JP2003322635A - Ｌ−グルタミン濃度測定装置及びそれを用いる測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】Ｌ−グルタミン濃度測定装置およびそれを用い
る測定方法を提供すること。 【解決手段】バチルス属由来のＬ−グルタミナーゼ固定
化体を用いてなるＬ−グルタミン濃度測定装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は食品製造、発酵制
御、動物細胞による物質生産の際に重要なＬ−グルタミ
ンを定量するにあたり、迅速、簡便かつ高精度で長期安
定性に優れて低分析コストの酵素固定化体を利用した濃
度測定を実現する測定装置および測定方法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−グルタミンは、生体タンパク質を構
成するアミノ酸としてだけではなく、核酸生合成系の必
須原料であることが古くから知られている。また植物
性、および動物性タンパク質を加水分解し加工する場
合、Ｌ−グルタミン酸は旨み成分として有用であるが、
Ｌ−グルタミンは放置するとピログルタミン酸に変化し
旨みを示さないことから、その残留量を低減させる必要
があり正確な定量が必要である。

【０００３】さらに微生物等を利用する発酵生産の際の
炭素および窒素源として、Ｌ−グルタミン酸と並びＬ−
グルタミンが用いられることも多い。

【０００４】また近年進歩の著しい動物培養細胞を用い
る抗体等の生理活性成分の生産、ガン、ウィルス感染症
の研究等において、動物細胞の栄養源としてＬ−グルタ
ミンが非常に重要な化合物であることが指摘されてい
る。

【０００５】このようにＬ−グルタミンの濃度を正確に
知ることは、食品製造、発酵生産、動物細胞培養におい
て非常に重要である。

【０００６】従来、Ｌ−グルタミンの濃度測定方法とし
ては、高速液体クロマトグラフを用いるアミノ酸分析計
による方法や酵素を利用した方法が数多く提案されてき
た。

【０００７】しかし、アミノ酸分析計は装置自体が高価
であり、その維持管理には高度な専門知識が要求され
る。また分析時間も１検体あたり１時間以上を要する場
合が多く、日常的に簡便に用いられるものではなかっ
た。

【０００８】特公平４―２４９９７号には基質特異性に
優れたＬ−グルタミン酸オキシダーゼとグルタミナーゼ
（ＥＣ ３．５．１．２）を作用させる方法が開示され
ているが、グルタミナーゼとしては大腸菌、シュードモ
ナス属の酵素、またはブタ腎皮質由来の酵素が例示され
ているのみであり、その実施例にも溶液反応が記載され
ているのみである。溶液法は酵素を使い捨てにするため
分析コストが上昇する。さらに分析者の熟練度により分
析精度が影響されるなど簡便かつ高精度な分析が可能と
は言いがたい。

【０００９】この問題点を解決するために固定化体を用
いる方法が特開平９−２６６７８６号に開示されてい
る。本引例ではアスパラギナーゼ（ＥＣ ３．５．１．
１）を固定化して用いており、ある程度の精度を有す
る。しかし本来アルパラギンに作用する酵素の不純活性
を利用しているため、Ｌ−グルタミンからＬ−グルタミ
ン酸への変換効率が低く、分析精度として満足できる結
果が得られていない。また、酵素固定化体の安定性が低
く、測定環境温度を低く設定する必要があり、実用上不
充分なものであった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は前記の問題点
を解決することを主な目的として、長期安定性に優れた
Ｌ−グルタミナーゼ固定化体を用いたＬ−グルタミンの
測定装置を開示し、食品製造、発酵制御、動物培養細胞
による物質生産に適した迅速、簡便、かつ高精度の分析
装置および分析方法を提案するものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は酵素固定化体を
用いるフロー方式の装置を開示する。緩衝液の流れを形
成する機構と、該緩衝液流に試料を注入する機構を有
し、この試料注入機構の下流に、Ｌ−グルタミナーゼお
よびＬ−グルタミン酸オキシダーゼの混合固定化体もし
くは上流側よりＬ−グルタミナーゼ固定化体、Ｌ−グル
タミン酸オキシダーゼ固定化体を順次配置してグルタミ
ン検出用電極系を構成する。この電極系内の酵素固定化
体の下流には酸素、過酸化水素あるいはＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ反応により酸化還元状態が変化する、い
わゆるメディエーターなどの電気化学的活性物質濃度を
検知できる電極を配置する。

