JPH08131192A - フラクトース測定方法及び測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 フラクトースを迅速に正確に測定する。また
グルコース等を同時測定する。 【構成】 緩衝液の送液機構２、その下流に試料注入機
構３、前記試料注入機構３の下流にグルコースオキシ
ダーゼを固定化したグルコース電極５、ヘキソキナー
ゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−乳酸デヒドロゲ
ナーゼの固定化体Ａ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ固定化体
６、並びに過酸化水素電極７または酸素電極を具備す
る測定装置であり、前記，，は上流側よりこの順
番に直列に配置されているフロー方式のフラクトース測
定装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素反応を利用したフ
ラクトースの測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルコースおよびフラクトースは食品中
に一般的に存在する単糖で、ジュース、菓子、食品の甘
味料として広く使用されている。そのため製造工程や品
質管理において、これらを定量する必要性は高い。従来
糖類の測定方法にはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法
や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法がもちい
られていた。しかし、これらの方法では、試料の前処理
が必要である、分析装置やカラムが高価である、有機溶
媒等の危険な物質を使用する、操作が繁雑で測定に時間
がかかる等の問題があった。これらの方法に比較して、
酵素を使用した測定法は、選択性に優れ、上記の問題を
解決するものである（酵素法による食品分析研究会企
画，酵素による食品分析法，株式会社 食品化学新聞社
発行，１９８９年）。

【０００３】酵素を使用した糖の定量法には各種の方法
があるが、例えば、グルコースを測定するためには、グ
ルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）が使用
される。その反応はグルコースを含む試料溶液より溶存
酸素を消費し、グルコノ−δ−ラクトンと過酸化水素を
生成するものであり、減少した酸素もしくは生成した過
酸化水素を測定すればよい。

【０００４】従来、フラクトースの測定には、フラクト
ースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．９９．１１）が
用いられていた。この酵素は、フラクトースと酸化型の
電子伝達体より５−ケト−Ｄ−フラクトースと還元型の
電子伝達体を生成する。電子伝達体には、フェリシアン
化カリウム、２，６−ジクロロフェノール・インドフェ
ノールやフェナジンメトサルフェートが使用できる。そ
して、検出には直接電流値の変化をとらえたり、酸素の
減少を酸素電極でとらえる方法がある。しかし、この方
法はグルコース測定におけるグルコースオキシダーゼに
比べ、測定系に他の物質を添加しなければならず、また
過酸化水素を生成しないので測定が困難である。また、
この酵素は固定化した場合、安定性が悪く固定化に不向
きであり、酵素を使い捨てにするためにコスト的にも高
いという問題があった。

【０００５】また、これらの方法を用いてもグルコース
とフラクトースの２成分の測定を行う場合は、それぞれ
別に測定するので、それぞれの方法での測定範囲に合わ
せて別々に試料の希釈、調製をしなければならない。ま
た検出方法が異なるので簡単に組み合わせることができ
なかった。これらの方法以外に、酵素をもちいてフラク
トースを測定する方法としては、ヘキソキナーゼ（ＥＣ
２．７．１．１）と、グルコース−６−リン酸イソメ
ラーゼ（ＥＣ ５．３．１．９）、グルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）を作
用させ、その作用で補酵素ＮＡＤ（ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰ（ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸）が還元体になったため
変化を生じた吸光度を測定する方法がある。

【０００６】しかしこの方法では、最終検出手段が比色
法であるので、試料の濁りや沈澱物が影響したり、着色
の激しい試料は正確に測定することができない。またこ
れらを除くためには前処理が必要となるといった問題が
あった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決し、フラクトースを電気化学測定法をもちいて
精度良く測定する方法を提供することを目的とする。ま
た本発明はグルコースとフラクトースの２成分の測定方
法を提供する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は下記の態様を含
む。 〔１〕 試料中のフラクトースをヘキソキナーゼにより
フラクトース−６−リン酸にリン酸化し、前記フラクト
ース−６−リン酸にグルコース−６−リン酸イソメラー
ゼを作用させてグルコース−６−リン酸に異性化し、前
記グルコース−６−リン酸に、補酵素酸化体とグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させグルコノ−
δ−ラクトン−６−リン酸と補酵素還元体を生成させ、
前記補酵素還元体に、前記補酵素還元体に作用する第２
のデヒドロゲナーゼ及びその基質酸化体を作用させるこ
とにより、前記補酵素還元体を酸化するとともに前記基
質酸化体を還元し、得られた基質還元体にオキシダーゼ
を作用させ、増加又は減少する電極活性物質を検出する
フラクトース測定方法。

