JPH0937796A

JPH0937796A - 還元糖の還元末端残基数の測定方法

Info

Publication number: JPH0937796A
Application number: JP7194849A
Authority: JP
Inventors: Akio Karigome; 昭夫刈米; Ryuzo Hayashi; 隆造林
Original assignee: Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 1995-07-31
Filing date: 1995-07-31
Publication date: 1997-02-10

Abstract

(57)【要約】【課題】簡便、迅速且つ高精度で、還元糖の還元末端残
基数を測定することにある。【解決手段】（１）還元糖の還元末端残基を還元する工
程、（２）還元された還元末端を加水分解してソルビト
ール及びマンニトールを生成せしめる工程、（３）ＮＡ
Ｄ又はＮＡＤＰ、ソルビトール脱水素酵素、マンニトー
ル脱水素酵素、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと第３の脱水素
酵素の酸化型基質Ｙoxより還元型基質ＹredとＮＡＤ又
はＮＡＤＰを生成する第３の脱水素酵素、及び第３の脱
水素酵素の酸化型基質Ｙoxを含む反応系により、第３の
脱水素酵素の還元型基質Ｙredを生成せしめる工程、並
びに、（４）生成したＹredを測定する工程、を有する
ことを特徴とする還元糖の還元末端残基数の測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、還元糖の還元末端
残基数を測定する新規な方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】還元糖、特に、例えばデンプンやその関
連糖質、デキストラン等の還元多糖は、食品原料、食品
添加物、製紙原料、工業原材料等に広範に用いられてい
る。還元糖を利用する場合、その性質を規定する因子と
して分子量を把握することは重要である。その理由は、
例えば、分子量に応じてデンプン等の溶液粘度、吸湿特
性が変化し、また水アメ等では甘みが変化するからであ
る。

【０００３】還元糖就中還元多糖の分子量を把握する方
法としては、極限粘度測定法、光散乱法、浸透圧法、高
速液体クロマトグラフ法、還元末端残基定量法等が公知
である。

【０００４】これらの内、極限粘度測定法、光散乱法、
浸透圧法は、試料調製が煩雑で、測定時間が長いために
基礎研究目的以外に用いられることは少ない。また、高
速液体クロマトグラフ法は、平均分子量のみならず分子
量分布が求められる点で有力な方法であるが、分子量の
標準物が不可欠であること、試料調製が煩雑であるこ
と、又測定に比較的高価な装置が必要で測定時間も長い
ことから工業的に用いるには適していない。

【０００５】また、還元末端残基数定量法は、還元多糖
の還元末端残基数を定量し別途決定した全糖濃度から分
子量の指標を得るものであり、従来工業的によく用いら
れている。この方法では、該残基数の測定は、一般的
に、二価の銅と還元多糖をアルカリ性溶液中で加熱して
還元された一価の銅を比色、滴定等の方法で定量して行
われている。

【０００６】しかし、銅の酸化還元を用いるこの方法で
は、アルカリ性溶液を加熱する危険性を有し、又銅のよ
うな有害な重金属を含む廃液が大量に出るという欠点が
ある。また、還元糖による銅イオンの還元中に空気中の
酸素が溶液に溶け込むと一価銅の再酸化が起きやすく、
これを防ぐために迅速な処理が必要となり、測定には熟
練を要し、しかも個人誤差が入り易いという欠点もあ
る。

【０００７】以上のように、還元糖特に還元多糖の還元
末端残基数ひいては分子量を求める手段は、工業的に重
要視されているにもかかわらず、簡便かつ高精度な測定
方法が確立されていなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、還元
糖の還元末端残基数ひいては分子量を求めるにあたり、
上記従来技術の欠点が解消され、熟練が不必要で、銅の
ような金属イオン、強酸、強アルカリ等を使用すること
なく、簡便、迅速且つ高精度で、該残基数を測定できる
方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記従来技
術の欠点を解消するべく鋭意研究した結果、還元糖の一
方の末端に露出している還元性糖残基を還元及び加水分
解しその生成物であるソルビトールやマンニトールを特
定の酵素反応を利用して測定することによって、上記目
的が達成できることを見出した。より具体的には、上記
ソルビトールやマンニトールを、これらの脱水素酵素、
該酵素の補酵素であるＮＡＤ又はＮＡＤＰ、補酵素が共
通する第３の脱水素酵素及びその酸化型基質Ｙoxを含む
反応系で反応させることにより、第３の脱水素酵素の還
元型基質Ｙredを生成させ、これを測定することによ
り、上記目的が十分に達成されることを見出した。