【００１２】前記のＬ−グルタミン検出用電極系で用い
るＬ−グルタミナーゼとして、バチルス属から精製され
た酵素を利用することにより、従来技術で問題とされる
耐久性の欠如を解決することができる。バチルス属由来
のＬ―グルタミナーゼを酵素固定化体として用いること
により、長期間安定にグルタミンをグルタミン酸に分解
することが可能であり、その結果測定精度が向上し、分
析コストが低減する。

【００１３】また本発明ではさらに高精度の分析を行え
るフロー方式の装置を開示する。

【００１４】緩衝液の流れを形成する機構と、該緩衝液
流に試料を注入する機構と、該試料注入機構の下流に、
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの単独固定化体とその下
流に電気化学的活性物質濃度を検知できる電極を配置
し、Ｌ−グルタミン酸検出用電極系を構成する。さらに
該電極系の下流にＬ−グルタミナーゼおよびＬ−グルタ
ミン酸オキシダーゼの混合固定化体もしくは上流側より
Ｌ−グルタミナーゼ固定化体、Ｌ−グルタミン酸オキシ
ダーゼ固定化体を順次配置して、これらの酵素固定化体
の下流に電気化学的活性物質濃度を検知できる電極を配
置したＬ−グルタミン検出用電極系を構成し、この２つ
の電極系を直列に配置したことを特徴とするＬ−グルタ
ミン濃度測定装置である。

【００１５】そしてこれらのフロー方式の装置を利用し
た分析方法を開示する。

【００１６】すなわち、少なくともひとつの既知濃度の
Ｌ−グルタミン酸およびＬ−グルタミンを順次注入し、
緩衝液の流れの上流に配置されたＬ−グルタミン酸検出
用電極系における第１の電極の検出値とＬ−グルタミン
酸濃度から第１の検量線を作成し、下流に配置したＬ−
グルタミン検出用電極系における第２の電極の検出値と
Ｌ−グルタミン酸およびＬ−グルタミンに対する検出値
から第２および第３の検量線を作成し、未知試料注入時
の第１電極の検出値を第１の検量線に当てはめてＬ−グ
ルタミン酸濃度を算出し、該濃度を第２の検量線に代入
し、第２の電極の検出値に対するＬ−グルタミン酸の寄
与を補正し、第３の検量線を用いて濃度を算出するＬ−
グルタミン濃度測定方法である。

【００１７】

【発明の実施の形態】Ｌ−グルタミンを酵素反応により
変換し、電極で検知するには、Ｌ−グルタミンをＬ−グ
ルタミン酸に分解する。続いて、Ｌ−グルタミン酸をＬ
−グルタミン酸オキシダーゼの触媒作用により酸化し、
その際に消費される酸素を検知するか、生成する過酸化
水素を検知する。もしくはＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼの活性中心と電子の授受が可能な低分子化合物、いわ
ゆるメディエーター、を介在させ、このメディエーター
の酸化還元状態を電極で検知すればよい。

【００１８】Ｌ−グルタミンをＬ−グルタミン酸に変化
させるグルタミナーゼ（ＥＣ．３．５．１．２）は以下
の反応を触媒する。

【００１９】Ｌ−グルタミン＋Ｈ₂Ｏ → Ｌ−グルタ
ミン酸＋ＮＨ₄ ⁺ 次に、生成したＬ−グルタミン酸をＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼ（ＥＣ１．４．３．１１）により酸化する。

【００２０】Ｌ−グルタミン酸＋Ｏ₂＋Ｈ₂Ｏ →α−ケ
トグルタル酸＋ＮＨ₃＋Ｈ₂Ｏ₂ グルタミナーゼとしては、特に、バチルス属由来のもの
が、耐久性が優れる点で好ましい。

【００２１】バチルス属の細菌はいずれもＬ−グルタミ
ナーゼ活性を有し、培養時に培地にＬ−グルタミンを加
えて誘導することにより収量を向上できる。なかでもバ
チルス・ズブチリスからは比較的高活性であって、培養
速度が早く、当該酵素を得ることが容易である点で好適
である。