【０００９】〔２〕 あらかじめ試料中に存在するグル
コースを検出し、フラクトース測定値を補正する請求項
１記載のフラクトース測定方法。

【００１０】〔３〕 ヘキソキナーゼ、グルコース−６
−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ及び第２のデヒドロゲナーゼのうち、少なく
とも１種の酵素を固定化して用いる請求項１記載のフラ
クトース測定方法。

【００１１】〔４〕 緩衝液の送液機構、その下流に試
料注入機構、前記試料注入機構の下流にグルコースオ
キシダーゼを固定化したグルコース電極、ヘキソキナ
ーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−乳酸デヒドロ
ゲナーゼの固定化体、Ｌ−乳酸オキシダーゼ固定化
体、並びに過酸化水素電極または酸素電極を具備する
測定装置であり、前記，，は上流側よりこの順番
に直列に配置されているフロー方式のフラクトース測定
装置。

【００１２】上記、、はこの順に上流から直列に
配置されるもので、これにより、試料中のフラクトース
を測定する。は試料中のグルコース量を測定する装置
であり、、、とは並列に配置されても、直列に配
置されてもよいし、全く独立させた別系統としてもよ
い。本発明では、試料中にグルコースが混入している場
合により得られたグルコース量により、、で得
られたフラクトース測定値を補正することができる。

【００１３】〔５〕 オキシダーゼを固定化して使用す
る〔１〕記載のフラクトース測定方法。

【００１４】〔６〕 ヘキソキナーゼ、グルコース−６
−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ及び第２のデヒドロゲナーゼを混合固定化
し、リアクターに充填して使用し、またオキシダーゼを
固定化して使用する〔１〕記載のフラクトース測定方
法。

【００１５】

【作用】本発明において用いられる反応を以下に示す
（図１参照）。

【００１６】ヘキソキナーゼ反応 ヘキソース＋Ｍｇ・ＡＴＰ→ヘキソース−６−リン酸＋
Ｍｇ・ＡＤＰ ヘキソースとしてはグルコース、フラクトースをはじめ
とする六炭糖が基質となりうる。またヘキソキナーゼの
反応はマグネシウムイオンとＡＴＰ（アデノシン三リン
酸）を必要とし、ＡＴＰの高エネルギーリン酸結合がは
ずれて、ヘキソースと結合する。この反応により、グル
コースはグルコース−６−リン酸に、フラクトースはフ
ラクトース−６−リン酸に変換される。

【００１７】グルコース−６−リン酸イソメラーゼ反応 グルコース−６−リン酸＝フラクトース−６−リン酸 この反応は可逆的であり、両方向に進行する。そのた
め、グルコース−６−リン酸を消費する反応が後続して
いる場合には、フラクトース−６−リン酸よりグルコー
ス−６−リン酸が生成する。

【００１８】グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
反応 グルコース−６−リン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）→グルコノ−δ
−ラクトン−６−リン酸＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ この反応は酸化型の補酵素ＮＡＤ（ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰ（ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸）を必要とする。そして
この酵素はグルコース−６−リン酸にのみ特異的に反応
し、フラクトース−６−リン酸や他のヘキソース−６−
リン酸には作用しない。

【００１９】また、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ反応におけるものと同じ補酵素であるＮＡＤまた
はＮＡＤＰに作用する、第２のデヒドロゲナーゼの反応
は以下に示される。 第２のデヒドロゲナーゼ反応 基質還元体＋ＮＡＤ（Ｐ）→基質酸化体＋ＮＡＤ（Ｐ）
Ｈ この反応も可逆的であるから、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼの作用でＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成し、基
質酸化体が存在するなら基質還元体とＮＡＤ（Ｐ）の生
成する方向へ反応は進行する。

【００２０】次に、この基質還元体を測定するためのオ
キシダーゼ反応は以下のようになる。 オキシダーゼ反応 基質還元体＋酸素→基質酸化体＋過酸化水素 上記の各酵素反応により、フラクトース量（グルコース
が混入している場合はグルコースとフラクトースの合計
量）に対応する量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、もしくは対応する
量の第２のデヒドロゲナーゼの基質還元体が得られる。