【００１０】本発明は、かかる全く新たな知見に基づい
て、完成されたものである。

【００１１】即ち、本発明は、（１）還元糖の還元末端
残基を還元する工程、（２）還元された還元末端を加水
分解してソルビトール及びマンニトールを生成せしめる
工程、（３）ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ソルビトール脱水素
酵素、マンニトール脱水素酵素、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰ
Ｈと第３の脱水素酵素の酸化型基質Ｙoxより還元型基質
ＹredとＮＡＤ又はＮＡＤＰを生成する第３の脱水素酵
素、及び第３の脱水素酵素の酸化型基質Ｙoxを含む反応
系により、第３の脱水素酵素の還元型基質Ｙredを生成
せしめる工程、並びに、（４）生成したＹredを測定す
る工程、を有することを特徴とする還元糖の還元末端残
基数の測定方法、に係る。

【００１２】上記本発明方法によれば、前記従来技術の
欠点が解消され、金属イオン、強酸、強アルカリ等を使
用することなく、簡便、迅速且つ高精度で、還元糖の還
元末端残基数ひいては分子量を測定できるという格別な
効果が奏される。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明方法の測定試料である上記
工程（１）における還元糖としては、特に限定されない
が、好適なものとして、例えばデンプンやその関連糖
質、デキストラン等の還元多糖を挙げることができる。
デンプンとしては、通常のデンプンは勿論、カチオン化
デンプン、エーテル化デンプン、酸化デンプン等の誘導
体化デンプン等が包含される。デンプンの関連糖質とし
ては、水アメ、粉アメ、マルトデキストリン、イソマル
トデキストリン等が包含される。

【００１４】還元糖の還元末端残基を還元する工程
（１）は、還元糖の還元末端の糖残基を、触媒と水素ガ
スを用いて接触還元する方法や、水素化化合物を用いて
還元する方法、電気化学的還元法等のそれ自体公知の各
種の方法が採用でき、該残基が糖アルコールに還元され
る。

【００１５】接触還元する方法は、金属スズ等の触媒の
存在下、常温〜１００℃程度で、０．１〜２気圧程度の
水素ガスを還元糖の溶液に加えることにより、行うこと
ができる。

【００１６】本発明においては、水素化化合物、特に、
水素化ホウ素化合物を用いて還元する方法が、最終分解
物がホウ酸となって廃液の問題を生じないこと、このホ
ウ酸は後述する生成物の測定に用いる固定化酵素電極に
悪影響を与えないこと、その還元速度が速く迅速な処理
が可能となること等の点から、好ましい。水素化ホウ素
化合物としては、例えば水素化ホウ素ナトリウム、水素
化ホウ素カリウム等の水溶性化合物を好適に使用でき
る。

【００１７】通常、上記水素化ホウ素化合物を用いて還
元を行う場合、還元糖の水溶液に固形の水素化ホウ素化
合物を添加してもよいし、これをあらかじめ水、低級ア
ルコール等に溶解した溶液を添加してもよい。上記化合
物の溶液を用いるときは、徐々に分解が起こるので用時
調製が望ましい。また、酸性溶液中では水素化ホウ素化
合物の分解が急速に起こり、還元反応が完結しない可能
性があるので、還元糖の水溶液のｐＨが中性付近かアル
カリ性であることが望ましい。添加する水素化ホウ素化
合物の量は、予想される還元糖量とモル比で同量以上で
なければならない。しかし、添加量が多すぎると、後続
する処理において過剰の化合物が分析操作を妨害する可
能性があるので還元糖量の２〜１０倍モル程度の量を用
いることが望ましい。また、この還元操作は室温でも進
行するが、処理を迅速化するために反応系の温度を３０
〜１００℃程度に上昇させることが好ましい。この処理
は、例えば５０℃程度の温度で行った場合５分間程度で
完了する。

【００１８】このとき、過剰の水素化ホウ素化合物が残
留していて後段の反応を阻害する場合には、あらかじめ
溶液を酸性にして過剰量の水素化ホウ素化合物を分解し
ておくのが良い。例えば、１規定程度の希塩酸を処理溶
液に滴下すれば良い。

