応によりＮＨ
4 +量に対応した量のＮＡＤＨが消費される。次に、残
存するＮＡＤＨをピルビン酸の存在下でＬ−ＬＤＨに作
用させてＬ−乳酸を生成させる。生成したＬ−乳酸の量
はＬＯＤ反応を用いて測定出来る。Ｌ−乳酸は溶存酸素
とともにＬＯＤの作用で、ピルビン酸と過酸化水素にな
る。
進行させる。測定においてはまず、一定濃度のＮＡＤＨ
を加えたアンモニアを含む試料をα−ケトグルタル酸の
存在下で、ＧＬＤＨに作用させる。この反応によりＮＨ
4 +量に対応した量のＮＡＤＨが消費される。次に、残
存するＮＡＤＨをピルビン酸の存在下でＬ−ＬＤＨに作
用させてＬ−乳酸を生成させる。生成したＬ−乳酸の量
はＬＯＤ反応を用いて測定出来る。Ｌ−乳酸は溶存酸素
とともにＬＯＤの作用で、ピルビン酸と過酸化水素にな
る。
【００２０】この際の減少した酸素量或いは生成した過
酸化水素量を電気化学的に検出すれば、Ｌ−乳酸生成量
を求めることができる。このＬ−乳酸生成量は、ＧＬＤ
Ｈ反応後の残存ＮＡＤＨ量と対応しているから、ＮＡＤ
Ｈの消費量を求めることが出来る。このＮＡＤＨ消費量
はアンモニア量に対応しているから、ＬＯＤ反応におけ
る電極活性物質の測定からアンモニアの定量を行うこと
が可能となる。
酸化水素量を電気化学的に検出すれば、Ｌ−乳酸生成量
を求めることができる。このＬ−乳酸生成量は、ＧＬＤ
Ｈ反応後の残存ＮＡＤＨ量と対応しているから、ＮＡＤ
Ｈの消費量を求めることが出来る。このＮＡＤＨ消費量
はアンモニア量に対応しているから、ＬＯＤ反応におけ
る電極活性物質の測定からアンモニアの定量を行うこと
が可能となる。
【００２１】酵素の使用法は溶液法、固定化法のどちら
で使用してもよい。溶液法の場合は各々の酵素において
必要な活性量を、各々の酵素の最適条件で使用すること
ができるという利点がある。一方固定化法では多くの試
料を同一条件で測定することが簡単にでき、しかも酵素
の繰り返し利用ができるという利点がある。本発明のよ
うに３種類の酵素反応を連続して行う場合は、固定化酵
素と溶液酵素をとりまぜて使用することもできる。この
場合理論的にはどの段階を固定化してもかまわないが、
実用上は反応の前処理的な使用法で溶液酵素を加える形
になるので、反応の前段階は溶液法、後段階は固定化法
という方法が使用しやすい。
で使用してもよい。溶液法の場合は各々の酵素において
必要な活性量を、各々の酵素の最適条件で使用すること
ができるという利点がある。一方固定化法では多くの試
料を同一条件で測定することが簡単にでき、しかも酵素
の繰り返し利用ができるという利点がある。本発明のよ
うに３種類の酵素反応を連続して行う場合は、固定化酵
素と溶液酵素をとりまぜて使用することもできる。この
場合理論的にはどの段階を固定化してもかまわないが、
実用上は反応の前処理的な使用法で溶液酵素を加える形
になるので、反応の前段階は溶液法、後段階は固定化法
という方法が使用しやすい。
【００２２】具体的には、すべて溶液酵素、ＬＯＤ
のみが固定化酵素、ＧＬＤＨのみが溶液酵素であり、
Ｌ−ＬＤＨとＬＯＤは固定化酵素、すべて固定化酵素
の４種類が例示できる。ただし、どの場合もそれぞれの
酵素反応が終了した後、次の酵素反応を開始しないとリ
サイクル反応をおこしたり、反応が定量的に進まないこ
とが考えられる。そのため、酵素を固定化して用いる場
合は、それぞれの酵素を固定化した担体を別々のリアク
ターに充填して配置することが好ましい。また溶液法で
は温度やｐＨを変化させ、先の酵素反応で用いた酵素を
失活させたり妨害が起らないよう活性を低くして用いれ
ばよい。また固定化酵素と溶液酵素を組み合わせる場合
も、固定化酵素に接触させる試料中の酵素の活性比を低
くしておき実際上妨害が起らないようにすることが出来
る。
のみが固定化酵素、ＧＬＤＨのみが溶液酵素であり、
Ｌ−ＬＤＨとＬＯＤは固定化酵素、すべて固定化酵素
の４種類が例示できる。ただし、どの場合もそれぞれの
酵素反応が終了した後、次の酵素反応を開始しないとリ
サイクル反応をおこしたり、反応が定量的に進まないこ
とが考えられる。そのため、酵素を固定化して用いる場
合は、それぞれの酵素を固定化した担体を別々のリアク
ターに充填して配置することが好ましい。また溶液法で
は温度やｐＨを変化させ、先の酵素反応で用いた酵素を
失活させたり妨害が起らないよう活性を低くして用いれ