【００２１】この第２のデヒドロゲナーゼには、基質還
元体のオキシダーゼが存在するものが選ばれ、例えば表
１のような各種のデヒドロゲナーゼおよび、基質を選択
することができる。また、補酵素については、ＮＡＤま
たはＮＡＤＰのいずれかを使用することができる。

【００２２】

【表１】

【００２３】一例として、第２のデヒドロゲナーゼにＬ
−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．２７）を
使用して、オキシダーゼにＬ−乳酸オキシダーゼを使用
する場合について述べ、また図１にＬ−乳酸デヒドロゲ
ナーゼとＬ−乳酸オキシダーゼを使用した場合の酵素反
応の模式図を示す。

【００２４】ＮＡＤ選択性のグルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼと補酵素酸化体としてＮＡＤ、Ｌ−乳酸
デヒドロゲナーゼの基質酸化体としてピルビン酸を用い
て反応させれば、最終的には、試料中のグルコースとフ
ラクトースの合計量を同じモル数又は対応する量のＬ−
乳酸に変換することができる。即ち、反応を完全に行い
全量をＬ−乳酸にまで変換させてからＬ−乳酸を測定し
てもよいし、反応条件を特定して同じ条件で反応させ、
速度論的に測定してもよい。

【００２５】具体的には、ヘキソキナーゼ、グルコース
−６−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ及び第２のデヒドロゲナーゼを溶液のま
ま使用し、最終まで反応させてから測定する方法と、前
記４種の酵素固定化体を内填したカラムリアクター等の
リアクターを用いて一定条件で次々と試料を迅速に処理
する方法が例示できる。

【００２６】固定化によるメリットは、酵素を繰り返し
利用できる、同一条件で再現性よく反応させることがで
きる、試料の前処理を行う必要がない等である。一方、
酵素を溶液で用いる場合は、反応時間を充分とって反応
を終了させてから測定することができる。

【００２７】次に、生成した第２のデヒドロゲナーゼの
基質還元体であるＬ−乳酸の測定にはＬ−乳酸に選択的
に作用する下記のＬ−乳酸オキシダーゼ反応を用いた測
定法が利用できる。 Ｌ−乳酸オキシダーゼ反応 Ｌ−乳酸＋Ｏ₂ →ピルビン酸＋Ｈ₂ Ｏ₂ この反応により生成した過酸化水素、または減少した酸
素を検出することによって、或いはジクロロインドフェ
ノール、フェリシアン化カリウム、ベンゾキノンなどの
電子伝達体、いわゆるメディエーターを介在させること
によってＬ−乳酸を検出することができる。

【００２８】また、酸素の減少または、過酸化水素の増
加等を電極によって電流値に変換して測定する電気化学
的測定法は分光光度計を用いる測定（比色法）と比較し
て試料の濁りや、着色物質を含んでいても影響されず、
操作が簡単であり好ましい。Ｌ−乳酸オキシダーゼ等の
オキシダーゼの使用法は溶液で用いることもできるが固
定化して用いることもできる。

【００２９】特に比較的酵素活性が安定したオキシダー
ゼを固定化することにより高感度でかつ簡便な測定装置
を構成できる。

【００３０】電気化学測定法でもちいられる電極として
は、作用電極・対極より構成される２電極系、または作
用電極・参照電極・対極より構成される３電極系を例示
することができる。電極は例えば測定セル底面中に導電
性物質を埋め込んだり、内壁表面に金属を蒸着する方
法、溶液メッキ法、無電解メッキ法、印刷等の方法で形
成することができる。対極と参照電極は、溶液間抵抗の
影響を小さく抑えるために作用電極の近傍に設けること
が望ましい。

【００３１】作用電極には、金、白金などの金属電極あ
るいはグラッシーカーボン、カーボンペーストなどの通
常電気化学計測で用いられる素材が利用できる。対極に
は作用極ですでに例示した材質やステンレス等の導電性
素材を用いることができ、ステンレスなどの導電性素材
を用いて構成したセルの接液部を対極とすることもでき
る。参照電極には銀・塩化銀参照電極・飽和カロメル参
照電極など一般的なものを例示できる。