【００１９】上記還元工程（１）により、還元糖の末端
は、通常、糖アルコールであるソルビトール又はマンニ
トールがα−１，４結合により結合した構造を取ってい
る。

【００２０】続いて、工程（１）で還元された還元末端
を加水分解して糖アルコールであるソルビトール及びマ
ンニトールを生成せしめる工程（２）を行う。

【００２１】還元糖の還元された還元末端即ち糖アルコ
ールの加水分解は、酸等による加水分解法、加水分解酵
素による方法等を採用することができる。

【００２２】酸等による加水分解法は、通常、０．１〜
５規定程度の塩酸又は硫酸酸性下で、沸騰水浴等で０．
５〜５時間程度加熱するか、或いは例えば１２０℃（２
気圧）程度で１０〜３０分程度加圧加熱することによ
り、行うことができる。

【００２３】本発明では、これらの方法の内、加水分解
酵素を用いる方法が、簡便且つ迅速である点から、好ま
しい。

【００２４】この場合、本発明においては、還元糖の末
端残基を糖アルコールに還元した結果、加水分解酵素の
該末端糖アルコールのα−１，４結合を切断する速度が
著しく遅くなるという問題が生じる。本発明者は、工程
（２）の加水分解を加水分解酵素を用いて行った場合に
は、後述の還元型基質Ｙredの生成工程（３）を同時に
進行させれば、加水分解により生じる糖アルコールが該
工程（３）で消費され、加水分解を促進する方向に平衡
がずれることにより、かかる問題が解消されることを見
出した。

【００２５】従って、工程（２）の加水分解を加水分解
酵素を用いて行う場合には、加水分解工程（２）と還元
型基質Ｙredの生成工程（３）とを同時に進行させるの
が、好ましい。

【００２６】還元糖の還元された還元末端の加水分解に
用いられる加水分解酵素としては、通常、各種アミラー
ゼを用いることができる。アミラーゼの種類としては、
α−アミラーゼ（ＥＣ．３．２．１．１）、グルコアミ
ラーゼ（ＥＣ．３．２．１．３）等を、好適に使用する
ことができる。特に、グルコアミラーゼは分解速度が速
く、酵素も安定であるために利用しやすい。なお、グル
コアミラーゼは、糖鎖が短くなると加水分解速度が低下
するため、低分子量のオリゴ糖に作用するα−グルコシ
ダーゼ（ＥＣ．３．２．１．２０）を併用することによ
り速度を向上できる。特に、酵母の生産するα−グルコ
シダーゼは、特異性が比較的低く、糖アルコールの結合
したα−１，４結合の加水分解反応をゆっくりではある
が触媒するため、好ましい。

【００２７】前記したように糖アルコールの結合したα
−１，４結合をグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、α
−グルコシダーゼ等が加水分解して切断する速度は遅い
が、該加水分解反応の生成物であるソルビトール又はマ
ンニトールを工程（３）の脱水素酵素反応で除去するこ
とにより、十分な速さで加水分解を進行できる。

【００２８】従って、α−グルコシダーゼ又はグルコア
ミラーゼの反応と脱水素酵素の反応を併用することによ
り著しい効果をあげることができる。

【００２９】次に、本発明方法においては、加水分解工
程（２）の後工程として、ソルビトール脱水素酵素及び
マンニトール脱水素酵素の反応と別の第３の脱水素酵素
の反応を複合させて、試料中のソルビトール又はマンニ
トール量に対応した量のＹredを生成させる。即ち、Ｎ
ＡＤ又はＮＡＤＰ、ソルビトール脱水素酵素、マンニト
ール脱水素酵素、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと第３の脱水
素酵素の酸化型基質Ｙoxより還元型基質ＹredとＮＡＤ
又はＮＡＤＰを生成する第３の脱水素酵素、及び第３の
脱水素酵素の酸化型基質Ｙoxを含む反応系により、第３
の脱水素酵素の還元型基質Ｙredを生成せしめる工程
（３）を、行う。

【００３０】ソルビトール脱水素酵素の反応は、補酵素
のＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又
はＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸）の存在下に、ソルビトールをフラクトースに酸化
して、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生ずるものである。

【００３１】また、マンニトール脱水素酵素の反応は、
補酵素のＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下に、マンニトール
をフラクトースに酸化して、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを
生ずるものである。

