JPH0731461A - 酵素反応を用いる測定装置 - Google Patents
酵素反応を用いる測定装置Info
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- JPH0731461A JPH0731461A JP15754793A JP15754793A JPH0731461A JP H0731461 A JPH0731461 A JP H0731461A JP 15754793 A JP15754793 A JP 15754793A JP 15754793 A JP15754793 A JP 15754793A JP H0731461 A JPH0731461 A JP H0731461A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 グルタミン酸等の種々の物質を迅速且つ正確
に測定する酵素を使用した測定装置を提供する。 【構成】上流より、送液されるキャリヤー中へ試料を注
入する機構３、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素とＬ−乳酸
脱水素酵素を含む酵素固定化体６を内包するリアクタ
ー、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体７、及びＬ−乳酸酸化酵
素固定化体により試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増
加または減少する電極活性物質を検知する電極８、を具
備するフロー方式のＬ−グルタミン酸の測定装置。
に測定する酵素を使用した測定装置を提供する。 【構成】上流より、送液されるキャリヤー中へ試料を注
入する機構３、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素とＬ−乳酸
脱水素酵素を含む酵素固定化体６を内包するリアクタ
ー、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体７、及びＬ−乳酸酸化酵
素固定化体により試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増
加または減少する電極活性物質を検知する電極８、を具
備するフロー方式のＬ−グルタミン酸の測定装置。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、固定化酵素を利用した
迅速かつ簡便なＬ−グルタミン酸等の基質還元体の測定
装置に関する。
迅速かつ簡便なＬ−グルタミン酸等の基質還元体の測定
装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−グルタミン酸は食品のうまみ成分と
して良く知られているアミノ酸であり、各種の食品に含
有あるいは添加されている。Ｌ−グルタミン酸の測定法
には、アミノ酸分析計での測定や、ピログルタミン酸に
変換したのち有機溶媒で抽出し化学的に定量する方法
や、比色法等が多く用いられているが、前処理が面倒で
ある、測定装置が高価である等の問題があった。
して良く知られているアミノ酸であり、各種の食品に含
有あるいは添加されている。Ｌ−グルタミン酸の測定法
には、アミノ酸分析計での測定や、ピログルタミン酸に
変換したのち有機溶媒で抽出し化学的に定量する方法
や、比色法等が多く用いられているが、前処理が面倒で
ある、測定装置が高価である等の問題があった。
【０００３】一方酵素化学的にＬ−グルタミン酸を定量
する方法も考えられる、例えばＬ−グルタミン酸に作用
する酸化酵素としてＬ−グルタミン酸酸化酵素が知られ
ている。この酵素は、Ｌ−グルタミン酸と酸素より、α
−ケトグルタル酸とアンモニアと過酸化水素を生成す
る。この酵素と電極を組み合せるとＬ−グルタミン酸の
測定が可能となるはずである。しかし、Ｌ−グルタミン
酸酸化酵素の比活性が低く充分な感度を得ることは困難
である。また、基質濃度と生成する過酸化水素もしくは
減少する酸素の量に比例関係が成立する範囲が狭く、実
試料の希釈率が大きくなり、実用に適さないという問題
があった。
する方法も考えられる、例えばＬ−グルタミン酸に作用
する酸化酵素としてＬ−グルタミン酸酸化酵素が知られ
ている。この酵素は、Ｌ−グルタミン酸と酸素より、α
−ケトグルタル酸とアンモニアと過酸化水素を生成す
る。この酵素と電極を組み合せるとＬ−グルタミン酸の
測定が可能となるはずである。しかし、Ｌ−グルタミン
酸酸化酵素の比活性が低く充分な感度を得ることは困難
である。また、基質濃度と生成する過酸化水素もしくは
減少する酸素の量に比例関係が成立する範囲が狭く、実
試料の希釈率が大きくなり、実用に適さないという問題
があった。
【０００４】また、Ｌ−乳酸はみそ、しょうゆ、乳製品
等の発酵工程により製造される食品に多く含まれており
Ｌ−グルタミン酸と同時に測定する必要性が高い。Ｌ−
乳酸の測定法には各種の方法があるが、なかでもＬ−乳
酸酸化酵素（以下ＬＯＤと略す）を利用し酸素電極もし
くは過酸化水素電極と組み合せた方法が確立されてい
る。このような、食品中の代表的なアミノ酸と有機酸を
測定することは重要であるが、従来は独立して行われて
おり、測定操作が煩雑であった。
等の発酵工程により製造される食品に多く含まれており
Ｌ−グルタミン酸と同時に測定する必要性が高い。Ｌ−
乳酸の測定法には各種の方法があるが、なかでもＬ−乳
酸酸化酵素（以下ＬＯＤと略す）を利用し酸素電極もし
くは過酸化水素電極と組み合せた方法が確立されてい
る。このような、食品中の代表的なアミノ酸と有機酸を
測定することは重要であるが、従来は独立して行われて
おり、測定操作が煩雑であった。
【０００５】本願発明者等は脱水素酵素反応を利用して
試料中のＬ−グルタミン酸量に対応した量のＬ−乳酸を
得ることにより、Ｌ−グルタミン酸を測定する方法を提
案したが、溶液状態の脱水素酵素反応を利用する場合は
酵素を使い捨てにするために、繰り返し使用が出来ない
という難点があった。
試料中のＬ−グルタミン酸量に対応した量のＬ−乳酸を
得ることにより、Ｌ−グルタミン酸を測定する方法を提
案したが、溶液状態の脱水素酵素反応を利用する場合は
酵素を使い捨てにするために、繰り返し使用が出来ない
という難点があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の問題を
解決し、高速、高精度かつ安価なＬ−グルタミン酸等の
基質還元体を測定する装置を提供することを目的とす
る。
解決し、高速、高精度かつ安価なＬ−グルタミン酸等の
基質還元体を測定する装置を提供することを目的とす
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は下記に示す実施
態様に例示されるが、これらに限定されるものではな
い。
態様に例示されるが、これらに限定されるものではな
い。
【０００８】（１）試料中の基質還元体Ｘred に対応す
る量の第２の基質還元体Ｙred を生成させる機構ａ及び
第２の基質還元体Ｙred を測定する機構ｂを有する基質
還元体Ｘred の測定装置であり、前記機構ａが前記Ｘre
d と補酵素酸化体Ｃoxより基質酸化体Ｘoxと補酵素還元
体Ｃred を生成する反応を触媒する第１の脱水素酵素Ｅ
1 、及び補酵素還元体Ｃred と第２の基質酸化体Ｙoxよ
り第２の基質還元体Ｙred と補酵素酸化体Ｃoxを生成す
る第２の脱水素酵素Ｅ2 を固定化した酵素固定化体を有
するＸred の測定装置。