ばよい。また固定化酵素と溶液酵素を組み合わせる場合
も、固定化酵素に接触させる試料中の酵素の活性比を低
くしておき実際上妨害が起らないようにすることが出来
る。
【００２３】固定化法で測定する場合、特に比活性の低
い酵素を使用する場合は、変換反応を完全に行うことは
測定時間がかかりすぎるため実用上好ましくない。その
場合でも標準液及び試料をそれぞれ同一条件下で反応さ
せて、検量線を作成し、或いは試料の測定を行えば得ら
れた検量線に代入することにより正しい測定値を得るこ
とができる。
い酵素を使用する場合は、変換反応を完全に行うことは
測定時間がかかりすぎるため実用上好ましくない。その
場合でも標準液及び試料をそれぞれ同一条件下で反応さ
せて、検量線を作成し、或いは試料の測定を行えば得ら
れた検量線に代入することにより正しい測定値を得るこ
とができる。
【００２４】当然、溶液法でも同じであるが、溶液法で
は酵素量の調節が簡単であるので、完全に反応が終了し
てから次の反応を行う方が実用上操作が簡単である。
は酵素量の調節が簡単であるので、完全に反応が終了し
てから次の反応を行う方が実用上操作が簡単である。
【００２５】酵素の固定化法は、特に限定されず、吸着
法、化学結合法、包括法等を用いることができる。中で
も強固な固定化体を作成できる化学結合法が望ましい。
固定化に用いる担体にはケイソウ土、シリカゲル、ガラ
スビーズ、アルミナ、セラミック、カーボン、活性炭、
モレキュラーシーブ、シリコンゴム、セルロース、アガ
ロース、アミノ酸系ポリマー等が使用できる。化学結合
法としては、担体表面にアミノシラン化試薬でアミノ基
を導入し、さらにグルタルアルデヒド等の多官能性アル
デヒドを用いてホルミル化を行った後、酵素を接触させ
て固定化する方法が例示できる。
法、化学結合法、包括法等を用いることができる。中で
も強固な固定化体を作成できる化学結合法が望ましい。
固定化に用いる担体にはケイソウ土、シリカゲル、ガラ
スビーズ、アルミナ、セラミック、カーボン、活性炭、
モレキュラーシーブ、シリコンゴム、セルロース、アガ
ロース、アミノ酸系ポリマー等が使用できる。化学結合
法としては、担体表面にアミノシラン化試薬でアミノ基
を導入し、さらにグルタルアルデヒド等の多官能性アル
デヒドを用いてホルミル化を行った後、酵素を接触させ
て固定化する方法が例示できる。
【００２６】固定化酵素の形態は、電極表面の膜上に固
定化する方法、担体に固定化しカラム等のリアクターに
充填する方法、膜や中空糸を利用したリアクター等が考
えられる。なかでもカラムに固定化した担体を充填する
方法は、電極表面に固定化する場合に比べ固定化できる
酵素量を多くすることができ、反応に十分な量の酵素を
簡単に固定化することができる。またカラムの素材は、
アクリル樹脂、フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂、ガラスや
ステンレス等の金属等あるいはこれらを組み合せたもの
を用いることができる。
定化する方法、担体に固定化しカラム等のリアクターに
充填する方法、膜や中空糸を利用したリアクター等が考
えられる。なかでもカラムに固定化した担体を充填する
方法は、電極表面に固定化する場合に比べ固定化できる
酵素量を多くすることができ、反応に十分な量の酵素を
簡単に固定化することができる。またカラムの素材は、
アクリル樹脂、フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂、ガラスや
ステンレス等の金属等あるいはこれらを組み合せたもの
を用いることができる。
【００２７】ＬＯＤを用いたＬ−乳酸の定量には、減少
した酸素または増加した過酸化水素等を検出すればよ
い。また、ジクロロインドフェノール、フェリシアン化
カリウム、ベンゾキノンなどの電子伝達体、所謂メディ
エーター等を介在させ測定することもできる。酸素、過
酸化水素等の電極活性物質の増減を電極によって電流値
に変換して測定する電気化学的測定法は分光光度計を用
いる測定と比較して試料の濁りや、着色物質に影響され
ず、操作が簡単であり好ましい。
した酸素または増加した過酸化水素等を検出すればよ
い。また、ジクロロインドフェノール、フェリシアン化
カリウム、ベンゾキノンなどの電子伝達体、所謂メディ
エーター等を介在させ測定することもできる。酸素、過
酸化水素等の電極活性物質の増減を電極によって電流値