【００３２】これらのソルビトール脱水素酵素及びマン
ニトール脱水素酵素の反応は可逆的であり、反応平衡に
達すると反応は見かけ上停止するので、すべてのソルビ
トール又はマンニトールがすべてフラクトースに変換さ
れるものではない。そのため、第３の脱水素酵素の反応
を複合させて生成したフラクトース又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
を別の物質に変換し平衡をずらして反応を進行させる必
要がある。また、この第３の脱水素酵素によるフラクト
ース又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消費反応は、ソルビトール脱
水素酵素及びマンニトール脱水素酵素の反応と同時に行
わなければ効果が無いので、同様の条件で反応させるこ
とができる酵素を使用した反応でなけばならない。

【００３３】そして、本発明では、上記の如く、ソルビ
トール脱水素酵素及びマンニトール脱水素酵素の反応に
利用される補酵素を共有する第３の脱水素酵素を併用す
ることに大きな特徴を有する。かかる反応系によれば、
還元された補酵素を再酸化する反応を組み合せて、補酵
素をリサイクルし、高価な補酵素の使用量を少なくして
反応を行うことにより、分析コストを低減させることが
できる。

【００３４】本発明における、上記還元型基質Ｙredの
生成工程（３）は、上記の通り、ソルビトール脱水素酵
素及びマンニトール脱水素酵素の反応に、第３の脱水素
酵素とその基質酸化体Ｙoxを添加し、この脱水素酵素の
反応を複合させた反応系であり、下記反応式で表わすこ
とができる。

【００３５】

【化１】

【００３６】本発明において、第３の脱水素酵素として
は、補酵素のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下に、酸化
型基質Ｙoxを還元型基質Ｙredに還元して、ＮＡＤ又は
ＮＡＤＰを生ずるものが使用できるが、特に、反応の平
衡が基質還元体Ｙredと補酵素酸化体ＮＡＤ（Ｐ）が生
成する方向へ偏っているものを、第３の脱水素酵素とし
て好適に使用することができる。

【００３７】かかる第３の脱水素酵素としては、例えば
Ｌ−乳酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アセトア
ルデヒド脱水素酵素、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素等を挙げ
ることができ、これらから適宜選択使用すれば良い。

【００３８】選択する第３の脱水素酵素の種類により、
酸化型基質Ｙox及び還元型基質Ｙredは、自動的に決定
される。例えば、Ｌ−乳酸脱水素酵素の場合は、酸化型
基質Ｙoxがピルビン酸であり、還元型基質ＹredがＬ−
乳酸である。また、アルコール脱水素酵素の場合は、酸
化型基質Ｙoxがアセトアルデヒドであり、還元型基質Ｙ
redがエタノールである。

【００３９】特に、第３の脱水素酵素がＬ−乳酸脱水素
酵素であり、酸化型基質Ｙoxがピルビン酸であり、還元
型基質ＹredがＬ−乳酸であるのが、好ましい。

【００４０】前記反応式から明らかな通り、本発明の工
程（３）においては、通常、合計１moleのソルビトール
及びマンニトールより１moleのＹredを生成させること
ができるので、結局測定試料の還元糖の還元末端数に比
例したmole数のＹredが生成することになる。

【００４１】本発明の工程（３）においては、補酵素酸
化体ＮＡＤ（Ｐ）がソルビトール脱水素酵素及びマンニ
トール脱水素酵素の反応で還元されＮＡＤ（Ｐ）Ｈにな
り、さらに第３の脱水素酵素の反応で酸化されＮＡＤ
（Ｐ）に戻る。即ち、補酵素は、見かけ上は反応に関与
していないかのようであるが、電子伝達体としてリサイ
クルしている。従って、本発明では反応系にＮＡＤ
（Ｐ）を添加するが、たとえＮＡＤ（Ｐ）量が試料中の
ソルビトール及びマンニトール量より少ない場合でも、
補酵素を介してＹoxを完全にＹredに変換することがで
きる。

【００４２】測定を行う上でソルビトール及びマンニト
ールと補酵素を介して生成するＹredの間の変換係数は
必ずしも１００％である必要はないが、１００％反応を
完結させることにより正確な反応時間の制御が不必要と
なるため実用的に好ましい。

【００４３】１００％反応を完結させるような反応条件
を達成するためには、反応系に加えるＹoxの量は還元末
端数もしくは試料となる糖の還元により生じたソルビト
ールとマンニトール合量より多くなくてはならない。即
ち、ソルビトール及びマンニトールの合量と当モル以上
のＹoxを添加することにより、１モルのソルビトール及
びマンニトールより１モルのＹredを生成させることが
できる。