る量の第２の基質還元体Ｙred を生成させる機構ａ及び
第２の基質還元体Ｙred を測定する機構ｂを有する基質
還元体Ｘred の測定装置であり、前記機構ａが前記Ｘre
d と補酵素酸化体Ｃoxより基質酸化体Ｘoxと補酵素還元
体Ｃred を生成する反応を触媒する第１の脱水素酵素Ｅ
1 、及び補酵素還元体Ｃred と第２の基質酸化体Ｙoxよ
り第２の基質還元体Ｙred と補酵素酸化体Ｃoxを生成す
る第２の脱水素酵素Ｅ2 を固定化した酵素固定化体を有
するＸred の測定装置。
【０００９】（２） 酵素固定化体が、担体表面にアミ
ノシラン化試薬で処理を施し、担体表面に形成されたア
ミノ基に多官能性アルデヒドを結合させ、更に前記第１
の脱水素酵素と前記第２の脱水素酵素を固定化してなる
担体を内包するリアクターである上記の基質還元体Ｘre
d の測定装置。
ノシラン化試薬で処理を施し、担体表面に形成されたア
ミノ基に多官能性アルデヒドを結合させ、更に前記第１
の脱水素酵素と前記第２の脱水素酵素を固定化してなる
担体を内包するリアクターである上記の基質還元体Ｘre
d の測定装置。
【００１０】（３）Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素（以
下ＧＬＤＨと略す）とＬ−乳酸脱水素酵素（以下Ｌ−Ｌ
ＤＨと略す）を含む酵素固定化体、 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ
と略す）とピルビン酸と試料を前記酵素固定化体に接触
させる機構、及び 前記酵素固定化体と接触した試料中のＬ−乳酸を検出
するＬ−乳酸測定機構、を具備するＬ−グルタミン酸の
測定装置。
下ＧＬＤＨと略す）とＬ−乳酸脱水素酵素（以下Ｌ−Ｌ
ＤＨと略す）を含む酵素固定化体、 ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤ
と略す）とピルビン酸と試料を前記酵素固定化体に接触
させる機構、及び 前記酵素固定化体と接触した試料中のＬ−乳酸を検出
するＬ−乳酸測定機構、を具備するＬ−グルタミン酸の
測定装置。
【００１１】（４）上流より、送液されるキャリヤー中
へ試料を注入する機構、ＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨを含む酵
素固定化体を内包するリアクター、ＬＯＤ固定化体、及
びＬＯＤ固定化体の反応により増加または減少する電極
活性物質を検知する電極、を具備するフロー方式のＬ−
グルタミン酸の測定装置。
へ試料を注入する機構、ＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨを含む酵
素固定化体を内包するリアクター、ＬＯＤ固定化体、及
びＬＯＤ固定化体の反応により増加または減少する電極
活性物質を検知する電極、を具備するフロー方式のＬ−
グルタミン酸の測定装置。
【００１２】（５）上流より、送液されるキャリヤー中
へ試料を注入する機構、ＬＯＤ固定化体、ＬＯＤ固定化
体により試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加または
減少する電極活性物質を検知する電極、並びにＧＬＤＨ
とＬ−ＬＤＨを含む酵素固定化体を内包するリアクタ
ー、ＬＯＤ固定化体、及び増加または減少する電極活性
物質を検知する電極、を具備するフロー方式のＬ−乳酸
とＬ−グルタミン酸の測定装置。
へ試料を注入する機構、ＬＯＤ固定化体、ＬＯＤ固定化
体により試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加または
減少する電極活性物質を検知する電極、並びにＧＬＤＨ
とＬ−ＬＤＨを含む酵素固定化体を内包するリアクタ
ー、ＬＯＤ固定化体、及び増加または減少する電極活性
物質を検知する電極、を具備するフロー方式のＬ−乳酸
とＬ−グルタミン酸の測定装置。
【００１３】（６）上流より、送液されるキャリヤー中
へ試料を注入する機構、流路を２方向へ分流する機構、
一方の流路において、ＬＯＤ固定化体及びＬＯＤ固定化
体により試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加または
減少する電極活性物質を検知する電極、並びに他方の流
路においてＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨを含む酵素固定化体を
内包するリアクター、ＬＯＤ固定化体及び増加または減
少する電極活性物質を検知する電極、を具備するフロー
方式のＬ−乳酸とＬ−グルタミン酸の測定装置。
へ試料を注入する機構、流路を２方向へ分流する機構、
一方の流路において、ＬＯＤ固定化体及びＬＯＤ固定化
体により試料中のＬ−乳酸が酸化される際に増加または
減少する電極活性物質を検知する電極、並びに他方の流
路においてＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨを含む酵素固定化体を
内包するリアクター、ＬＯＤ固定化体及び増加または減
少する電極活性物質を検知する電極、を具備するフロー
方式のＬ−乳酸とＬ−グルタミン酸の測定装置。
【００１４】
【作用】本発明では機構ａにより、試料中のＬ−グルタ
ミン酸等の測定目的物質である基質還元体Ｘred に対応
した濃度のＬ−乳酸等の第２の基質還元体Ｙredに変換
し、機構ｂにより得られたＹred を測定し、測定目的物
質であるＸredの濃度を算出するものである。そして本
発明は機構ａにおいて、以下に説明する脱水素酵素反応
を酵素固定化体で行うことに大きな特徴を有する。
ミン酸等の測定目的物質である基質還元体Ｘred に対応
した濃度のＬ−乳酸等の第２の基質還元体Ｙredに変換
し、機構ｂにより得られたＹred を測定し、測定目的物
質であるＸredの濃度を算出するものである。そして本
発明は機構ａにおいて、以下に説明する脱水素酵素反応
を酵素固定化体で行うことに大きな特徴を有する。
【００１５】図３は本発明における酵素反応を示したも
のであるが、機構ａにおいては、脱水素酵素Ｅ1 及び脱
水素酵素Ｅ2 の反応が行われる。以下に脱水素酵素Ｅ1
がＬ−グルタミン酸脱水素酵素、脱水素酵素Ｅ2 がＬ−
乳酸脱水素酵素、基質還元体Ｘred がＬ−グルタミン
酸、補酵素酸化体ＣoxがＮＡＤ、基質還元体Ｙred がＬ
−乳酸である場合について例示する。
のであるが、機構ａにおいては、脱水素酵素Ｅ1 及び脱
水素酵素Ｅ2 の反応が行われる。以下に脱水素酵素Ｅ1
がＬ−グルタミン酸脱水素酵素、脱水素酵素Ｅ2 がＬ−
乳酸脱水素酵素、基質還元体Ｘred がＬ−グルタミン
酸、補酵素酸化体ＣoxがＮＡＤ、基質還元体Ｙred がＬ
−乳酸である場合について例示する。
【００１６】本発明において利用するＬ−グルタミン酸
脱水素酵素（ＧＬＤＨ）とＬ−乳酸脱水素酵素（Ｌ−Ｌ
ＤＨ）の酵素反応は以下のように示される。
脱水素酵素（ＧＬＤＨ）とＬ−乳酸脱水素酵素（Ｌ−Ｌ
ＤＨ）の酵素反応は以下のように示される。
【００１７】 ＧＬＤＨ反応：Ｌ−グルタミン酸＋Ｈ2 Ｏ＋ＮＡＤ+ →
α−ケトグルタル酸＋ＮＨ4 + ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
α−ケトグルタル酸＋ＮＨ4 + ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+
【００１８】Ｌ−ＬＤＨ反応：ピルビン酸＋ＮＡＤＨ＋
Ｈ+ →Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ+