に変換して測定する電気化学的測定法は分光光度計を用
いる測定と比較して試料の濁りや、着色物質に影響され
ず、操作が簡単であり好ましい。
【００２８】電気化学的測定法において使用する酸素電
極は、カルバニ型、クラーク型等各種公知のものを利用
できる。過酸化水素電極としては、アノード基体に炭
素、白金、ニッケル、パラジウム等を用い、カソード側
に銀等を用いた公知のものを利用できる。一般にアノー
ドとしては、過酸化水素に対する過電圧が低く高感度が
得られるという理由から白金を用いることが多い。そし
て電極表面にポリシロキサン膜、アクリル樹脂膜、蛋白
膜、アセチルセルロース膜等の選択透過膜を有している
形式の電極が妨害物除去の観点から望ましい。電極系は
作用電極、対極より構成される２電極の過酸化水素電極
や酸素電極が利用できる。また安定性、精度の点からは
作用電極、参照電極、対極より構成される３電極のもの
が好ましい。
極は、カルバニ型、クラーク型等各種公知のものを利用
できる。過酸化水素電極としては、アノード基体に炭
素、白金、ニッケル、パラジウム等を用い、カソード側
に銀等を用いた公知のものを利用できる。一般にアノー
ドとしては、過酸化水素に対する過電圧が低く高感度が
得られるという理由から白金を用いることが多い。そし
て電極表面にポリシロキサン膜、アクリル樹脂膜、蛋白
膜、アセチルセルロース膜等の選択透過膜を有している
形式の電極が妨害物除去の観点から望ましい。電極系は
作用電極、対極より構成される２電極の過酸化水素電極
や酸素電極が利用できる。また安定性、精度の点からは
作用電極、参照電極、対極より構成される３電極のもの
が好ましい。
【００２９】反応系に用いるＮＡＤＨの使用方法として
は、あらかじめ試料に添加しておくことができる。また
α−ケトグルタル酸とピルビン酸の使用方法は試料に添
加してもよいし、ＧＬＤＨおよびＬ−ＬＤＨを固定化し
て使用する場合はキャリヤーに添加してもよい。試料に
添加する場合、例えばα−ケトグルタル酸は２ｍＭから
１０ｍＭ、ピルビン酸は２ｍＭから１０ｍＭ程度が好ま
しく、この方法は試料数が少ない場合に適している。ま
た、フロー方式でキャリヤーに添加する場合は例えばα
−ケトグルタル酸の濃度は０．５ｍＭから５ｍＭ程度、
ピルビン酸で０．５ｍＭから５ｍＭ程度が好ましい。こ
の方法は試料数が多い場合に適している。またＮＡＤＨ
の濃度はアンモニアによって消費しつくされない程度で
あり、かつＬ−乳酸の定量範囲である必要があるので例
えば１０ｍＭ程度が好ましい。
は、あらかじめ試料に添加しておくことができる。また
α−ケトグルタル酸とピルビン酸の使用方法は試料に添
加してもよいし、ＧＬＤＨおよびＬ−ＬＤＨを固定化し
て使用する場合はキャリヤーに添加してもよい。試料に
添加する場合、例えばα−ケトグルタル酸は２ｍＭから
１０ｍＭ、ピルビン酸は２ｍＭから１０ｍＭ程度が好ま
しく、この方法は試料数が少ない場合に適している。ま
た、フロー方式でキャリヤーに添加する場合は例えばα
−ケトグルタル酸の濃度は０．５ｍＭから５ｍＭ程度、
ピルビン酸で０．５ｍＭから５ｍＭ程度が好ましい。こ
の方法は試料数が多い場合に適している。またＮＡＤＨ
の濃度はアンモニアによって消費しつくされない程度で
あり、かつＬ−乳酸の定量範囲である必要があるので例
えば１０ｍＭ程度が好ましい。
【００３０】送液されるキャリヤーとしては例えば固定
化酵素に適したｐＨであるｐＨ７付近で緩衝能があり、
電極に電気化学的な影響を及ばさないリン酸塩等の緩衝
液が用いられる。また、ＧＬＤＨの反応ではｐＨ８．５
付近のグリシン緩衝液を使用することができる。
化酵素に適したｐＨであるｐＨ７付近で緩衝能があり、
電極に電気化学的な影響を及ばさないリン酸塩等の緩衝
液が用いられる。また、ＧＬＤＨの反応ではｐＨ８．５
付近のグリシン緩衝液を使用することができる。
【００３１】実際の測定における濃度の算出方法は、一
定濃度のＮＡＤＨを含むアンモニアの標準液により検量
線を作成し、試料にも同濃度のＮＡＤＨを添加し検量線
にあてはめて定量する。このとき、アンモニアが多いほ
ど検出値は低くなり、ＮＡＤＨのみの場合が最大値を示
す。また、この検出方法では最終物質がＬ−乳酸である
ので試料にＬ−乳酸が含まれている場合は元来試料中に
含まれていたＬ−乳酸の量を差し引かなければならな