【００４４】本発明の工程（３）において用いられる各
脱水素酵素の由来については、特に限定されない。ま
た、各脱水素酵素の活性量についても、特に限定されな
い。しかし、活性量が少なすぎると反応に時間がかかり
すぎ、又単位時間あたりの変化量が少なくなり測定が困
難になることがある。一方、活性量が多いと反応は速く
好ましいが、酵素が高価となり分析コストが上昇する。
そのため、実用的には、ソルビトール脱水素酵素及びマ
ンニトール脱水素酵素についてはその活性が０．１〜２
０ユニット／ｍｌ（溶液中濃度として）程度であれば良
く、又第３の脱水素酵素については用いる脱水素酵素の
種類により異なるが、ソルビトール脱水素酵素及びマン
ニトール脱水素酵素の１００分の１から１００倍程度の
活性であるのが好ましい。

【００４５】また、工程（３）で用いるＮＡＤ又はＮＡ
ＤＰについては同様に、少量でも存在すれば反応は進行
する。もちろん多量に存在すると反応は速くなるが、分
析コストが上昇するので、通常、０．１〜２０ｍＭ程度
が好ましい。そして、第３の脱水素酵素の基質酸化体Ｙ
oxは、ソルビトール及びマンニトール合量の１．５〜５
倍モル量程度であるのが好ましい。

【００４６】次に、工程（３）で生成したＹredを測定
する工程（４）により、Ｙredを測定すれば、還元糖試
料から得られたソルビトールとマンニトールの合量が求
められ、結果的に還元糖の還元末端数を決定できる。

【００４７】Ｙredを測定する際の定量法としては、Ｙr
edの種類に応じた各種の方法を採用できる。例えば、Ｙ
redに特異的に作用する酸化酵素を使用する方法、Ｙred
に特異的に作用する脱水素酵素を使用する方法、ＨＰＬ
Ｃによる方法等を挙げることができる。

【００４８】本発明においては、Ｙredを測定する際の
定量法としては、工程（３）の処理液をそのまま使用で
きる点から、Ｙredに特異的に作用する酸化酵素を使用
する方法が好ましい。また、該酸化酵素としては、Ｙre
dを溶存酸素の存在下でＺoxに酸化し過酸化水素を生成
する下記式に示される反応を触媒するものが、好まし
い。

【００４９】Ｙred＋Ｏ₂→Ｚox＋Ｈ₂Ｏ₂ この酸化酵素の反応は、酸素より過酸化水素を生成する
一方向の反応であり、Ｚoxが共存していても反応には影
響がなく、またＮＡＤ（Ｐ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが共存し
ていても影響がない。一般的に、ソルビトール脱水素酵
素、マンニトール脱水素酵素及び第３の脱水素酵素の酵
素は、酸化酵素の反応を阻害したり、酸化酵素の反応に
よって阻害されないので失活させる必要はない。

【００５０】上記酸化酵素の好ましい具体例としては、
ＹredがＬ−乳酸であり、Ｚoxがピルビン酸である場合
のＬ−乳酸酸化酵素が挙げられる。

【００５１】上記酸化酵素反応の検出方法としては、減
少した酸素、生成した過酸化水素等を定量する各種の公
知の方法を採用することができる。

【００５２】例えば、酸化酵素の反応で生成した過酸化
水素は、パーオキシダーゼと２，２’−アジノ−ジ（３
−エチルベンツチアゾリン）−６−スルホン酸又は４−
アミノアンチピリンを用いたトリンダー法等により、可
視部の吸光度を測定することにより定量できる。可視部
の吸光度測定は補酵素の定量に使用する紫外部の吸光度
測定に比べ、濁りの影響を受けにくい。しかし、分光光
度計を用いる測定は試料が着色物質を含んでいる場合に
は正確な測定が困難であり、そのために前処理を必要と
する。

【００５３】一方、上記トリンダー法等に比較して、減
少した酸素又は生成した過酸化水素を電極によって電流
値に変換して測定する電気化学的測定法は、操作が簡単
で濁りや着色物質の影響を受けにくく優れた検出手段で
ある点で、好ましい。

【００５４】消費された酸素量を測定する酸素電極は、
ガルバニ型、クラーク型等の各種公知のものを利用でき
る。

【００５５】生成する過酸化水素を測定する過酸化水素
電極としては、アノード基体に炭素、白金、ニッケル、
パラジウム等を用い、カソード側に銀等を用いた公知の
ものを利用できる。一般にアノードとしては、過電圧が
低く高感度が得られるという理由から白金を用いること
が多い。そして、電極表面にポリシロキサン膜、アクリ
ル樹脂膜、蛋白膜、アセチルセルロース膜、アルブミン
膜等の選択透過膜を有している形式の電極が妨害物除去
の観点から望ましい。