Ｈ+ →Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ+
【００１９】まず、試料中のＬ−グルタミン酸はＮＡＤ
の存在下で、ＧＬＤＨによりα−ケトグルタル酸とアン
モニアとＮＡＤＨを生成する。次に生成したＮＡＤＨは
ピルビン酸の存在下でＬ−ＬＤＨによりＬ−乳酸が生成
し、ＮＡＤが再生される。この反応においてＧＬＤＨと
Ｌ−ＬＤＨの反応の平衡はともにＮＡＤＨを消費しＮＡ
Ｄを生成する方向に傾いている。そのため、Ｌ−グルタ
ミン酸に応答する量のＬ−乳酸を生成させる目的では、
ＧＬＤＨについては反応が不利な方向で用いているが、
生成したＮＡＤＨをＬ−ＬＤＨによりピルビン酸を消費
してＮＡＤに戻すことにより反応を進行させることがで
きる。
の存在下で、ＧＬＤＨによりα−ケトグルタル酸とアン
モニアとＮＡＤＨを生成する。次に生成したＮＡＤＨは
ピルビン酸の存在下でＬ−ＬＤＨによりＬ−乳酸が生成
し、ＮＡＤが再生される。この反応においてＧＬＤＨと
Ｌ−ＬＤＨの反応の平衡はともにＮＡＤＨを消費しＮＡ
Ｄを生成する方向に傾いている。そのため、Ｌ−グルタ
ミン酸に応答する量のＬ−乳酸を生成させる目的では、
ＧＬＤＨについては反応が不利な方向で用いているが、
生成したＮＡＤＨをＬ−ＬＤＨによりピルビン酸を消費
してＮＡＤに戻すことにより反応を進行させることがで
きる。
【００２０】つまり、ＮＡＤとピルビン酸の存在下で、
ＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨにＬ−グルタミン酸を作用させる
とＬ−グルタミン酸と生成するＬ−乳酸の間に直線関係
が成立する範囲が認められ、Ｌ−グルタミン酸の定量が
できることがわかった。
ＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨにＬ−グルタミン酸を作用させる
とＬ−グルタミン酸と生成するＬ−乳酸の間に直線関係
が成立する範囲が認められ、Ｌ−グルタミン酸の定量が
できることがわかった。
【００２１】ＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化体に試料が
接触する際に、試料中にＬ−乳酸が共存する場合は、Ｌ
−ＬＤＨの作用によりＮＡＤＨ及びピルビン酸が生成す
ることも考えられる。しかしこの反応は著しくＬ−乳酸
が生成する方向に傾いており共存するＬ−乳酸は測定に
影響を及ぼさない。また大過剰なα−ケトグルタル酸及
びアンモニアが同時に存在すると反応は阻害されるが実
試料でこのような例は稀であり、従って実際の測定にお
いてこのような影響は無視できることがわかった。
接触する際に、試料中にＬ−乳酸が共存する場合は、Ｌ
−ＬＤＨの作用によりＮＡＤＨ及びピルビン酸が生成す
ることも考えられる。しかしこの反応は著しくＬ−乳酸
が生成する方向に傾いており共存するＬ−乳酸は測定に
影響を及ぼさない。また大過剰なα−ケトグルタル酸及
びアンモニアが同時に存在すると反応は阻害されるが実
試料でこのような例は稀であり、従って実際の測定にお
いてこのような影響は無視できることがわかった。
【００２２】次にＬ−乳酸の定量を行う機構ｂについて
説明する。図３に示すように、基質還元体Ｙred は、酸
化酵素Ｅ3 の反応を利用して測定できる。以下に酸化酵
素Ｅ3 がＬ−乳酸酸化酵素であり、基質還元体Ｙred が
Ｌ−乳酸である場合について例示する。Ｌ−乳酸酸化酵
素（ＬＯＤ）の反応は次式に示される。 ＬＯＤ反応：Ｌ−乳酸＋Ｏ2 →ピルビン酸＋Ｈ2 Ｏ2
説明する。図３に示すように、基質還元体Ｙred は、酸
化酵素Ｅ3 の反応を利用して測定できる。以下に酸化酵
素Ｅ3 がＬ−乳酸酸化酵素であり、基質還元体Ｙred が
Ｌ−乳酸である場合について例示する。Ｌ−乳酸酸化酵
素（ＬＯＤ）の反応は次式に示される。 ＬＯＤ反応：Ｌ−乳酸＋Ｏ2 →ピルビン酸＋Ｈ2 Ｏ2
【００２３】ＬＯＤを用いたＬ−乳酸の定量には、分光
学的方法、電気化学的方法等が用いられる。電気化学的
方法においては、減少した酸素または増加した過酸化水
素等を検出する方法が例示できる。また、ジクロロイン
ドフェノール、フェリシアン化カリウム、ベンゾキノン
などの電子伝達体、所謂メディエーター等を介在させ測
定することもできる。酸素、過酸化水素等の電極活性物
質の増減を電極によって電流値に変換して測定する電気
化学的測定法は分光光度計を用いる測定と比較して試料
の濁りや、着色物質に影響されず、操作が簡単であり好
ましい。
学的方法、電気化学的方法等が用いられる。電気化学的
方法においては、減少した酸素または増加した過酸化水
素等を検出する方法が例示できる。また、ジクロロイン
ドフェノール、フェリシアン化カリウム、ベンゾキノン
などの電子伝達体、所謂メディエーター等を介在させ測
定することもできる。酸素、過酸化水素等の電極活性物
質の増減を電極によって電流値に変換して測定する電気
化学的測定法は分光光度計を用いる測定と比較して試料
の濁りや、着色物質に影響されず、操作が簡単であり好
ましい。
【００２４】消費された酸素を測定する酸素電極は、カ
ルバニ型、クラーク型等各種のものを利用できる。生成
する過酸化水素を測定する過酸化水素電極としては、ア
ノード基体に炭素、白金、ニッケル、パラジウム等を用
い、カソード側に銀等を用いたものを利用できる。一般
にアノードとしては、過酸化水素に対する過電圧が低く
高感度が得られるという理由から白金を用いることが多
い。そして電極表面にポリシロキサン膜、アクリル樹脂
膜、蛋白膜、アセチルセルロース膜等の選択透過膜を有
している形式の電極が妨害物除去の観点から望ましい。
ルバニ型、クラーク型等各種のものを利用できる。生成
する過酸化水素を測定する過酸化水素電極としては、ア
ノード基体に炭素、白金、ニッケル、パラジウム等を用
い、カソード側に銀等を用いたものを利用できる。一般
にアノードとしては、過酸化水素に対する過電圧が低く
高感度が得られるという理由から白金を用いることが多
い。そして電極表面にポリシロキサン膜、アクリル樹脂
膜、蛋白膜、アセチルセルロース膜等の選択透過膜を有
している形式の電極が妨害物除去の観点から望ましい。
【００２５】電極系は作用電極、対極より構成される２
電極の過酸化水素電極や酸素電極が利用できる。また安
定性、精度の点からは作用電極、参照電極、対極より構
成される３電極のものが好ましい。
電極の過酸化水素電極や酸素電極が利用できる。また安
定性、精度の点からは作用電極、参照電極、対極より構
成される３電極のものが好ましい。
【００２６】本発明において使用する酵素は固定化して
使用する。もちろん溶液で使用しても同様の反応が進行
するが、固定化して使用すると、酵素の繰り返し利用が
可能となることや、酵素の反応条件を調整し易い等の利
点がある。
使用する。もちろん溶液で使用しても同様の反応が進行
するが、固定化して使用すると、酵素の繰り返し利用が
可能となることや、酵素の反応条件を調整し易い等の利
点がある。
【００２７】酵素の固定化法は、特に限定されず、吸着
法、化学結合法、包括法等を用いることができる。中で
も強固な固定化体を作成できる化学結合法が望ましい。
固定化に用いる担体にはケイソウ土、シリカゲル、ガラ
スビーズ、アルミナ、セラミック、カーボン、活性炭、
モレキュラーシーブ、シリコンゴム、セルロース、アガ
ロース、アミノ酸系ポリマー等が使用できる。担体とし
ては天然のケイソウ土や、その造粒体、ケイソウ土を高
温処理した耐火煉瓦等が好ましい。化学結合法として