【００２２】グルタミナーゼは、例えば、バチルス属な
どの細菌を培養し、培養後の菌体抽出物を精製すること
によって得ることができる。

【００２３】具体的には、以下のような方法で得ること
ができる。

【００２４】バチルス・ズブチリスなどのバチルス属細
菌を、通常２５ないし３０℃で培養する。培養後の菌体
を遠心分離等で集菌し、菌体を氷冷下で摩砕し、可溶性
画分を、塩析、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、透析、超遠心分離等で精製を実
施する。特にバチルス属細菌抽出物中には、比較的強い
活性を有するタンパク質分解酵素が含まれるため、その
活性を除くことが望ましい。

【００２５】また、グルタミナーゼは、グルタミナーゼ
遺伝子を同種の細菌もしくは大腸菌等にクローニングし
て酵素を精製することによっても得ることができる。

【００２６】また醤油もろみ中のＬ−グルタミンを分解
することを目的とする市販のグルタミナーゼ粗製酵素か
らクロマトグラフ法などにより精製することも可能であ
る。この粗製酵素自体は、グルタミナーゼ活性が分析目
的に利用するためには非常に低い。かつ溶液、酵素固定
化体ともに急速な活性低下が認められる。この原因は明
確ではないが、おそらく粗製酵素中に不純物として含ま
れるタンパク質分解酵素によりグルタミナーゼが分子鎖
の切断等の修飾を受け、耐久性に変化が起きてしまうこ
とによると考えられる。

【００２７】このように得られたグルタミナーゼ、およ
びＬ−グルタミン酸オキシダーゼは固定化して用いるこ
とが望ましい。酵素の固定化方法としては、物理吸着
法、イオン結合法、包括法、共有結合法などタンパク質
の固定化方法として公知の方法を利用できるが、中でも
共有結合法が長期安定性に優れ望ましい。タンパク質を
共有結合させる方法としては、ホルムアルデヒド、グリ
オキザール、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド基を
有する化合物を用いるか、多官能基性アシル化剤を利用
する方法、スルフヒドリル基を架橋させる方法など各種
の方法を利用できる。酵素固定化体の形状としては、膜
状に固定化し白金、金、カーボンなどからなる電極上に
のせることもできるし、不溶性担体に固定化し担体をカ
ラムリアクターに充填して用いることもできる。さらに
固定化の際に他種の酵素あるいはゼラチンや血清アルブ
ミンなどのタンパク質、ポリアリルアミンやポリリジン
などの合成高分子を共存させ、酵素固定化体の特性、す
なわち膜強度、基質透過特性などを変更することもでき
る。酵素を不溶性担体に固定化する場合の担体として
は、ケイソウ土、活性炭、アルミナ、酸化チタン、架橋
処理デンプン粒子、セルロース系高分子、キチンおよび
キトサン誘導体などの公知の担体を利用できる。

【００２８】該グルタミナーゼ固定化体の至適ｐＨは、
６〜８、より好ましくは７〜７．５であれば、同時に固
定化体として使用するＬ−グルタミン酸酸化酵素の至適
ｐＨと合致し、かつリン酸緩衝液、クエン酸―リン酸緩
衝液、ホウ酸緩衝液などで強い緩衝能を有するｐＨ領域
を使えるため好適である。

【００２９】また該グルタミナーゼ固定化体の特性とし
ては、その至適温度が５０℃以上、特に５０〜６０℃の
ものが好適である。ここで、至適温度とは、反応の速度
の上昇が続く限り温度を上げ、最大の速度が得られた際
の温度を意味する。実際に分析を行う場合、室温の変動
に測定結果が影響を受けることを避け、かつ酵素反応に
より生成した過酸化水素などの電気化学的活性物質の検
出を行う電極の感度を高める上でも、多用される温度は
３０〜５０℃である。この温度での長期耐久性を確保す
る上で前記の至適温度を有するグルタミナーゼ固定化体
が好適である。実際に従来用いられていたアスパラギナ
ーゼ固定化体の至適温度は３５℃であり、この固定化体
では３０℃で使用しても比較的早く活性が低下し、かつ
変換効率が低くなり精度の点でもコストの点でも劣って
いた。

【００３０】固定化された酵素に試料を一定時間接触さ
せて反応を進行させるには、試料液を一定時間撹拌しな
がら反応を起こさせるバッチ方式でも可能であるが、よ
り高精度の測定を実施するためにフロー方式の測定を用
いることが望ましい。