【００５６】また、ジクロロインドフェノール、フェリ
シアン化カリウム、ベンゾキノン等の電子伝達体である
いわゆるメディエーターを介在させた電極で、メディエ
ーターの酸化還元を利用して、過酸化水素を測定するこ
ともできる。

【００５７】電極系は作用電極、対極より構成される２
電極の過酸化水素電極や酸素電極が利用できるが、安定
性、精度の点から作用電極、参照電極、対極より構成さ
れる３電極のものがより望ましい。

【００５８】また、酸化酵素は、溶液状で使用すること
もできるが、酸化酵素を固定化して用いると酵素の繰り
返し利用が可能となり、酵素の反応条件を規定し易い等
の利点がある。また、酸化酵素固定化体を、増減する酸
素または過酸化水素等の変化量を検出する電極と組み合
せて使用するとＹred の検出を１段階で短時間に行うこ
とができ好ましい。

【００５９】即ち、工程（４）が、Ｙredの酸化反応を
触媒する酸化酵素の固定化体にＹredを接触させ、減少
又は増加する電極活性物質の変化量を電気化学的に検出
することによりＹredを測定するものであることが、好
ましい。

【００６０】酵素の固定化法は、特に限定されず、吸着
法、化学結合法、包括法等を用いることができる。中で
も強固な固定化体を作成できる化学結合法が望ましい。
固定化に用いる担体にはケイソウ土、シリカゲル、ガラ
スビーズ、アルミナ、セラミック、カーボン、活性炭、
モレキュラーシーブ、シリコンゴム、セルロース、アガ
ロース、アミノ酸系ポリマー等が使用できる。化学結合
法としては、担体表面にアミノシラン化試薬でアミノ基
を導入し、さらにグルタルアルデヒド等の多官能性アル
デヒドを用いてホルミル化を行った後、酵素を接触させ
て固定化する方法が好適な例として挙げられる。固定化
酵素の形態は、担体に固定化しカラム等のリアクターに
充填する方法が考えられる。

【００６１】また、酸化酵素をグルタルアルデヒド、ホ
ルムアルデヒド、サクシニルアルデヒド等の架橋剤で固
定した膜を電極に取りつけて使用することもできる。膜
上に固定化する際にはアルブミン、グロブリン、ゼラチ
ン等の他のタンパク質を添加して酸化酵素を架橋するこ
ともできる。測定に使用する緩衝液は酸化酵素に適した
ｐＨで緩衝能があり、電極に電気化学的な影響を及ぼさ
ないものならよい。

【００６２】かくして、Ｙredを測定することにより、
試料である還元糖の還元末端残基数を、好適に測定する
ことができる。

【００６３】測定された還元末端残基数に基づき、別途
決定した全糖濃度から、常法に従い、試料還元糖の数平
均分子量を容易に導くことができる。

【００６４】全糖濃度の決定は、常法により行えば良
く、例えば、フェノール硫酸法等の全糖量測定法が用い
られる。また、乾燥重量法、屈折率計を用いる簡易測定
方法で、全糖量を測定しても良い。

【００６５】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に一層具体
的に説明するが、もちろん本発明はこれらの例に限定さ
れるものではない。

【００６６】実施例１還元糖として、グルコース（Ｇ１という）、マルトース
（Ｇ２という）、マルトトリオース（Ｇ３という）、マ
ルトテトラオース（Ｇ４という）、マルトペンタオース
（Ｇ５という）、マルトヘキサオース（Ｇ６という）、
マルトヘプタオース（Ｇ７という）までの一連の直鎖糖
質標準物を用い、還元末端数の定量を実施した。還元に
は水素化ホウ素ナトリウムを用い、加水分解は希塩酸に
よる加熱水解を用いた。第３の脱水素酵素としてはＬ−
乳酸脱水素酵素を用い、生成する乳酸をL-乳酸酸化酵素
固定化体を用いて電気化学的に検出した。