は、担体表面にアミノシラン化試薬でアミノ基を導入
し、さらにグルタルアルデヒド等の多官能性アルデヒド
を用いてホルミル化を行った後、酵素を接触させて固定
化する方法が例示できる。また、多官能性アルデヒドを
用いてホルミル化を行い、更に過剰の多官能性アルデヒ
ドを水洗等で除去した後に酵素を接触させて固定化する
方法が好ましい。
法、化学結合法、包括法等を用いることができる。中で
も強固な固定化体を作成できる化学結合法が望ましい。
固定化に用いる担体にはケイソウ土、シリカゲル、ガラ
スビーズ、アルミナ、セラミック、カーボン、活性炭、
モレキュラーシーブ、シリコンゴム、セルロース、アガ
ロース、アミノ酸系ポリマー等が使用できる。担体とし
ては天然のケイソウ土や、その造粒体、ケイソウ土を高
温処理した耐火煉瓦等が好ましい。化学結合法として
は、担体表面にアミノシラン化試薬でアミノ基を導入
し、さらにグルタルアルデヒド等の多官能性アルデヒド
を用いてホルミル化を行った後、酵素を接触させて固定
化する方法が例示できる。また、多官能性アルデヒドを
用いてホルミル化を行い、更に過剰の多官能性アルデヒ
ドを水洗等で除去した後に酵素を接触させて固定化する
方法が好ましい。
【００２８】アミノシラン化処理はγ−アミノプロピル
トリエトキシシラン、４−アミノブチルジメチルメトキ
シシラン、４−アミノブチルトリエトキシシラン等のア
ミノシラン化試薬で行う。通常アミノシラン化試薬は無
水ベンゼン、無水トルエン溶液として、これに担体を浸
漬することにより行う。多官能性アルデヒドとしてはグ
ルタルアルデヒド、グリオキザール、サクシニルジアル
デヒド等が例示できる。
トリエトキシシラン、４−アミノブチルジメチルメトキ
シシラン、４−アミノブチルトリエトキシシラン等のア
ミノシラン化試薬で行う。通常アミノシラン化試薬は無
水ベンゼン、無水トルエン溶液として、これに担体を浸
漬することにより行う。多官能性アルデヒドとしてはグ
ルタルアルデヒド、グリオキザール、サクシニルジアル
デヒド等が例示できる。
【００２９】酵素固定化体の形態は、電極表面の膜上に
固定化する方法、担体に固定化しカラム等のリアクター
に充填する方法、膜や中空糸を利用したリアクター等が
考えられる。なかでもカラムに固定化した担体を充填す
る方法は、電極表面に固定化する場合に比べ固定化でき
る酵素量を多くすることができ、反応に十分な量の酵素
を簡単に固定化することができる。またカラムの素材
は、アクリル、フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂、ガラスや
ステンレス等の金属等あるいはこれらを組み合せたもの
を用いることができる。
固定化する方法、担体に固定化しカラム等のリアクター
に充填する方法、膜や中空糸を利用したリアクター等が
考えられる。なかでもカラムに固定化した担体を充填す
る方法は、電極表面に固定化する場合に比べ固定化でき
る酵素量を多くすることができ、反応に十分な量の酵素
を簡単に固定化することができる。またカラムの素材
は、アクリル、フッ素樹脂、塩化ビニル樹脂、ガラスや
ステンレス等の金属等あるいはこれらを組み合せたもの
を用いることができる。
【００３０】本発明においてＬ−グルタミン酸からＬ−
乳酸への変換反応は、前記のＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの作
用によるため、ＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨはほぼ同時に試料
及びＮＡＤ及びピルビン酸に接触するように近接固定す
るのが好ましい。具体的には、ＧＬＤＨ固定化膜とＬ−
ＬＤＨ固定化膜を重ねる方法、ＧＬＤＨを固定化した担
体とＬ−ＬＤＨを固定化した担体を混合する方法、ＧＬ
ＤＨ溶液とＬ−ＬＤＨ溶液を混合後、担体又は膜に固定
化する方法等がある。なおＬＯＤについては、ＧＬＤＨ
やＬ−ＬＤＨとともに近接固定してもよいし、ＬＯＤ単
独で固定してもよい。
乳酸への変換反応は、前記のＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの作
用によるため、ＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨはほぼ同時に試料
及びＮＡＤ及びピルビン酸に接触するように近接固定す
るのが好ましい。具体的には、ＧＬＤＨ固定化膜とＬ−
ＬＤＨ固定化膜を重ねる方法、ＧＬＤＨを固定化した担
体とＬ−ＬＤＨを固定化した担体を混合する方法、ＧＬ
ＤＨ溶液とＬ−ＬＤＨ溶液を混合後、担体又は膜に固定
化する方法等がある。なおＬＯＤについては、ＧＬＤＨ
やＬ−ＬＤＨとともに近接固定してもよいし、ＬＯＤ単
独で固定してもよい。
【００３１】これらの固定化酵素や電極を用いて測定装
置を構築する場合、各反応段階を別々に行うこともでき
るが、キャリヤーを送液し、試料を注入する機構、ＧＬ
ＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化体、ＬＯＤ固定化体、電極の
順に配列したフロー型が実用上便利である。
置を構築する場合、各反応段階を別々に行うこともでき
るが、キャリヤーを送液し、試料を注入する機構、ＧＬ
ＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化体、ＬＯＤ固定化体、電極の
順に配列したフロー型が実用上便利である。
【００３２】ＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの反応に必要なＮＡ
Ｄとピルビン酸の供給方法としては試料に添加してもよ
いし、フロー方式の測定装置においてキャリヤーに添加
してもよい。試料に添加する場合、ＮＡＤの濃度は２ｍ
Ｍから２０ｍＭ、ピルビン酸は５ｍＭから５０ｍＭ程度
が好ましく、この方法は試料数が少ない場合に適してい
る。また、フロー方式で用いるキャリヤーに添加する場
合は常にＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化体とＮＡＤは接
触している状態にあり、試料に添加する場合より使用効
果が高いのでＮＡＤの濃度は０．１ｍＭから５ｍＭ、ピ
ルビン酸で０．１ｍＭから５ｍＭ程度が好ましい。この
方法は試料数が多い場合に適している。
Ｄとピルビン酸の供給方法としては試料に添加してもよ
いし、フロー方式の測定装置においてキャリヤーに添加
してもよい。試料に添加する場合、ＮＡＤの濃度は２ｍ
Ｍから２０ｍＭ、ピルビン酸は５ｍＭから５０ｍＭ程度
が好ましく、この方法は試料数が少ない場合に適してい
る。また、フロー方式で用いるキャリヤーに添加する場
合は常にＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化体とＮＡＤは接
触している状態にあり、試料に添加する場合より使用効
果が高いのでＮＡＤの濃度は０．１ｍＭから５ｍＭ、ピ
ルビン酸で０．１ｍＭから５ｍＭ程度が好ましい。この
方法は試料数が多い場合に適している。
【００３３】送液されるキャリヤーとしてはＧＬＤＨ、
Ｌ−ＬＤＨ、ＬＯＤに適したｐＨであるｐＨ７付近で緩
衝能があり、電極に電気化学的な影響を及ばさないリン
酸塩系緩衝液等が用いられる。
Ｌ−ＬＤＨ、ＬＯＤに適したｐＨであるｐＨ７付近で緩
衝能があり、電極に電気化学的な影響を及ばさないリン
酸塩系緩衝液等が用いられる。
【００３４】また、Ｌ−グルタミン酸を単独で測定する
場合は上記の方法で良いが、試料中にＬ−乳酸が存在す