【００３１】もちろん、固定化する担体の表面積は一定
であるので固定化できる酵素量には限界があるし、固定
化する酵素量を増やすとコストも高くなる。そのため、
できるだけ低い酵素量で効率的にＬ−グルタミンからＬ
−グルタミン酸への変換を行うことが望ましい。そのた
めの方法としては酵素固定化体と試料の接触時間を増加
させることが挙げられる。接触時間を増加させるには担
体の粒度を小さくして接触面積を増やす方法、流量を低
下させる、あるいは酵素固定化体と試料が接触した状態
で一定時間送液を停止させるとよい。

【００３２】酵素固定化体を利用したフロー型の測定方
法において、一定流速で酵素固定化体に作用させると、
当然ながら通過の前後で基質となる成分の量が変化す
る。例えば成分Ａ１分子を成分Ｂ１分子に変化させる酵
素において、同濃度のＡを作用させた場合の電極での検
出値とＢを作用させた場合の電極での検出値を比較し、
変換率とする。ＡとＢの検出値が同じ場合は１００％の
変換率で、Ａの検出値がＢ検出値の半分の場合は５０％
の変換率とする。変換率は１００％を超えることはな
い。変換率は同一条件で反応させる場合は固定化した酵
素量が多くなると増加する。また、酵素固定化体と試料
を接触させる時間を長くする、すなわち流速を低下させ
るあるいは停止させると増加する。２種類以上の酵素を
使用し成分Ｘを成分Ｙに変化させ、さらに成分Ｚに変化
させて検出する場合に、ＸをＹに変換する酵素（複数で
もよい）をＥ１、ＹをＺに変換する酵素をＥ２とする。
この場合にＥ１の変換率が１００％であれば、Ｘの検量
線とＹの検量線は同じになる。反対に、Ｅ２の変換率が
１０％であればＸの検量線の勾配はＹの検量線の１／１
０になる。そして、測定条件を変え、例えば流速を低下
させると、変換率が増加し、検量線の勾配も増加する。

【００３３】当然ながら前記の変換率が高いほど測定精
度は向上する。

【００３４】２種類の酵素を用いる際に重要な点は両者
の反応条件が類似していることである。Ｌ−グルタミン
酸オキシダーゼの至適ｐＨ、至適温度に合わせてグルタ
ミナーゼの至適ｐＨは６ないし８、より好ましくは７な
いし７．５であることが望ましい。また至適温度は３０
℃以上である固定化体を用いることが望ましいが、さら
に５０℃以上の至適温度を有するグルタミナーゼ固定体
が好適である。

【００３５】これらの条件を満足する固定化体として、
バチルス・ズブチリスから精製された酵素を担体に固定
化し、カラムに充填したものをフロー方式で用いること
が望ましい。

【００３６】さらに試料中にＬ−グルタミンとＬ−グル
タミン酸が混合していると、Ｌ−グルタミン検出用電極
系は両方を検知するため、試料注入機構の下流に、Ｌ−
グルタミン酸オキシダーゼの固定化体とその下流に電気
化学的活性物質濃度を検知できる電極を配置し、さらに
該電極の下流に Ｌ−グルタミナーゼおよびＬ−グルタ
ミン酸オキシダーゼの混合固定化体もしくは上流側より
Ｌ−グルタミナーゼ固定化体、Ｌ−グルタミン酸オキシ
ダーゼ固定化体を順次配置して、これらの酵素固定化体
の下流に電気化学的活性物質濃度を検知できる電極を配
置して測定することにより最初から試料中に存在するＬ
−グルタミン酸の影響を除去することが可能である。つ
まり、少なくともひとつの既知濃度のＬ−グルタミン酸
およびＬ−グルタミンを順次注入し、緩衝液の流れの上
流に配置されたＬ−グルタミン酸オキシダーゼ単独固定
化体による電気化学的活性物質濃度の増減を検知する第
１の電極の検出値とＬ−グルタミン酸濃度から第１の検
量線を作成し、下流に配置したＬ−グルタミナーゼおよ
びＬ−グルタミン酸オキシダーゼの混合固定化体もしく
は上流側よりＬ−グルタミナーゼ固定化体、Ｌ−グルタ
ミン酸オキシダーゼ固定化体を順次配置した固定化体に
よる電気化学的活性物質濃度の増減を検知する第２の電
極の検出値とＬ−グルタミン酸およびＬ−グルタミンに
対する検出値から第２および第３の検量線を作成し、未
知試料注入時の第１の電極の検出値を第１の検量線に当
てはめてＬ−グルタミン酸濃度を算出し、該濃度を第２
の検量線に代入し、第２の電極の検出値に対するＬ−グ
ルタミン酸の寄与を補正し、第３の検量線を用いて濃度
を算出すれば良い。