い。元来試料中に含まれていたＬ−乳酸の検出には、本
発明の装置を利用してＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの反応段階
を省き、ＬＯＤ反応により電気化学的に測定することが
できる。
定濃度のＮＡＤＨを含むアンモニアの標準液により検量
線を作成し、試料にも同濃度のＮＡＤＨを添加し検量線
にあてはめて定量する。このとき、アンモニアが多いほ
ど検出値は低くなり、ＮＡＤＨのみの場合が最大値を示
す。また、この検出方法では最終物質がＬ−乳酸である
ので試料にＬ−乳酸が含まれている場合は元来試料中に
含まれていたＬ−乳酸の量を差し引かなければならな
い。元来試料中に含まれていたＬ−乳酸の検出には、本
発明の装置を利用してＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの反応段階
を省き、ＬＯＤ反応により電気化学的に測定することが
できる。
【００３２】図３は、本発明の酵素反応を示す。本発明
は、（Ａ）で示すＬ−グルタミン酸脱水素酵素によるＮ
ＡＤＨの消費反応と（Ｂ）で示すＮＡＤＨの測定反応と
からなっている。以上の説明は、図３（Ｂ）の反応が補
酵素還元体，基質酸化体，脱水素酵素，基質還元体が、
それぞれＮＡＤＨ，ピルビン酸，Ｌ−乳酸脱水素酵素，
Ｌ−乳酸である脱水素酵素反応と、基質還元体，基質酸
化体，酸化酵素がＬ−乳酸，ピルビン酸，Ｌ−乳酸酸化
酵素である酸化酵素反応を組み合わせたものについてで
ある。
は、（Ａ）で示すＬ−グルタミン酸脱水素酵素によるＮ
ＡＤＨの消費反応と（Ｂ）で示すＮＡＤＨの測定反応と
からなっている。以上の説明は、図３（Ｂ）の反応が補
酵素還元体，基質酸化体，脱水素酵素，基質還元体が、
それぞれＮＡＤＨ，ピルビン酸，Ｌ−乳酸脱水素酵素，
Ｌ−乳酸である脱水素酵素反応と、基質還元体，基質酸
化体，酸化酵素がＬ−乳酸，ピルビン酸，Ｌ−乳酸酸化
酵素である酸化酵素反応を組み合わせたものについてで
ある。
【００３３】同様の測定は例えば、補酵素還元体，基質
酸化体，脱水素酵素，基質還元体が、それぞれＮＡＤ
Ｈ，アセトアルデヒド，アルコール脱水素酵素，エタノ
ールである脱水素酵素反応と、基質還元体，基質酸化
体，酸化酵素がエタノール，アセテトアルデヒド，アル
コール酸化酵素である酸化酵素反応を組み合わせて行う
ことができる。また、図３（Ａ）の反応ではＬ−グルタ
ミン酸脱水素酵素反応を利用しているが、アンモニアが
関与する各種アミノ酸脱水素酵素反応及び対応する２−
オキソ酸を利用することができる。ただし、反応（Ａ）
と反応（Ｂ）では補酵素が一致している必要がある。
酸化体，脱水素酵素，基質還元体が、それぞれＮＡＤ
Ｈ，アセトアルデヒド，アルコール脱水素酵素，エタノ
ールである脱水素酵素反応と、基質還元体，基質酸化
体，酸化酵素がエタノール，アセテトアルデヒド，アル
コール酸化酵素である酸化酵素反応を組み合わせて行う
ことができる。また、図３（Ａ）の反応ではＬ−グルタ
ミン酸脱水素酵素反応を利用しているが、アンモニアが
関与する各種アミノ酸脱水素酵素反応及び対応する２−
オキソ酸を利用することができる。ただし、反応（Ａ）
と反応（Ｂ）では補酵素が一致している必要がある。
【００３４】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさら
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。
【００３５】実施例１ 図１に示すフロー型測定装置にＧＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ、
ＬＯＤのそれぞれを固定化したカラム、過酸化水素電極
（７）を配置し、送液するキャリヤー中にα−ケトグル
タル酸とピルビン酸を添加してアンモニアの検量線を作
成した。
ＬＯＤのそれぞれを固定化したカラム、過酸化水素電極
（７）を配置し、送液するキャリヤー中にα−ケトグル
タル酸とピルビン酸を添加してアンモニアの検量線を作
成した。
【００３６】〔１〕ＧＬＤＨカラムの製造 焼成したケイソウ土である耐火レンガ（３０〜６０メッ
シュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸
漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうして
アミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒド
に１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ
７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換
え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル
化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液にＧＬＤＨ（ベーリンガー社製）を１００
０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接
触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固
定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのアクリル製
のカラムに充填しＧＬＤＨ固定化カラムとした。
シュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸
漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうして
アミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒド
に１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ
７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換
え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル
化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液にＧＬＤＨ（ベーリンガー社製）を１００
０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接
触させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固
定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのアクリル製
のカラムに充填しＧＬＤＨ固定化カラムとした。
【００３７】〔２〕Ｌ−ＬＤＨ固定化カラムの製造 焼成したケイソウ土である耐火レンガ（３０〜６０メッ
シュ）１５０ｍｇを用いて〔１〕と同様にホルミル化
し、ｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に
Ｌ−ＬＤＨ（ベーリンガー社製）を２５０ユニット／ｍ
ｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触させ、０〜４
℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径
３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのアクリル製のカラムに充填
しＬ−ＬＤＨ固定化カラムとした。
シュ）１５０ｍｇを用いて〔１〕と同様にホルミル化
し、ｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に
Ｌ−ＬＤＨ（ベーリンガー社製）を２５０ユニット／ｍ
ｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触させ、０〜４
℃で１日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径
３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのアクリル製のカラムに充填
しＬ−ＬＤＨ固定化カラムとした。
【００３８】〔３〕ＬＯＤ固定化カラムの製造 焼成したケイソウ土である耐火レンガ（３０〜６０メッ
シュ）１５０ｍｇを用いて〔１〕と同様にホルミル化