る場合はＬ−グルタミン酸から生成したＬ−乳酸とあら
かじめ存在するＬ−乳酸の両方の和が検出されるので、
Ｌ−グルタミン酸とは別途に試料中に元来含まれていた
Ｌ−乳酸を定量しておく必要がある。そのためには、
機構ａと機構ｂを有する測定装置を用い、Ｌ−グルタミ
ン酸の測定とは別途に、ＮＡＤあるいはピルビン酸また
はその両方が無い状態でＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化
体に接触させ実質的に機構ａの作用を働かせずに機構ｂ
でＬ−乳酸のみを定量する方法、試料をＧＬＤＨとＬ
−ＬＤＨの固定化体に接触させる前に、機構ｂに作用さ
せることにより、例えばＬＯＤに接触させ、あらかじめ
Ｌ−乳酸を定量し、その後に機構ａ、第２の機構ｂへ導
いてＬ−グルタミン酸を測定する方法（図１の態様）。
流路を２方向に分流し、一方はそのまま機構ｂに導き
Ｌ−乳酸を測定し、他方は機構ａのＧＬＤＨとＬ−ＬＤ
Ｈの固定化体に接触させた後、第２の機構ｂに導きＬＯ
Ｄの固定化体に接触させＬ−乳酸を定量する方法（図２
の態様）等が例示できる。当然のことながら、、の
装置では試料を１回だけ注入すれば測定できるので分析
の高速化をさらに推進できる。の装置ではＬ−乳酸を
測定する操作と、ＮＡＤ及びピルビン酸存在下における
グルタミン酸測定の２回の操作が必要となる。
場合は上記の方法で良いが、試料中にＬ−乳酸が存在す
る場合はＬ−グルタミン酸から生成したＬ−乳酸とあら
かじめ存在するＬ−乳酸の両方の和が検出されるので、
Ｌ−グルタミン酸とは別途に試料中に元来含まれていた
Ｌ−乳酸を定量しておく必要がある。そのためには、
機構ａと機構ｂを有する測定装置を用い、Ｌ−グルタミ
ン酸の測定とは別途に、ＮＡＤあるいはピルビン酸また
はその両方が無い状態でＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化
体に接触させ実質的に機構ａの作用を働かせずに機構ｂ
でＬ−乳酸のみを定量する方法、試料をＧＬＤＨとＬ
−ＬＤＨの固定化体に接触させる前に、機構ｂに作用さ
せることにより、例えばＬＯＤに接触させ、あらかじめ
Ｌ−乳酸を定量し、その後に機構ａ、第２の機構ｂへ導
いてＬ−グルタミン酸を測定する方法（図１の態様）。
流路を２方向に分流し、一方はそのまま機構ｂに導き
Ｌ−乳酸を測定し、他方は機構ａのＧＬＤＨとＬ−ＬＤ
Ｈの固定化体に接触させた後、第２の機構ｂに導きＬＯ
Ｄの固定化体に接触させＬ−乳酸を定量する方法（図２
の態様）等が例示できる。当然のことながら、、の
装置では試料を１回だけ注入すれば測定できるので分析
の高速化をさらに推進できる。の装置ではＬ−乳酸を
測定する操作と、ＮＡＤ及びピルビン酸存在下における
グルタミン酸測定の２回の操作が必要となる。
【００３５】具体的には、図１及び図２に示すフロー型
装置が例示できる。図１は機構ｂ、機構ａ、第２の機構
ｂを直列につないだ直列型のＬ−グルタミン酸とＬ−乳
酸の測定装置である。まず、緩衝液槽（１）より緩衝液
をポンプ（２）により送液し、サンプラ（３）により試
料５μｌを注入する。注入された試料は機構ｂのＬＯＤ
固定化カラム（４）を通過し、Ｌ−乳酸より過酸化水素
が生成する。これを過酸化水素電極（５）による電流値
の変化を検出する。この電極を第１電極とする。次に機
構ａのＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化カラム（６）を通
過しＬ−グルタミン酸よりＬ−乳酸への変換反応を行
う。次に第２の機構ｂのＬＯＤ固定化カラム（７）を通
過し、過酸化水素電極（８）で電流値の変化が検出され
る。こちらを第２電極とする。これらのカラムと電極を
３０℃の恒温槽（９）中に設置する。それぞれの電極で
電流値の変化は検出器（１０）により検出される。さら
に信号をパーソナルコンピュータ（１２）に送ることも
できる。
装置が例示できる。図１は機構ｂ、機構ａ、第２の機構
ｂを直列につないだ直列型のＬ−グルタミン酸とＬ−乳
酸の測定装置である。まず、緩衝液槽（１）より緩衝液
をポンプ（２）により送液し、サンプラ（３）により試
料５μｌを注入する。注入された試料は機構ｂのＬＯＤ
固定化カラム（４）を通過し、Ｌ−乳酸より過酸化水素
が生成する。これを過酸化水素電極（５）による電流値
の変化を検出する。この電極を第１電極とする。次に機
構ａのＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化カラム（６）を通
過しＬ−グルタミン酸よりＬ−乳酸への変換反応を行
う。次に第２の機構ｂのＬＯＤ固定化カラム（７）を通
過し、過酸化水素電極（８）で電流値の変化が検出され
る。こちらを第２電極とする。これらのカラムと電極を
３０℃の恒温槽（９）中に設置する。それぞれの電極で
電流値の変化は検出器（１０）により検出される。さら
に信号をパーソナルコンピュータ（１２）に送ることも
できる。
【００３６】図２は機構ｂ及び機構ａと機構ｂを並列に
つないだ並列型のＬ−グルタミン酸とＬ−乳酸の測定装
置である。まず、緩衝液槽（２１）より緩衝液をポンプ
（２２）により送液し、サンプラ（２３）により試料５
μｌを注入する。注入された試料は三方ジョイント（２
４）で二方に分流される。一方は機構ｂのＬＯＤ固定化
カラム（２５）を通過し、Ｌ−乳酸より過酸化水素が生
成し、過酸化水素電極（２６）により電流値の変化を検
出する。この電極を第１電極とする。他方は機構ａのＧ
ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化カラム（２７）を通過しＬ
−グルタミン酸からＬ−乳酸への変換反応が起こる。次
に第２の機構ｂのＬＯＤ固定化カラム（２８）を通過
し、過酸化水素電極（２９）で電流値の変化が検出され
る。こちらを第２電極とする。これらのカラムと電極を
３０℃の恒温槽（３０）中に設置する。それぞれの電極
で電流値の変化は検出器（３１）により検出される。さ
らに信号をパーソナルコンピュータ（３４）に送ること
もできる。
つないだ並列型のＬ−グルタミン酸とＬ−乳酸の測定装
置である。まず、緩衝液槽（２１）より緩衝液をポンプ
（２２）により送液し、サンプラ（２３）により試料５
μｌを注入する。注入された試料は三方ジョイント（２
４）で二方に分流される。一方は機構ｂのＬＯＤ固定化
カラム（２５）を通過し、Ｌ−乳酸より過酸化水素が生
成し、過酸化水素電極（２６）により電流値の変化を検
出する。この電極を第１電極とする。他方は機構ａのＧ
ＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化カラム（２７）を通過しＬ
−グルタミン酸からＬ−乳酸への変換反応が起こる。次
に第２の機構ｂのＬＯＤ固定化カラム（２８）を通過
し、過酸化水素電極（２９）で電流値の変化が検出され
る。こちらを第２電極とする。これらのカラムと電極を
３０℃の恒温槽（３０）中に設置する。それぞれの電極
で電流値の変化は検出器（３１）により検出される。さ
らに信号をパーソナルコンピュータ（３４）に送ること
もできる。
【００３７】これらの場合、実際の測定には、まずＬ−
グルタミン酸とＬ−乳酸のそれぞれの標準液を測定し得
られた電流値より検量線を作成する。検量線１はＬ−乳
酸を注入した場合、第１電極で得られる電流値より作成
するＬ−乳酸の検量線である。検量線２はＬ−乳酸を注
入した場合に第２電極で得られる電流値より作成するＬ
−乳酸の検量線である。検量線３はＬ−グルタミン酸を
注入した場合の第２電極で得られる電流値より作成する