【００３７】バチルス属由来のＬ−グルタミナーゼを固
定化して利用すると、酵素を繰り返し使用し、Ｌ−グル
タミンを効率よく分解できる。たとえば、固定化酵素を
試料中に添加することにより、グルタミンからグルタミ
ン酸を生成させ、ろ過、遠心分離などで固定化酵素を回
収して再利用できる。このことにより処理コストを低減
するのみならず、試料を酵素タンパク質で汚染すること
を防ぐことが可能であり、食品加工などに有益である。
またカラムに該固定化体を充填し、試料と通液すること
によりグルタミン酸を生成できる。処理後の液をグルタ
ミン酸の分析に利用することも容易である。前記のグル
タミナーゼ固定化体とグルタミン酸オキシダーゼ固定化
体を用いる分析に利用すると最も高精度かつ簡便な分析
が実現できる。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明の内容をさら
に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。

【００３９】実施例１（Ｉ）Ｌ−グルタミナーゼ固定化体の製造方法 （ｉ）Ｌ−グルタミナーゼの精製 食品添加物酵素製剤であるグルタミナーゼF「アマノ」
１００(天野エンザイム株式会社製)を１g取り、ｐＨ
７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＬを
加え、４℃で撹拌することにより溶解する。この液を５
０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、未溶解物を除く。こ
れを粗酵素溶液とする。

【００４０】ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ-５５Ｆ（東ソ
ー株式会社製）を前記のリン酸ナトリウム緩衝液で平衡
化した後、カラムに充填し、前記の粗酵素溶液1ｍＬを
添加して、リン酸ナトリウム緩衝液を1ｍＬ／分の速度
で流す。溶出液を２８０ｎｍの検出波長を有する比色計
でモニタリングする。溶出ピークが得られたところで、
溶出液を1ｍＬずつ分取する。

【００４１】分取された各溶出液から１０μＬをピペッ
トで取り、アドバンスト・プロテイン・アッセイ試薬
(フナコシ株式会社製)を加え発色させる。同様に牛血清
アルブミン(シグマ社製)を標準物として同様の操作で検
量線を作成し、各溶出液中のタンパク質濃度を算出す
る。

【００４２】一方で、各溶出液１μＬを５ｍＭのＬ-グ
ルタミン溶液に加え、３０℃で１０分間反応させた後の
Ｌ−グルタミン酸量を定量する。この結果から、タンパ
ク質量あたりのＬ−グルタミン酸生成能力の最も高い分
取画分を決定する。

【００４３】上記の操作を繰り返し、Ｌ−グルタミナー
ゼ活性の高い分取画分を合わせ、４℃、３０%飽和硫酸
アンモニウム処理後、５０００ｒｐｍ、３０分間の遠心
分離の上清を集める。さらに該上清に５０%飽和相当の
硫酸アンモニウムを添加し、その沈殿物を５０００ｒｐ
ｍ、１０分間の遠心分離操作で集める。

【００４４】前記の沈殿物をリン酸ナトリウム緩衝液１
００μＬに再溶解し、この溶液を、透析チューブに入
れ、４℃において２４時間透析処理する。

【００４５】透析完了後、透析チューブのまま、減圧装
置にセットし、１時間の間３２ｍｍＨｇの減圧処理を実
施する。この処理により約３倍に溶液は濃縮される。

【００４６】この溶液を取り出し、前記のタンパク質濃
度、活性の測定を実施した。その結果、最初の粗酵素溶
液から比べて、タンパク質あたりの活性は約８９倍に上
昇した。

