JP2020202825A - 酵素固定化体及びそれを備えた測定装置ならびにアスパラギン及びl−アスパラギン酸の測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
アスパラギナーゼが固定化されたアスパラギナーゼ固定化体と、L−アスパラギン酸オキシダーゼが固定化されたL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構とを用いて検体中のアスパラギンを検知する工程
を含む、L−アスパラギン酸及びアスパラギンの測定方法を開示する。
L−アスパラギン酸 + O2 + H2O →
オキサロ酢酸 + 過酸化水素 + NH3 (式1)
L−アスパラギン + H2O → L−アスパラギン酸 + NH3 (式2)
(I)L−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化カラムの製造方法
アミノシラン化処理したシリカゲル担体約75mgを1mLの5%グルタルアルデヒドに浸漬し、15分間減圧下に置き、45分間静置した。その後、グルタルアルデヒドをピペットで除去した後、MilliQ水で二回洗浄し、最後にpH 7.0、100mMのリン酸緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除いておいた。このホルミル化したシリカゲル担体にサーモコッカス・リトラリス由来L−アスパラギン酸オキシダーゼを1mgP/75mg担体となるように添加し、担体に酵素が十分に馴染むように15分間減圧下に置いた。常圧に戻した後、4℃で1晩静置し固定化した。この酵素固定化担体約75mgを内径3.5mm、長さ15mmのカラムに充填した。
アスパラギナーゼ固定化カラムは、上記のL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化カラムの製造方法と同様の方法で作製した。
過酸化水素電極はガラス板上に貴金属を蒸着法により成膜したものを用いた。厚さ0.7mmの無アルカリガラス基板上に白金、白金、銀の3本の貴金属を蒸着した。銀は参照電極として、白金の1本は作用電極、もう1本は電子供給に用いる対極として利用した。貴金属薄膜を成膜したものの上に、セルロースアセテートを1μmの厚さでスピンコートした。なお、セルロースアセテートは過酸化水素のように低分子量の化合物を透過し、アスコルビン酸のような分子量が比較的大きく、過酸化水素と同電位で酸化される化合物が白金作用電極表面に到達するのを妨げる。
図1はフロー型の測定装置に前述のアスパラギナーゼ固定化カラム及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体を装着したものである。緩衝液槽(1)より緩衝液をポンプ(2)により送液し、オートサンプラ(3)より試料4μlを注入した。送液された試料は、恒温槽(4)中に設置されたアスパラギナーゼ固定化カラム(5)とL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化カラム(6)とを通過し、アスパラギンから過酸化水素が生成する。生成した過酸化水素は、下流の過酸化水素電極(7)を通過し、電流値の変化を生じさせる。
0、1、2、5mMにそれぞれ調整したL−アスパラギン酸標準物を測定装置に注入し、各濃度の標準物における検出電流値を記録した。横(X)軸に標準物の濃度、縦(Y)軸に検出電流値となるように検出電流値の値をグラフにプロットした後、最小二乗法により、濃度と検出電流値の関係を表す検量線を作成した。このとき、検量線はY=aX+bの一次直線であり、傾きであるaは単位濃度(1mM)当りの電流値を表す。過酸化水素(HPO)も同様の方法で濃度と検出電流値の関係を表す検量線を作成し、傾きを算出した。
pH 7.0〜9.5の間で使用する緩衝液の検討を行った(SPB:リン酸緩衝液、Tris:Tris−HCl緩衝液、NaHCO3:炭酸水素ナトリウム緩衝液、FAD:フラビンアデニンジヌクレオチド)。結果を図3〜図4に示す。pHが上がるにつれ、活性が上昇することが確認された。Trisではより高活性であるなど、イオン種による違いも見られた。検量線の相関係数を緩衝液ごとに計算すると、リン酸緩衝液では検量線の直線性に優れていることが確認された。そのため、正確な分析には、リン酸緩衝液は特に好適であると考えられる。
AspOXカラムの反応温度を37℃以上で確認した。結果を図5に示す。好熱菌由来の酵素ということもあり、70℃でも活性を維持し、より高活性となった。
アスパラギナーゼ固定化体をL−アスパラギン酸オキシダーゼの上流に装着し、リン酸緩衝液pH 8.0、37℃の条件でアスパラギン検量線の作成を行った。結果を図6に示す。直線性が良く、アスパラギン測定が可能であることが確認できた。
(I)アスパラギナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ混合固定化カラムの製造方法
アミノシラン化処理したシリカゲル担体約160mgを2mLの5%グルタルアルデヒドに浸漬し、15分間減圧下に置き、45分間静置した。その後、グルタルアルデヒドをピペットで除去した後、MilliQ水で二回洗浄し、最後にpH 7.0、100mMのリン酸緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除いておいた。このホルミル化したシリカゲル担体にアスパラギナーゼを3.4mgP/150mg担体、サーモコッカス・リトラリス由来L−アスパラギン酸オキシダーゼを5mgP/150mg担体となるように添加し、担体に酵素が十分に馴染むように15分間減圧下に置いた。常圧に戻した後、4℃で1晩静置し固定化した。この酵素固定化担体約75mgを内径3.5mm、長さ30mmのカラムに充填した。
実施例1の測定装置(図1)において、アスパラギナーゼ固定化カラム(5)とL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化カラム(6)に代えて、前述のアスパラギナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ混合固定化カラム(56)を装着させる以外は、実施例1と同じフロー型測定装置を用いた(図2を参照)。緩衝液槽(1)より緩衝液をポンプ(2)により送液し、オートサンプラ(3)より試料4μlを注入した。送液された試料は、恒温槽(4)中に設置されたアスパラギナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ混合固定化カラム(56)を通過し、アスパラギンから過酸化水素が生成する。生成した過酸化水素は、下流の過酸化水素電極(7)を通過し、電流値の変化を生じさせる。
アスパラギナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ混合固定化体を測定装置に装着し、リン酸緩衝液pH 8.0、37℃の条件でアスパラギン検量線の作成を行った。結果を図7に示す。単独固定の場合と同様に、直線性の良い検量線が得られ、アスパラギン測定が可能であることが確認できた。
2 送液ポンプ
3 オートサンプラ
4 恒温槽
5 アスパラギナーゼ固定化カラムリアクタ
6 L−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化カラムリアクタ
56 アスパラギナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ混合固定化カラムリアクタ
7 過酸化水素電極
8 電流電圧変換器
9 ボードコンピュータ
10 廃液ボトル
11 パーソナルコンピュータ
Claims (15)
- L−アスパラギン酸オキシダーゼが固定化されたL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体。
- 前記L−アスパラギン酸オキシダーゼが、サーモコッカス・リトラリスに属する微生物由来のものである、請求項1に記載のL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体。
- 請求項1又は2に記載のL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、該L−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体の下流側に配置された電気化学的活性物質を検知する機構とを備えたL−アスパラギン酸の測定装置。
- アスパラギナーゼが固定化されたアスパラギナーゼ固定化体と、該アスパラギナーゼ固定化体の下流側に配置された請求項1又は2に記載のL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、該L−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体の下流側に配置された電気化学的活性物質を検知する機構とを備えたアスパラギンの測定装置。
- 請求項1又は2に記載のL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、該L−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体の下流側に配置された電気化学的活性物質を検知する機構とを備え、更に該電気化学的活性物質を検知する機構の下流側に、アスパラギナーゼが固定化されたアスパラギナーゼ固定化体と、請求項1又は2に記載のL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構とをこの順で備えたL−アスパラギン酸及びアスパラギンの測定装置。
- L−アスパラギン酸オキシダーゼが固定化されたL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構とを用いてL−アスパラギン酸を検知する工程を含む、L−アスパラギン酸の測定方法。
- アスパラギナーゼが固定化されたアスパラギナーゼ固定化体と、L−アスパラギン酸オキシダーゼが固定化されたL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構とを用いてアスパラギンを検知する工程を含む、アスパラギンの測定方法。
- L−アスパラギン酸オキシダーゼが固定化されたL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構とを用いてL−アスパラギン酸を検知する工程、
アスパラギナーゼが固定化されたアスパラギナーゼ固定化体と、L−アスパラギン酸オキシダーゼが固定化されたL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構とを用いて検体中のアスパラギンを検知する工程
を含む、L−アスパラギン酸及びアスパラギンの測定方法。 - 各酵素固定化体に送液される緩衝液のpHが8.0以上である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の測定方法。
- 各酵素固定化体に送液される緩衝液がリン酸塩緩衝液である、請求項6〜9のいずれか一項に記載の測定方法。
- アスパラギナーゼとL−アスパラギン酸オキシダーゼとが混合した状態で固定化されたアスパラギナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ混合固定化体。
- 請求項11に記載のアスパラギナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ混合固定化体と、該混合固定化体の下流側に配置された電気化学的活性物質を検知する機構とを備えたアスパラギンの測定装置。
- 請求項1又は2に記載のL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、該L−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体の下流側に配置された電気化学的活性物質を検知する機構とを備え、更に該電気化学的活性物質を検知する機構の下流側に、請求項11に記載のアスパラギナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ混合固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構とをこの順で備えたL−アスパラギン酸及びアスパラギンの測定装置。
- アスパラギナーゼとL−アスパラギン酸オキシダーゼとが混合した状態で固定化されたアスパラギナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ混合固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構とを用いてアスパラギンを検知する工程を含む、アスパラギンの測定方法。
- L−アスパラギン酸オキシダーゼが固定化されたL−アスパラギン酸オキシダーゼ固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構とを用いてL−アスパラギン酸を検知する工程、
アスパラギナーゼとL−アスパラギン酸オキシダーゼとが混合した状態で固定化されたアスパラギナーゼ及びL−アスパラギン酸オキシダーゼ混合固定化体と、電気化学的活性物質を検知する機構とを用いて検体中のアスパラギンを検知する工程
を含む、L−アスパラギン酸及びアスパラギンの測定方法。
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