Ｌ−グルタミン酸の検量線である。このとき当然ながら
第１電極ではＬ−グルタミン酸を注入しても電流値は得
られない。
グルタミン酸とＬ−乳酸のそれぞれの標準液を測定し得
られた電流値より検量線を作成する。検量線１はＬ−乳
酸を注入した場合、第１電極で得られる電流値より作成
するＬ−乳酸の検量線である。検量線２はＬ−乳酸を注
入した場合に第２電極で得られる電流値より作成するＬ
−乳酸の検量線である。検量線３はＬ−グルタミン酸を
注入した場合の第２電極で得られる電流値より作成する
Ｌ−グルタミン酸の検量線である。このとき当然ながら
第１電極ではＬ−グルタミン酸を注入しても電流値は得
られない。
【００３８】実試料の測定の場合は、第１電極より得ら
れる電流値１と第２電極より得られる電流値２が得られ
る。
れる電流値１と第２電極より得られる電流値２が得られ
る。
【００３９】Ｌ−グルタミン酸量とＬ−乳酸量は以下に
例示する方法でそれぞれ計算できる。電流値１より検量
線１に代入しＬ−乳酸量を算出する。算出したＬ−乳酸
濃度を検量線２に代入し、電流値２に寄与するＬ−乳酸
の電流値を算出する。電流値２より電流値２に寄与する
Ｌ−乳酸電流値を差し引くとＬ−グルタミン酸に対する
電流値が求められる。このＬ−グルタミン酸寄与分の電
流値を検量線３に代入するとＬ−グルタミン酸量が算出
できる。
例示する方法でそれぞれ計算できる。電流値１より検量
線１に代入しＬ−乳酸量を算出する。算出したＬ−乳酸
濃度を検量線２に代入し、電流値２に寄与するＬ−乳酸
の電流値を算出する。電流値２より電流値２に寄与する
Ｌ−乳酸電流値を差し引くとＬ−グルタミン酸に対する
電流値が求められる。このＬ−グルタミン酸寄与分の電
流値を検量線３に代入するとＬ−グルタミン酸量が算出
できる。
【００４０】表１はＣoxの存在下で脱水素酵素Ｅ１によ
り基質還元体Ｘred を酸化し、基質酸化体Ｘoxを生成す
る反応を例示したものである。
り基質還元体Ｘred を酸化し、基質酸化体Ｘoxを生成す
る反応を例示したものである。
【００４１】
【表１】
【００４２】表２は生成したＣreｄの存在下で第２の基
質酸化体であるＹoxを添加し、第２の脱水素酵素Ｅ２を
作用させて、第２の基質還元体Ｙred を生成させる工程
を示す。またＹred を酸化する酸化酵素Ｅ３を作用させ
て、Ｚoxを生成させる反応の組み合わせを例示してい
る。このＥ３の反応を利用してＹredの定量を行うこと
が出来る。
質酸化体であるＹoxを添加し、第２の脱水素酵素Ｅ２を
作用させて、第２の基質還元体Ｙred を生成させる工程
を示す。またＹred を酸化する酸化酵素Ｅ３を作用させ
て、Ｚoxを生成させる反応の組み合わせを例示してい
る。このＥ３の反応を利用してＹredの定量を行うこと
が出来る。
【００４３】
【表２】
【００４４】測定する物質は、脱水素酵素Ｅ1 およびＥ
2 の組み合せにより自由に変えることができる。表１に
示したようにＥ１として各種の脱水素酵素を使用するこ
とができる。
2 の組み合せにより自由に変えることができる。表１に
示したようにＥ１として各種の脱水素酵素を使用するこ
とができる。
【００４５】例えば、グルタミン酸脱水素酵素を使用し
たグルタミン酸の測定、グリセロール脱水素酵素を使用
したグリセロールの測定、Ｌ−乳酸脱水素酵素を使用し
たＬ−乳酸の測定、アルコール脱水素酵素を使用したア
ルコールの測定、グルコース脱水素酵素を使用したグル
コースの測定、Ｄ−乳酸脱水素酵素を使用したＤ−乳酸
の測定等を例示できる。特にグルタミン酸測定、アルコ
ール測定は実用的な価値が高い。
たグルタミン酸の測定、グリセロール脱水素酵素を使用
したグリセロールの測定、Ｌ−乳酸脱水素酵素を使用し
たＬ−乳酸の測定、アルコール脱水素酵素を使用したア
ルコールの測定、グルコース脱水素酵素を使用したグル
コースの測定、Ｄ−乳酸脱水素酵素を使用したＤ−乳酸
の測定等を例示できる。特にグルタミン酸測定、アルコ
ール測定は実用的な価値が高い。
【００４６】また、表２に示したようにＥ１の反応系に
ピルビン酸とＬ−乳酸脱水素酵素を添加し、生成したＬ
−乳酸をＬ−乳酸酸化酵素を用いて測定することができ
る。またＥ１の反応系にアセトアルデヒドとアルコール
脱水素酵素を添加し、生成したエタノールをアルコール
酸化酵素を用いて測定することができる。更にＥ１反応
系にＤ−グルコノ−δ−ラクトンとＤ−グルコース脱水
素酵素を添加し、生成したＤ−グルコースをＤ−グルコ
ース酸化酵素を用いて測定することが出来る。
ピルビン酸とＬ−乳酸脱水素酵素を添加し、生成したＬ
−乳酸をＬ−乳酸酸化酵素を用いて測定することができ
る。またＥ１の反応系にアセトアルデヒドとアルコール
脱水素酵素を添加し、生成したエタノールをアルコール
酸化酵素を用いて測定することができる。更にＥ１反応
系にＤ−グルコノ−δ−ラクトンとＤ−グルコース脱水
素酵素を添加し、生成したＤ−グルコースをＤ−グルコ
ース酸化酵素を用いて測定することが出来る。
【００４７】尚、Ｅ１反応に組み合わせるＥ２反応は、
補酵素が一致するものを選ぶ。Ｅ２の要求する補酵素は
Ｅ１と共通していれば、ＮＡＤでもＮＡＤＰ（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸）でもよい。即
ち、試料に添加する補酵素がＮＡＤの場合、Ｅ2 とＥ1
はＮＡＤ応答性の脱水素酵素、補酵素がＮＡＤＰの場合
はＮＡＤＰ応答性の脱水素酵素でなければならない。
補酵素が一致するものを選ぶ。Ｅ２の要求する補酵素は
Ｅ１と共通していれば、ＮＡＤでもＮＡＤＰ（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸）でもよい。即
ち、試料に添加する補酵素がＮＡＤの場合、Ｅ2 とＥ1
はＮＡＤ応答性の脱水素酵素、補酵素がＮＡＤＰの場合
はＮＡＤＰ応答性の脱水素酵素でなければならない。
【００４８】次に、Ｅ２反応により生成したＹred をＥ
３反応を利用して定量する。このようにして最終的には
Ｘred の定量を行うことができる。勿論試料中に元来存
在していたＹredを測定する手法も同じである。
３反応を利用して定量する。このようにして最終的には
Ｘred の定量を行うことができる。勿論試料中に元来存
在していたＹredを測定する手法も同じである。
【００４９】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさら
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。
に詳細に説明するが、もちろん本発明はこれらに限定さ
れるものではない。
【００５０】実施例１ １）ＧＬＤＨとＬ−ＬＤＨの固定化カラムの製造 焼成したケイソウ土である耐火レンガ（６０〜８０メッ
シュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸
漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうして
アミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒド
に１時間浸漬してホルミル化する。その後、よく蒸留水
で洗浄し、最後にｐＨ７．０、１００ｍＭのリン酸ナト
リウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除い
ておく。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にＧＬＤＨ（ベーリ