【００６７】（１）Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラムの製
造耐火レンガ（３０〜６０メッシュ）１５０ｍｇをよく乾
燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの
無水トルエン溶液に１時間浸漬した後、よくトルエンで
洗浄し、乾燥した。こうしてアミノシラン化処理した担
体を５％グルタルアルデヒドに１時間浸漬した後、よく
蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ７．０、１００ｍＭのリン
酸ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだ
け除いておいた。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ
７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にＬ−乳酸
酸化酵素（シグマ社製、）５０ユニット／ｍｌの濃度で
溶解した溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放
置し、酵素を固定化した。この酵素固定化担体を内径
３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填し、Ｌ−乳酸
酸化酵素固定化カラムとした。

【００６８】（２）過酸化水素電極の製造直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすり及び１５００番のエメリー紙で平
滑に仕上げた。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金板
を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ硫
酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行った。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加えた。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化した。これを過酸化水素電極とした。

【００６９】また、参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参
照電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。

【００７０】（３）Ｌ−乳酸測定装置図１に示すフロー型Ｌ−乳酸測定装置によって、Ｌ−乳
酸の測定を行った。緩衝液槽（１）からポンプ（２）に
より緩衝液を送液し、オートサンプラ（３）より試料５
μｌを注入する。試料中のＬ−乳酸より、恒温槽（４）
中のＬ−乳酸酸化酵素固定化カラム（５）によって過酸
化水素が生成し、過酸化水素電極（６）により電流値の
変化が捕らえられ検出器（７）により検出される。さら
に信号をコンピュータ（１０）に送りピーク値を解析す
ることにより定量を行った。

【００７１】緩衝液の組成は１００ｍＭリン酸ナトリウ
ム、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭアジ化ナトリウムを
含みｐＨ７．０である。

【００７２】（４）水素化ホウ素ナトリウムによる還元
処理前記Ｇ１〜Ｇ７までの濃度１０ｍｇ／ｍｌの水溶液各１
ｍｌを試験管にとり、それぞれ０．１ｇ／ｍｌ水素化ホ
ウ素ナトリウム水溶液１００μｌを加えた後、３７℃の
恒温槽中に１５分間保持し還元処理を行った。還元処理
の完了後、１Ｎ塩酸１ｍｌを加え未反応の水素化ホウ素
ナトリウムを分解した。同時に試料溶液が酸性であるこ
とを確認した。

【００７３】（５）加水分解反応上記の末端残基の還元処理後、濃度１Ｎの塩酸で酸性と
した試料溶液に対し、１２０℃、３０分間の加熱処理を
して、末端糖アルコールを加水分解した。

【００７４】（６）還元された末端残基に由来する糖ア
ルコールの検出反応系での最終濃度がＮＡＤ５ｍＭ、ピルビン酸１０ｍ
Ｍ、ソルビトール脱水素酵素及びマンニトール脱水素酵
素（どちらもシグマ社製）各１ユニット／ｍｌ、Lー乳酸
脱水素酵素（ベーリンガー社製）１０ユニット／ｍｌに
なるように各試薬及び酵素を添加し、同時に反応系ｐＨ
が７．５になるようにリン酸ナトリウムで調整した。２
５℃において約６０分反応させた。

【００７５】上記の反応液と蒸留水をブランクに用い
て、Ｌ−乳酸の１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ及び該反応液
を、上記（３）のＬ−乳酸測定装置を用いて測定し、得
られた電流値（ｎＡ）を求めた。

【００７６】（７）結果上記の測定結果から元の直鎖還元糖の１分子あたりの還
元末端数を算出した。その結果を表１に示した。

【００７７】

【表１】

【００７８】上記表１の結果より、Ｇ１からＧ７までの
直鎖還元糖で正確な還元末端数を算出できることが明ら
かである。

【００７９】実施例２実施例１と同様のＬ−乳酸酸化酵素固定化カラム、過酸
化水素電極、Ｌ−乳酸測定装置を用い、加水分解に酵素
を利用して、Ｇ１からＧ７の還元末端数を求めた。

【００８０】（１）方法実施例１と同様に還元処理を完了した後、過剰の水素化
ホウ素ナトリウムを分解した。

【００８１】反応系での最終濃度がＮＡＤ５ｍＭ、ピル
ビン酸１０ｍＭ、ソルビトール脱水素酵素及びマンニト
ール脱水素酵素（どちらもシグマ社製）各１ユニット／
ｍｌ、Lー乳酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）１０ユニ
ット／ｍｌになるように各試薬及び酵素を添加し、同時
に反応系ｐＨが７．５になるようにリン酸ナトリウムで
調整した。さらに、グルコアミラーゼ（シグマ社製）及
び酵母由来のα−グルコシダーゼ（シグマ社製）を各々
１０ユニット／ｍｌになるように添加し、３０℃におい
て約６０分反応させた。

