JP6459400B2 - 酵素固定化体およびそれを備えた分析装置ならびにl−スレオニンの測定方法 - Google Patents
酵素固定化体およびそれを備えた分析装置ならびにl−スレオニンの測定方法 Download PDFInfo
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
(1)メイオサーマス・シルバナス(Meiothermus silvanus)由来L−スレオニンデヒドロゲナーゼ・NADHオキシダーゼ同時固定化カラムの製造方法
アミノシラン化処理したシリカゲル担体75mgを5%グルタルアルデヒドに1時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にpH7.0、100mMのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除いておいた。このホルミル化したシリカゲル担体にpH7.0、100mMリン酸ナトリウム緩衝液にメイオサーマス・シルバナス由来L−スレオニンデヒドロゲナーゼ37ユニット/mlの濃度で溶解した溶液250μl、pH7.0、100mMリン酸ナトリウム緩衝液にバチルス・リセニホルミス(Bacillus licheniformis)由来NADHオキシダーゼ1ユニット/mlの濃度で溶解した溶液1mlを同時に接触させ、0〜4℃で1日放置し固定化した。この酵素固定化担体を内径3.5mm、長さ15mmのカラムに充填した。
アミノシラン化処理したシリカゲル担体75mgを5%グルタルアルデヒドに1時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にpH7.0、100mMのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除いておいた。このホルミル化したシリカゲル担体にpH7.0、100mMリン酸ナトリウム緩衝液にサーモプラズマ・アシドフィラム由来L−スレオニンデヒドロゲナーゼ6.7ユニット/mlの濃度で溶解した溶液250μl、pH7.0、100mMリン酸ナトリウム緩衝液にバチルス・リセニホルミス由来NADHオキシダーゼ1ユニット/mlの濃度で溶解した溶液1mlを同時に接触させ、0〜4℃で1日放置し固定化する。この酵素固定化担体を内径3.5mm、長さ15mmのカラムに充填した。
過酸化水素電極はガラス板上に貴金属を蒸着法により成膜したものを用いた。厚さ0.7mmの無アルカリガラス基板上に白金、白金、銀の3本の貴金属を蒸着した。銀は参照電極として、白金の1本は作用電極、もう1本は電子供給に用いる対極として利用した。貴金属薄膜を成膜したものの上に、セルロースアセテートを1μmの厚さでスピンコートした。なお、セルロースアセテートは過酸化水素のように低分子量の化合物を透過し、アスコルビン酸のような分子量が比較的大きく、過酸化水素と同電位で酸化される化合物が白金作用電極表面に到達するのを妨げる。
図1はフロー型の測定装置に前述のL−スレオニンデヒドロゲナーゼ・NADHオキシダーゼ同時固定化体を装着したものである。緩衝液槽(1)より緩衝液をポンプ(2)により送液し、オートサンプラー(3)より試料4μlを注入した。送液された試料は、恒温槽(4)中に設置されたL−スレオニンデヒドロゲナーゼ・NADHオキシダーゼ同時固定化カラム(5)を通過し、L−スレオニンから過酸化水素が生成する。生成した過酸化水素は、下流の過酸化水素電極(6)を通過し、電流値の変化を生じさせる。
0、1、2、5mMにそれぞれ調製したL−スレオニン標準物を測定装置に注入し、各濃度の標準物における検出電流値を記録した。横(X)軸に標準物の濃度、縦(Y)軸に検出電流値となるように検出電流値の値をグラフにプロットした後、最小二乗法により、濃度と検出電流値の関係を表す検量線を作製した。このとき、検量線はY=aX+bの一次直線であり、傾きであるaは単位濃度(1mM)当りの電流値を表す。過酸化水素、NADHも同様の方法で濃度と検出電流値の関係を表す検量線を作製し、傾きを算出した。