ンガー社製）１０００ユニット／ｍｌ、Ｌ−ＬＤＨ（ベ
ーリンガー社製）１００ユニット／ｍｌの濃度で溶解し
た溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固
定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ
３０ｍｍのアクリル製のカラムに充填しＧＬＤＨとＬ−
ＬＤＨの固定化カラムとした。
シュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸
漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうして
アミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒド
に１時間浸漬してホルミル化する。その後、よく蒸留水
で洗浄し、最後にｐＨ７．０、１００ｍＭのリン酸ナト
リウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除い
ておく。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ７．０、
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にＧＬＤＨ（ベーリ
ンガー社製）１０００ユニット／ｍｌ、Ｌ−ＬＤＨ（ベ
ーリンガー社製）１００ユニット／ｍｌの濃度で溶解し
た溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固
定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ
３０ｍｍのアクリル製のカラムに充填しＧＬＤＨとＬ−
ＬＤＨの固定化カラムとした。
【００５１】２）ＬＯＤの固定化カラムの製造 焼成したケイソウ土である耐火レンガ（３０〜６０メッ
シュ）１５０ｍｇを用いて１）と同様にホルミル化し、
ｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にＬＯ
Ｄ（シグマ社製）５０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した
溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定
化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３
０ｍｍのアクリル製のカラムに充填しＬＯＤ固定化カラ
ムとした。
シュ）１５０ｍｇを用いて１）と同様にホルミル化し、
ｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にＬＯ
Ｄ（シグマ社製）５０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した
溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定
化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３
０ｍｍのアクリル製のカラムに充填しＬＯＤ固定化カラ
ムとした。
【００５２】３）過酸化水素電極の製造 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすり及び１５００番のエメリー紙で平
滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金板
を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ硫
酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その後
白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、１
０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トル
エン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミン
（シグマ社製、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）２０ｍｇを蒸留水
１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを０．２
％になるように加える。この混合液を手早く先に用意し
た白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥硬化し
て過酸化水素選択透過膜とし、これを過酸化水素電極と
した。
その線の一端をやすり及び１５００番のエメリー紙で平
滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金板
を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ硫
酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その後
白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、１
０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トル
エン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミン
（シグマ社製、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）２０ｍｇを蒸留水
１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを０．２
％になるように加える。この混合液を手早く先に用意し
た白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥硬化し
て過酸化水素選択透過膜とし、これを過酸化水素電極と
した。
【００５３】また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照
電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。
【００５４】４）測定装置 図１に示すフロー型測定装置を用いた。緩衝液の組成は
１００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化カリウム、
１ｍＭアジ化ナトリウム、１ｍＭＮＡＤ、１ｍＭピルビ
ン酸を含みｐＨ７．０である。ポンプの流速は０．７ｍ
ｌ／分であった。
１００ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化カリウム、
１ｍＭアジ化ナトリウム、１ｍＭＮＡＤ、１ｍＭピルビ
ン酸を含みｐＨ７．０である。ポンプの流速は０．７ｍ
ｌ／分であった。
【００５５】５）標準液の測定 ４）の測定装置に蒸留水、１、２、３ｍＭのＬ−乳酸、
１、２、３ｍＭのＬ−グルタミン酸を注入し、第１、第
２電極で得られた電流値は表１のようになり、次の検量
線が得られた。ただし、Ｙは電流値（ｎＡ）、Ｘは試料
中のＬ−乳酸濃度（ｍＭ）とする。
１、２、３ｍＭのＬ−グルタミン酸を注入し、第１、第
２電極で得られた電流値は表１のようになり、次の検量