【００８２】最終的に生成したＬ−乳酸量を、実施例１
と同様に定量した。

【００８３】（２）結果得られた結果を表２に示した。実施例１の場合と同様に
正確な測定ができていることが判る。

【００８４】

【表２】

【００８５】実施例３実施例１と同様のＬ−乳酸酸化酵素固定化カラム、過酸
化水素電極、Ｌ−乳酸測定装置を用い、加水分解に酵素
を利用して、デンプン関連糖質である水飴の還元末端数
を求めた。

【００８６】（１）方法実施例１と同様に、濃度０．７Ｗ／Ｖ％の水飴希釈液の
還元処理を完了した後、過剰の水素化ホウ素ナトリウム
を分解した。

【００８７】反応系での最終濃度がＮＡＤ５ｍＭ、ピル
ビン酸１０ｍＭ、ソルビトール脱水素酵素及びマンニト
ール脱水素酵素（どちらもシグマ社製）各１ユニット／
ｍｌ、Lー乳酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）１０ユニ
ット／ｍｌになるように各試薬及び酵素を添加し、同時
に反応系ｐＨが７．５になるようにリン酸ナトリウムで
調整した。さらにグルコアミラーゼ（シグマ社製）及び
酵母由来のα−グルコシダーゼ（シグマ社製）を各々１
０ユニット／ｍｌになるように添加し、３０℃において
約６０分反応させた。

【００８８】最終的に生成したＬ−乳酸量を、実施例１
と同様に定量した。

【００８９】（２）結果水飴中の還元末端数は、全グルコース量に対して２０％
であることが判った。これは水飴の全糖量をフェノール
硫酸法により求め、さらに還元末端数を還元銅滴定法に
より求めた結果と良く一致した。本発明の方法では重金
属を含む廃水が生成せずクリーンな分析が可能であっ
た。

【００９０】

【発明の効果】本発明の測定方法を用いることにより、
還元糖の末端残基数を、簡便、迅速且つ高精度で、定量
することが可能となった。特に酵素反応を組み合わせる
ことにより、安全且つクリーンな分析が可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例で使用したフロー方式のＬ−乳酸
測定装置を示す。

【符号の説明】

１緩衝液槽２ポンプ３サンプラ４恒温槽５Ｌ−乳酸酸化酵素固定化カラム６過酸化水素電極７検出器８シングルボードコンピュータ９ＲＳ２３２Ｃコード１０パーソナルコンピュータ１１サンプラ制御信号１２送液ポンプ制御信号１３廃液

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｈ 3/06 Ｃ０７Ｈ 3/06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）還元糖の還元末端残基を還元する工
程、（２）還元された還元末端を加水分解してソルビト
ール及びマンニトールを生成せしめる工程、（３）ＮＡ
Ｄ又はＮＡＤＰ、ソルビトール脱水素酵素、マンニトー
ル脱水素酵素、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと第３の脱水素
酵素の酸化型基質Ｙoxより還元型基質ＹredとＮＡＤ又
はＮＡＤＰを生成する第３の脱水素酵素、及び第３の脱
水素酵素の酸化型基質Ｙoxを含む反応系により、第３の
脱水素酵素の還元型基質Ｙredを生成せしめる工程、並
びに、（４）生成したＹredを測定する工程、を有する
ことを特徴とする還元糖の還元末端残基数の測定方法。
【請求項２】工程（２）の加水分解が加水分解酵素を用
いて行うものであり、且つ加水分解工程（２）と還元型
基質Ｙredの生成工程（３）とを同時に進行させる、請
求項１記載の測定方法。
【請求項３】工程（２）の加水分解がグルコアミラーゼ
及びα−グルコシダーゼの少なくとも１種の加水分解酵
素を用いて行うものである、請求項１又は２に記載の測
定方法。
【請求項４】工程（３）の第３の脱水素酵素がＬ−乳酸
脱水素酵素であり、酸化型基質Ｙoxがピルビン酸であ
り、還元型基質ＹredがＬ−乳酸である、請求項１乃至
３のいずれかに記載の測定方法。
【請求項５】工程（４）が、Ｙredの酸化反応を触媒す
る酸化酵素の固定化体にＹredを接触させ、減少又は増
加する電極活性物質の変化量を電気化学的に検出するこ
とによりＹredを測定するものである請求項１乃至４の
いずれかに記載の測定方法。