【００４７】（ii）溶液酵素の安定性 前記の粗酵素溶液、精製酵素溶液を、タンパク質濃度を
１０μｇ／ｍＬにして、３７℃で放置し、一定時間後に
活性を測定した。その結果、粗酵素は１時間後で活性が
初期の値の９０%となり、５時間後には５０%、２０時間
後には１０%になった。一方精製酵素は、５時間後で９
５%、２０時間後で８０%となった。精製する事により安
定性が増す理由は明瞭ではないが、不純物としてタンパ
ク分解酵素などが含まれており、酵素が一部分解される
ため、精製することにより長時間酵素タンパク質が安定
に存在するのではないかと思われる。

【００４８】またこの結果から、溶液状態の精製酵素で
は３７℃で放置した場合、２０時間で２０%程度の活性
低下が認められ、分析に利用するには安定性がまだ充分
であるとはいい難い。

【００４９】（iii）Ｌ−グルタミナーゼ固定化カラム
の製造 耐火レンガ（８０〜１００メッシュ）１５０ｍｇをよく
乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン
の無水トルエン溶液に１時間浸漬した後、よくトルエン
で洗浄し、乾燥する。こうしてアミノシラン化処理した
担体を５％グルタルアルデヒドに１時間浸漬した後、よ
く蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ７．０、１００ｍＭのリ
ン酸ナトリウム緩衝液で置き換え、この緩衝液をできる
だけ除いておく。このホルミル化した耐火レンガにｐＨ
７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液にＬ−グル
タミナーゼ６０ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２
００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し固定化す
る。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍ
ｍのカラムに充填しＬ−グルタミナーゼ固定化カラムと
する。

【００５０】（II）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ固定
化カラムの製造方法 上記（iii）のグルタミナーゼ固定化カラムの製造方法
と同様に耐火レンガをホルミル化する。そしてこの耐火
レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液にＬ−グルタミン酸オキシダーゼ(ヤマサ醤油製)５０
ユニット／ｍｌの濃度で溶解した溶液２００μｌを接触
させ、０〜４℃で１日放置し固定化する。この酵素固定
化担体を内径３．５ｍｍ、長さ３０ｍｍのカラムに充填
しＬ−グルタミン酸オキシダーゼ固定化カラムとする。

【００５１】（III）過酸化水素電極の製造方法 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロン(Ｒ)で被覆
し、その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー
紙で平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型
白金板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．
１Ｍ硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。
その後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥
し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無
水トルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アル
ブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇ
を蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒド
を０．２％になるように加える。この混合液を手早く先
に用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾
燥硬化する。これを過酸化水素電極とする。

【００５２】また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照
電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。

【００５３】（IV）測定装置 図１はフロー型の測定装置に前述のグルタミナーゼとグ
ルタミンオキシダーゼ固定化体を装着したものである。
緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液
し、オートサンプラー（３）より試料５μｌを注入す
る。送液された試料は、恒温槽（４）中に設置されたＬ
−グルタミナーゼ固定化カラム（５）、Ｌ−グルタミン
酸オキシダーゼ固定化カラム（６）過酸化水素電極
（７）を通過し、Ｌ−グルタミンおよびＬ−グルタミン
酸から過酸化水素が生成し電流値の変化をとらえる。

【００５４】電流値の変化は、検出器（８）により検出
される。さらに信号をパーソナルコンピューター（９）
に送ることもできる。ポンプはパーソナルコンピュータ
ー（９）から制御線（１３）を介して制御信号を送り流
量を設定する。

【００５５】この装置に流す緩衝液の組成は、１００ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化カリウム、およ
び１ｍＭのアジ化ナトリウムを含みｐＨは７．０であ
る。

【００５６】緩衝液の流速は１．０ｍｌ／分、恒温槽の
温度は３７℃とする。

【００５７】（V）Ｌ−グルタミン・Ｌ−グルタミン酸
に対する直線性の確認 （IV）のＬ−グルタミン・Ｌ−グルタミン酸測定装置を
利用して、０、１、２、５ｍＭのＬ−グルタミンおよび
Ｌ−グルタミン酸の溶液を各５μｌずつ注入し、検出値
を得た。結果は表１のようになり次の検量線が得られ
た。ただしＹは検出値（ｎＡ）Ｘは試料中の濃度（ｍ
Ｍ）である。またｒは相関係数である。

【００５８】 グルタミン酸 Ｙ＝３７Ｘ＋１．８ ｒ＝０．９９９ グルタミン Ｙ＝３０Ｘ＋１．６ ｒ＝０．９９９ 上記の結果をグラフ化したものが図２である。四角のデ
ータがグルタミン酸のものであり、丸印がグルタミンで
ある。