線が得られた。ただし、Ｙは電流値（ｎＡ）、Ｘは試料
中のＬ−乳酸濃度（ｍＭ）とする。
【００５６】
【表３】
【００５７】 検量線１： 第１電極，Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝２１．４８Ｘ＋０．０ 検量線２： 第２電極，Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝２１．９５Ｘ−０．１ 検量線３： 第２電極，Ｌ−グルタミン酸検量線 Ｙ＝１３．６２Ｘ＋０．１
【００５８】６）混合試料の測定 ４）の測定装置にＬ−グルタミン酸、Ｌ−乳酸の混合液
を注入した。第１、第２電極で得られた電流値、標準液
測定により算出した検量線より算出したＬ−グルタミン
酸、Ｌ−乳酸の濃度は表２のようになった。
を注入した。第１、第２電極で得られた電流値、標準液
測定により算出した検量線より算出したＬ−グルタミン
酸、Ｌ−乳酸の濃度は表２のようになった。
【００５９】
【表４】
【００６０】
【発明の効果】本発明の測定装置を用いることにより、
Ｌ−グルタミン酸とＬ−乳酸等の測定が短時間で正確に
簡単にできるようになった。また、溶液のＧＬＤＨ、Ｌ
−ＬＤＨを使用したＬ−グルタミン酸とＬ−乳酸の測定
に比べ、本発明では酵素の繰り返し利用が可能となり、
酵素の反応条件を調整し易くなった。
Ｌ−グルタミン酸とＬ−乳酸等の測定が短時間で正確に
簡単にできるようになった。また、溶液のＧＬＤＨ、Ｌ
−ＬＤＨを使用したＬ−グルタミン酸とＬ−乳酸の測定
に比べ、本発明では酵素の繰り返し利用が可能となり、
酵素の反応条件を調整し易くなった。
【図１】図１は実施例１で用いたフロー型のＬ−グルタ
ミン酸とＬ−乳酸の測定装置である。
ミン酸とＬ−乳酸の測定装置である。
【図２】図２は本発明の他の態様を示す。
【図３】図３は本発明の酵素反応を示す。
１ 緩衝液槽 ２ ポンプ ３ サンプラ ４ ＬＯＤ固定化カラム ５ 過酸化水素電極（第１電極） ６ ＧＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化カラム ７ ＬＯＤ固定化カラム ８ 過酸化水素電極（第２電極） ９ 恒温槽 １０ 検出器 １１ シングルボードコンピュータ １２ パーソナルコンピュータ １３ ＲＳ２３２Ｃコード １４ サンプラ制御信号 １５ 送液ポンプ制御信号 １６ 廃液 ２１ 緩衝液槽 ２２ ポンプ ２３ サンプラ ２４ 三方ジョイント ２５ ＬＯＤ固定化カラム ２６ 過酸化水素電極（第１電極） ２７ ＧＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨ固定化カラム ２８ ＬＯＤ固定化カラム ２９ 過酸化水素電極（第２電極） ３０ 恒温槽 ３１ 検出器 ３２ シングルボードコンピュータ ３３ ＲＳ２３２Ｃコード ３４ パーソナルコンピュータ ３５ サンプラ制御信号 ３６ 送液ポンプ制御信号 ３７ 廃液
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/26 6807−4Ｂ 1/32 6807−4Ｂ
Claims (5)
- 【請求項１】 試料中の基質還元体Ｘred に対応する量
の第２の基質還元体Ｙred を生成させる機構ａ及び第２
の基質還元体Ｙred を測定する機構ｂを有する基質還元
体Ｘred の測定装置であり、前記機構ａが前記Ｘred と
補酵素酸化体Ｃoxより基質酸化体Ｘoxと補酵素還元体Ｃ
red を生成する反応を触媒する第１の脱水素酵素Ｅ1 、
及び補酵素還元体Ｃred と第２の基質酸化体Ｙoxより第
２の基質還元体Ｙred と補酵素酸化体Ｃoxを生成する第
２の脱水素酵素Ｅ2 を固定化した酵素固定化体を有する
Ｘred の測定装置。 - 【請求項２】 酵素固定化体が、担体表面にアミノシラ
ン化試薬で処理を施し、担体表面に形成されたアミノ基
に多官能性アルデヒドを結合させ、更に前記第１の脱水
素酵素と前記第２の脱水素酵素を固定化してなる酵素固
定化体である請求項１記載の基質還元体Ｘred の測定装
置。 - 【請求項３】 上流より、送液されるキャリヤー中へ試
料を注入する機構、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素とＬ−
乳酸脱水素酵素を含む酵素固定化体を内包するリアクタ
ー、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体、及びＬ−乳酸酸化酵素
固定化体の反応により増加または減少する電極活性物質
を検知する電極、を具備するフロー方式のＬ−グルタミ
ン酸の測定装置。 - 【請求項４】 上流より、送液されるキャリヤー中へ試
料を注入する機構、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体、Ｌ−乳
酸酸化酵素固定化体により試料中のＬ−乳酸が酸化され
る際に増加または減少する電極活性物質を検知する電
極、並びにＬ−グルタミン酸脱水素酵素とＬ−乳酸脱水
素酵素を含む酵素固定化体を内包するリアクター、Ｌ−
乳酸酸化酵素固定化体、及び増加または減少する電極活
性物質を検知する電極、を具備するフロー方式のＬ−乳
酸とＬ−グルタミン酸の測定装置。 - 【請求項５】 上流より、送液されるキャリヤー中へ試
料を注入する機構、流路を２方向へ分流する機構、一方
の流路において、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体及びＬ−乳
酸酸化酵素固定化体により試料中のＬ−乳酸が酸化され
る際に増加または減少する電極活性物質を検知する電
極、並びに他方の流路においてＬ−グルタミン酸脱水素
酵素とＬ−乳酸脱水素酵素を含む酵素固定化体を内包す
るリアクター、Ｌ−乳酸酸化酵素固定化体及び増加また
は減少する電極活性物質を検知する電極、を具備するフ
ロー方式のＬ−乳酸とＬ−グルタミン酸の測定装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15754793A JPH0731461A (ja) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | 酵素反応を用いる測定装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15754793A JPH0731461A (ja) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | 酵素反応を用いる測定装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0731461A true JPH0731461A (ja) | 1995-02-03 |
Family
ID=15652070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15754793A Pending JPH0731461A (ja) | 1993-06-28 | 1993-06-28 | 酵素反応を用いる測定装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0731461A (ja) |
-
1993
- 1993-06-28 JP JP15754793A patent/JPH0731461A/ja active Pending
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