使用する緩衝液のpHを6.5〜9.0の間で検討した。結果を図2〜図5に示す。pHが7.5〜8.5の間でL−スレオニン/過酸化水素変換率、L−スレオニン/NADH変換率、検量線の相関係数が向上した。
緩衝液中に添加するNAD+濃度を0.01mM〜1.00mMの間で検討した。結果を図6〜図7に示す。NAD+濃度が0.10〜1.00mMでL−スレオニン/過酸化水素変換率、L−スレオニン/NADH変換率、検量線の相関係数が向上した。
50mMの塩化カリウム、0.5mMのNAD+、50μMのFADを含む50mMピロリン酸緩衝液(pH8.0)を用いてL−スレオニンの検量線を作成した。結果を図8に示す。L−スレオニン濃度が10mMまで検量線の相関係数0.9999を維持した。
本固定化体の基質特異性を検討した。1mMに調製した種々のアミノ酸を測定装置に注入し、それぞれのアミノ酸ごとの検出電流値を記録した。L−スレオニンの電流値を100%とし、他のアミノ酸への反応率を算出した。結果を表1に示す。L−スレオニン以外には、ほぼ応答することが無かった。
(1)分離型固定化カラムの製造方法
実施例(1)、(2)に記載の方法で、L−スレオニンデヒドロゲナーゼのみを固定化したものを分離型L−スレオニンデヒドロゲナーゼ固定化カラム、NADHオキシダーゼのみを固定化したものを分離型NADHオキシダーゼ固定化カラムとする。これらをテフロン(登録商標)チューブで直列に接続したものを比較実験に用いた。
実施例(4)の装置を用いて、0、1、2、5mMのL−スレオニンを4μlずつ注入し、検出値を得た。検出値から、同時固定化体を使用した際の検量線と分離型カラムを使用した際の検量線を作成した。検量線の傾きからL−スレオニン/過酸化水素変換率、L−スレオニン/NADH変換率を算出した。結果を表2〜3に示す。L−スレオニンデヒドロゲナーゼとNADHオキシダーゼを同時固定することにより、L−スレオニン/過酸化水素変換率、L−スレオニン/NADH変換率が向上した。
2 送液ポンプ
3 オートサンプラ
4 恒温槽
5 固定化カラムリアクタ
6 過酸化水素電極
7 電流電圧変換器
8 ボードコンピュータ
9 廃液ボトル
10 パーソナルコンピュータ
Claims (5)
- L−スレオニンデヒドロゲナーゼとNADHオキシダーゼが同一の膜または担体上に混合した状態で固定化された酵素固定化体であって、
前記L−スレオニンデヒドロゲナーゼが、パイロコッカス属、サーマス属、クロストリジウム属、フラボバクテリウム属、メイオサーマス属、及びサーモプラズマ属に属する微生物からなる群から選択される少なくとも1種の微生物由来のものである、酵素固定化体。 - 請求項1に記載の酵素固定化体と、該固定化体の下流に電気化学的活性物質を検知する機構とを備えたL−スレオニンの分析装置。
- 緩衝液の流れを形成する機構と、該緩衝液流に試料を注入する機構と、該注入機構の下流に請求項1に記載の酵素固定化体と、該固定化体の下流に電気化学的活性物質を検知する機構とを備えたL−スレオニンの分析装置。
- L−スレオニンデヒドロゲナーゼとNADHオキシダーゼが同一の膜または担体上に混合した状態で固定化された酵素固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構を用いて検体中のL−スレオニンを検知する工程であって、前記L−スレオニンデヒドロゲナーゼが、パイロコッカス属、サーマス属、クロストリジウム属、フラボバクテリウム属、メイオサーマス属、及びサーモプラズマ属に属する微生物からなる群から選択される少なくとも1種の微生物由来のものである、工程を含む、検体中のL−スレオニンの測定方法。
- 前記酵素固定化体にNAD+を含む緩衝液が送液される、請求項4に記載の測定方法。
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