【００５９】直線性は良好であり、かつグルタミンから
グルタミン酸への変換が８０％以上の効率で行われてい
ることがわかった。

【００６０】

【表１】

【００６１】（VI）酵素固定化体のｐＨ依存性 緩衝液の組成比を一定にし、ｐＨを変化させた場合の感
度を調べた。その結果を図３に示す。図３において四角
がグルタミン酸感度を示し、丸印がグルタミン感度を示
す。なお、過酸化水素電極感度のｐＨ依存性の影響をな
くすために、過酸化水素標準液の測定を行いその感度で
補正を行った。この図３より本酵素の至適ｐＨが７であ
ることがわかった。

【００６２】（VII）至適温度の確認 恒温槽の温度を変化させ、感度変化を記録した。その結
果をまとめたものが図４である。なおｐＨ依存性の場合
と同様に過酸化水素感度の補正を実施した。この図より
至適温度は５５℃であることがわかった。

【００６３】（VIII）耐久性 酵素固定化体を３７℃に保持して、随時グルタミン標準
液を注入し感度の変化を調べた。感度の基準として毎回
過酸化水素標準液を注入し補正を行った。経時変化を図
５に示す。少なくとも４ヶ月間は感度が保持され優れた
耐久性を示した。また測定精度の低下も認められなかっ
た。

【００６４】比較例１ 実施例１のグルタミナーゼの代わりにアスパラギナーゼ
を固定化して、相対感度及び耐久性を確認した。

【００６５】（VIIII）Ｌ−グルタミン・Ｌ−グルタミ
ン酸に対する直線性の確認 上記（V）と同様の方法で、０、１、２、５ｍＭのＬ−
グルタミンおよびＬ−グルタミン酸の溶液を各５μｌず
つ注入し、検出値を得た。その結果、次の検量線が得ら
れた。ただしＹは検出値（ｎＡ）Ｘは試料中の濃度（ｍ
Ｍ）である。またｒは相関係数である。

【００６６】 グルタミン酸 Ｙ＝３７Ｘ＋１．２ ｒ＝０．９９９ グルタミン Ｙ＝１２Ｘ−０．６ ｒ＝０．９９８ 上記の結果をグラフ化したものが図６である。四角のデ
ータがグルタミン酸のものであり、丸印がグルタミンで
ある。

【００６７】直線性は良好であるが、グルタミンからグ
ルタミン酸への変換は、３２％の効率であった。また、
図２と図６の比較から、グルタミナーゼよりも、相対感
度が低いことが確認された。

【００６８】（X）耐久性 上記（VIII）と同様の方法で、固定化体を３７℃に保持
して、随時グルタミン標準液を注入し感度の変化を調べ
た。感度の基準として毎回過酸化水素標準液を注入し補
正を行った。経時変化を図７に示す。

【００６９】図５と図７の比較により、アスパラギナー
ゼの変換効率が低く、相対感度が低いことがわかった。
また３７℃で保持すると１週間程度で測定が不可能にな
ることがわかった。

【００７０】実施例２ 実施例１と同様に、別途もう一つのグルタミン酸オキシ
ダーゼ固定化体を作成し過酸化水素電極と組み合わせ
て、グルタミン酸のみを検知できるセンサを作成した。

【００７１】本センサを図１の装置において、グルタミ
ナーゼ固定化体の前に装着し、２つのセンサを同時に動
作させた。グルタミン酸とグルタミン標準液で検量線を
作成し、次にグルタミン酸とグルタミン混合液を注入し
た。その結果を表２に示す。分析に要した時間は１検体
あたり約９０秒であった。この結果から、混合液中の濃
度が極めて簡単にかつ感度よく決定できることが分かっ
た。

【００７２】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の実施例および比較例で使用した
Ｌ−グルタミン測定装置を示す図である。 （１）緩衝液槽 （２）ポンプ （３）オートサンプラー （４）恒温槽 （５）グルタミナーゼ固定化カラム （６）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ固定化カラム （７）過酸化水素電極 （８）検出器 （９）パーソナルコンピューター （１０）ＲＳ２３２Ｃケーブル （１１）オートサンプラー制御信号 （１２）ポンプ制御信号 （１３）廃液