し、ｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に
ＬＯＤ（シグマ社製）５０ユニット／ｍｌの濃度で溶解
した溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し
固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長
さ３０ｍｍのアクリル製のカラムに充填しＬＯＤ固定化
カラムとした。
シュ）１５０ｍｇを用いて〔１〕と同様にホルミル化
し、ｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に
ＬＯＤ（シグマ社製）５０ユニット／ｍｌの濃度で溶解
した溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し
固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長
さ３０ｍｍのアクリル製のカラムに充填しＬＯＤ固定化
カラムとした。
【００３９】〔４〕過酸化水素電極の製造 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化して過酸化水素選択透過膜を形成し、これを過酸化
水素電極とした。
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化して過酸化水素選択透過膜を形成し、これを過酸化
水素電極とした。
【００４０】また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照
電極を用い、測定用セルから緩衝液を排出する配管の一
部を導電性の配管とし、これを対極として利用した。
電極を用い、測定用セルから緩衝液を排出する配管の一
部を導電性の配管とし、これを対極として利用した。
【００４１】〔５〕測定装置 図１に示すフロー型測定装置を用いた。まず、緩衝液槽
（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液し、サンプ
ラ（３）により試料５μｌを注入する。注入された試料
はまずＧＬＤＨ固定化カラム（４）を通過し、次にＬ−
ＬＤＨ固定化カラム（５）を通過する。最後にＬＯＤ固
定化カラム（６）を通過し、過酸化水素電極（７）で電
流値の変化が検出される。電極における電流値の変化は
検出器（８）により検出される。さらに信号をパーソナ
ルコンピュータ（１１）に送ることもできる。
（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液し、サンプ
ラ（３）により試料５μｌを注入する。注入された試料
はまずＧＬＤＨ固定化カラム（４）を通過し、次にＬ−
ＬＤＨ固定化カラム（５）を通過する。最後にＬＯＤ固
定化カラム（６）を通過し、過酸化水素電極（７）で電
流値の変化が検出される。電極における電流値の変化は
検出器（８）により検出される。さらに信号をパーソナ
ルコンピュータ（１１）に送ることもできる。
【００４２】キャリアーとして用いる緩衝液の組成は１
００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化カリウム、１
ｍＭアジ化ナトリウム、１ｍＭα−ケトグルタル酸、１
ｍＭピルビン酸を含みｐＨ７．０である。ポンプの流速
は１．０ｍｌ／分であった。
００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化カリウム、１
ｍＭアジ化ナトリウム、１ｍＭα−ケトグルタル酸、１
ｍＭピルビン酸を含みｐＨ７．０である。ポンプの流速
は１．０ｍｌ／分であった。
【００４３】〔６〕標準液の測定 〔５〕の測定装置に蒸留水、１、２、５、８ｍＭのＬ−
乳酸試料、２、５、８、１０ｍＭのＮＡＤＨ試料、それ
ぞれ１０ｍＭのＮＡＤＨを含む０、２、５、８、１０ｍ
Ｍのアンモニア試料を注入すると電極で得られた電流値
は表１のようになった。次の検量線が得られた。ただ
し、Ｙは電流値（ｎＡ）、Ｘは試料中の物質濃度（ｍ
Ｍ）とする。
乳酸試料、２、５、８、１０ｍＭのＮＡＤＨ試料、それ
ぞれ１０ｍＭのＮＡＤＨを含む０、２、５、８、１０ｍ
Ｍのアンモニア試料を注入すると電極で得られた電流値
は表１のようになった。次の検量線が得られた。ただ