【図２】図２は、本発明の測定装置の、Ｌ−グルタミン
・Ｌ−グルタミン酸に対する測定感度の直線性を示す図
である。（■）はグルタミン酸、（●）はグルタミンの
感度をそれぞれ示す。

【図３】図３は本発明の酵素固定化体のｐＨ依存性を示
す図である。（■）はグルタミン酸、（●）はグルタミ
ンの感度をそれぞれ示す。

【図４】図４は本発明の酵素固定化体の温度依存性を示
す図である。

【図５】図５は本発明の酵素固定化体の耐久性を示す図
である。

【図６】図６は比較対象であるアスパラギナーゼ固定化
体を用いた場合のＬ−グルタミン・Ｌ−グルタミン酸に
対する測定感度の直線性を示す図である。

【図７】図７は比較対象であるアスパラギナーゼ固定化
体の耐久性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/28 ３２１ Ｇ０１Ｎ 27/46 ３３６Ｇ Ｆターム(参考） 4B029 AA07 BB16 CC03 FA12 4B063 QA01 QA18 QQ80 QR03 QR10 QS28 QX04

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】緩衝液の流れを形成する機構と、該緩衝液
   流に試料を注入する機構と、該試料注入機構の下流に、
   Ｌ−グルタミナーゼおよびＬ−グルタミン酸オキシダー
   ゼの混合固定化体もしくは上流側よりＬ−グルタミナー
   ゼ固定化体、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ固定化体を
   順次配置して、これらの酵素固定化体の下流に電気化学
   的活性物質濃度を検知できる電極を配置したことを特徴
   とするＬ−グルタミン濃度測定装置。
2. 【請求項２】用いるＬ−グルタミナーゼがバチルス属由
   来の酵素である請求項１記載のＬ−グルタミン濃度測定
   装置。
3. 【請求項３】用いるＬ−グルタミナーゼ固定化体の至適
   ｐＨが７〜７．５である請求項１又は２のいずれかに記
   載のＬ−グルタミン濃度測定装置。
4. 【請求項４】用いるＬ−グルタミナーゼ固定化体の至適
   温度が５０〜６０℃である請求項１乃至３のいずれかに
   記載のＬ−グルタミン濃度測定装置。
5. 【請求項５】緩衝液の流れを形成する機構と、該緩衝液
   流に試料を注入する機構と、該試料注入機構の下流に、
   Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ固定化体とその下流に電
   気化学的活性物質濃度を検知できる電極を配置し、さら
   に該電極の下流に Ｌ−グルタミナーゼおよびＬ−グル
   タミン酸オキシダーゼの混合固定化体もしくは上流側よ
   りＬ−グルタミナーゼ固定化体、Ｌ−グルタミン酸オキ
   シダーゼ固定化体を順次配置して、これらの酵素固定化
   体の下流に電気化学的活性物質濃度を検知できる電極を
   配置したことを特徴とするＬ−グルタミン濃度測定装
   置。
6. 【請求項６】少なくともひとつの既知濃度のＬ−グルタ
   ミン酸およびＬ−グルタミンを順次注入し、緩衝液の流
   れの上流に配置されたＬ−グルタミン酸オキシダーゼ固
   定化体による電気化学的活性物質濃度の増減を検知する
   第１の電極の検出値とＬ−グルタミン酸濃度から第１の
   検量線を作成し、下流に配置したＬ−グルタミナーゼお
   よびＬ−グルタミン酸オキシダーゼの混合固定化体もし
   くは上流側よりＬ−グルタミナーゼ固定化体、Ｌ−グル
   タミン酸オキシダーゼ固定化体を順次配置した固定化体
   による電気化学的活性物質濃度の増減を検知する第２の
   電極の検出値とＬ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン
   に対する検出値から第２および第３の検量線を作成し、
   未知試料注入時の第１の電極の検出値を第１の検量線に
   当てはめてＬ−グルタミン酸濃度を算出し、該濃度を第
   ２の検量線に代入し、第２の電極の検出値に対するＬ−
   グルタミン酸の寄与を補正し、第３の検量線を用いて濃
   度を算出するＬ−グルタミン濃度測定方法。
7. 【請求項７】バチルス属由来のＬ−グルタミナーゼを固
   定化してなるＬ−グルタミン分解用Ｌ−グルタミナーゼ
   固定化体。