し、Ｙは電流値（ｎＡ）、Ｘは試料中の物質濃度（ｍ
Ｍ）とする。
【００４４】
【表１】
【００４５】Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝２５．９０
Ｘ＋０．６ ＮＡＤＨ検量線 Ｙ＝１４．５８Ｘ−１．２ アンモニア検量線 Ｙ＝−３．５４Ｘ＋１４５．
６
Ｘ＋０．６ ＮＡＤＨ検量線 Ｙ＝１４．５８Ｘ−１．２ アンモニア検量線 Ｙ＝−３．５４Ｘ＋１４５．
６
【００４６】実施例２ 図２に示すＬＯＤ固定化カラム（２５）、過酸化水素電
極（２６）を配置したフロー型測定装置を用いた。あら
かじめ試料にα−ケトグルタル酸とＮＡＤＨを加えＧＬ
ＤＨに作用させ、次にピルビン酸を加えＬ−ＬＤＨに作
用させ生成したＬ−乳酸を前記フロー型測定装置で測定
することによりアンモニアの検量線を作成した。
極（２６）を配置したフロー型測定装置を用いた。あら
かじめ試料にα−ケトグルタル酸とＮＡＤＨを加えＧＬ
ＤＨに作用させ、次にピルビン酸を加えＬ−ＬＤＨに作
用させ生成したＬ−乳酸を前記フロー型測定装置で測定
することによりアンモニアの検量線を作成した。
【００４７】〔１〕ＬＯＤカラムの製造 実施例１の〔３〕と同様にＬＯＤを固定化した担体を作
成しカラムに充填した。
成しカラムに充填した。
【００４８】〔２〕過酸化水素電極の製造 実施例１の〔４〕と同様に過酸化水素電極を作成した。
【００４９】〔３〕測定装置 図２に示すフロー型測定装置を用いた。まず、緩衝液槽
（２１）より緩衝液をポンプ（２２）により送液し、サ
ンプラ（２３）により試料５μｌを注入する。注入され
た試料はＬＯＤ固定化カラム（２５）を通過し、過酸化
水素電極（２６）で電流値の変化が検出される。それぞ
れの電極で電流値の変化は検出器（２７）により検出さ
れる。さらに信号をパーソナルコンピュータ（３０）に
送ることもできる。
（２１）より緩衝液をポンプ（２２）により送液し、サ
ンプラ（２３）により試料５μｌを注入する。注入され
た試料はＬＯＤ固定化カラム（２５）を通過し、過酸化
水素電極（２６）で電流値の変化が検出される。それぞ
れの電極で電流値の変化は検出器（２７）により検出さ
れる。さらに信号をパーソナルコンピュータ（３０）に
送ることもできる。
【００５０】緩衝液の組成は１００ｍＭリン酸ナトリウ
ム、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウム、
を含みｐＨ７．０である。ポンプの流速は１．０ｍｌ／
分であった。
ム、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウム、
を含みｐＨ７．０である。ポンプの流速は１．０ｍｌ／
分であった。
【００５１】〔４〕ＧＬＤＨとの反応 ０、２、４、１０ｍＭのアンモニア標準液０．５ｍｌ
に、α−ケトグルタル酸２０ｍＭ、ＮＡＤＨ１６ｍＭ、
グリシン５０ｍＭ、ＧＬＤＨ１００Ｕ／ｍｌでｐＨ８．
５の溶液を０．５ｍｌ加えよく混和し３７℃で３０分放
置した。
に、α−ケトグルタル酸２０ｍＭ、ＮＡＤＨ１６ｍＭ、
グリシン５０ｍＭ、ＧＬＤＨ１００Ｕ／ｍｌでｐＨ８．
５の溶液を０．５ｍｌ加えよく混和し３７℃で３０分放
置した。
【００５２】〔５〕Ｌ−ＬＤＨとの反応 〔４〕の反応液１．０ｍｌにピルビン酸１０ｍＭ、リン
酸２００ｍＭ、Ｌ−ＬＤＨ５Ｕ／ｍｌでｐＨ７．０の溶
液を１ｍｌ加えよく混和し、室温で３０分放置した。
酸２００ｍＭ、Ｌ−ＬＤＨ５Ｕ／ｍｌでｐＨ７．０の溶
液を１ｍｌ加えよく混和し、室温で３０分放置した。
【００５３】〔６〕標準液の測定 〔３〕の測定装置に蒸留水、１、２、５ｍＭのＬ−乳
酸、最終濃度０、０．５、１、２．５ｍＭのアンモニア
と、それぞれ４ｍＭのＮＡＤＨを含む〔５〕の反応液を
注入すると電極で得られた電流値は表２のようになり、
次の検量線が得られた。ただし、Ｙは電流値（ｎＡ）、
Ｘは試料中の物質濃度（ｍＭ）とする。
酸、最終濃度０、０．５、１、２．５ｍＭのアンモニア
と、それぞれ４ｍＭのＮＡＤＨを含む〔５〕の反応液を
注入すると電極で得られた電流値は表２のようになり、
次の検量線が得られた。ただし、Ｙは電流値（ｎＡ）、
Ｘは試料中の物質濃度（ｍＭ）とする。
【００５４】
【表２】
【００５５】Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝ ３３．０
５Ｘ＋ ０．３ アンモニア検量線 Ｙ＝−３２．９９Ｘ＋１３
２．２
５Ｘ＋ ０．３ アンモニア検量線 Ｙ＝−３２．９９Ｘ＋１３
２．２
【００５６】
【発明の効果】本発明の測定装置を用いることにより、
アンモニアの測定が短時間で正確に簡単にできるように
なった。
アンモニアの測定が短時間で正確に簡単にできるように
なった。
【図１】図１は実施例１で用いたフロー型アンモニア測
定装置の図である。
定装置の図である。
【図２】図２は実施例２で用いたフロー型測定装置の図
である。
である。
【図３】図３は本発明の酵素反応を示す。（Ａ）はＬ−
グルタミン酸脱水素酵素反応を示し、（Ｂ）はＬ−乳酸
脱水素酵素反応とＬ−乳酸酸化酵素反応を示す。
グルタミン酸脱水素酵素反応を示し、（Ｂ）はＬ−乳酸
脱水素酵素反応とＬ−乳酸酸化酵素反応を示す。
１ 緩衝液槽 ２ ポンプ ３ サンプラ ４ ＧＬＤＨ固定化カラム ５ Ｌ−ＬＤＨ固定化カラム ６ ＬＯＤ固定化カラム ７ 過酸化水素電極 ８ 検出器 ９ シングルボードコンピュータ １０ ＲＳ２３２Ｃコード １１ パーソナルコンピュータ １２ サンプラ制御信号 １３ 送液ポンプ制御信号 １４ 廃液 ２１ 緩衝液槽 ２２ ポンプ ２３ サンプラ ２４ 恒温槽 ２５ ＬＯＤ固定化カラム ２６ 過酸化水素電極 ２７ 検出器 ２８ シングルボードコンピュータ ２９ ＲＳ２３２Ｃコード ３０ パーソナルコンピュータ ３１ サンプラ制御信号 ３２ 送液ポンプ制御信号 ３３ 廃液
Claims (3)
- 【請求項１】 試料液中のアンモニアをα−ケトグル
タル酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型
とともにＬ−グルタミン酸脱水素酵素に作用させること
により、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型
を消費させ、 次にピルビン酸とともにＬ−乳酸脱水素酵素に作用さ
せの工程で消費されずに残ったニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド還元型の量に対応する量のＬ−乳酸を
生成させ、 さらに生成した前記Ｌ−乳酸をＬ−乳酸酸化酵素に作
用させ、Ｌ−乳酸が酸化される際に増加または減少する
電極活性物質を検知することによる、アンモニア測定方
法。 - 【請求項２】 Ｌ−乳酸脱水素酵素固定化体、Ｌ−乳酸
酸化酵素固定化体、及び前記Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体
の作用により増加または減少する電極活性物質を検知す
る電極、を具備する測定装置。 - 【請求項３】 更にＬ−グルタミン酸脱水素酵素固定化
体を具備する請求項２記載のアンモニア測定装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5189952A JPH0739395A (ja) | 1993-07-30 | 1993-07-30 | アンモニア測定方法及び測定装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5189952A JPH0739395A (ja) | 1993-07-30 | 1993-07-30 | アンモニア測定方法及び測定装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0739395A true JPH0739395A (ja) | 1995-02-10 |
Family
ID=16249947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5189952A Pending JPH0739395A (ja) | 1993-07-30 | 1993-07-30 | アンモニア測定方法及び測定装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0739395A (ja) |
-
1993
- 1993-07-30 JP JP5189952A patent/JPH0739395A/ja active Pending
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