【００３２】このように、第２のデヒドロゲナーゼとオ
キシダーゼを組み合わせることにより酸素の減少や過酸
化水素の増加が起こり、フラクトース（グルコースが混
入している場合はグルコースとフラクトースの合計量）
に対応した電気信号を得ることができる。これは、Ｌ−
乳酸デヒドロゲナーゼとＬ−乳酸オキシダーゼの組み合
わせに限定されず、アルコールデヒドロゲナーゼとアル
コールオキシダーゼ等の組み合わせでも測定することが
できる（表１参照）。

【００３３】試料中にグルコースが混入している場合は
図１に例示したような前記の酵素系の反応で得られるの
はグルコースとフラクトースの合計量に対応した値であ
るので、それぞれの濃度を求めたい場合は、グルコース
を別に測定し、得られた合計量よりグルコースの値を補
正することにより、フラクトースの量を求めればよい。

【００３４】また、試料中にグルコースやフラクトース
以外に、Ｌ−乳酸のような第２のデヒドロゲナーゼの基
質還元体が混入している場合はこの量も別途測定して補
正する必要がある。

【００３５】試料中にグルコースが混入している場合、
共存するグルコースの測定は下記のグルコースオキシダ
ーゼ（ＥＣ １．１．３．４）反応を使用して行える。 グルコースオキシダーゼ反応 グルコース＋Ｏ₂ →グルコノ−δ−ラクトン＋Ｈ₂ Ｏ₂ この反応により生成した過酸化水素、または減少した酸
素を前記Ｌ−乳酸の場合( Ｌ−乳酸オキシダーゼによる
測定）と同様に検出すればよい。

【００３６】この反応はグルコースを含む試料溶液より
溶存酸素を消費し、グルコノ−δ−ラクトンと過酸化水
素を生成するものであり、減少した酸素もしくは生成し
た過酸化水素を測定すればよい。生成した過酸化水素を
定量する方法には、４−アミノアンチピリンや、２，
２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン スル
フォン酸）を使用し、発色させ、その吸光度変化を分光
光度計で測定する方法がある。しかしこの方法では、試
料の濁りや汚れがあると正確な測定ができず、また時間
の経過とともに退色する。

【００３７】これに対し、減少した酸素を酸素電極で、
或いは増加した過酸化水素を過酸化水素電極をもちいて
電気化学的に測定する方法は、濁りや着色物質の影響を
受けにくく好ましい。また、グルコースオキシダーゼは
比較的酵素活性が安定しているので固定化して使用する
と、簡便に迅速に精度良く測定することができる。

【００３８】グルコースの検出と、グルコースおよびフ
ラクトース合計量の検出は、別々に行ってもよいが、連
続して行うと、計測時間が短くなり、操作も少なくな
る。

【００３９】以下にＬ−乳酸、グルコース及びフラクト
ースを含む試料を測定する場合を説明する。ヘキソキナ
ーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、第２のデヒドロゲナ
ーゼの各酵素を固定化せず、溶液で加え最終まで反応さ
せてから第２のデヒドロゲナーゼの基質還元体を測定す
る場合は、上記４種の酵素反応前の試料のグルコース濃
度を測定し、また４種の酵素反応後のＬ−乳酸（等の第
２のデヒドロゲナーゼ基質還元体）濃度を測定する。

【００４０】そして試料中に元来Ｌ−乳酸（等の第２の
デヒドロゲナーゼ基質還元体）が含まれる場合はＬ−乳
酸オキシダーゼ（等のオキシダーゼ）を用いて試料中の
Ｌ−乳酸（等）を測定してその値を差し引けばよい。

【００４１】フラクトース測定値を補正するためにはグ
ルコースとＬ−乳酸を測定する必要がある。図２はフロ
ー型のグルコースとＬ−乳酸の２成分測定装置である。
緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ（２）により送液
し、オートサンプラー（３）より試料５μｌを注入す
る。送液された試料は、恒温槽（４）中の過酸化水素電
極の表面にグルコースオキシダーゼを固定化したグルコ
ース電極（５）に接し、グルコースが検出される。

【００４２】その下流ではＬ−乳酸オキシダーゼ固定化
カラム（６）によってＬ−乳酸より過酸化水素が生成
し、過酸化水素電極（７）により電流値の変化が捕らえ
られＬ−乳酸が検出される。これらの電流値の変化は、
検出器（８）により検出され、さらに信号をパーソナル
コンピューター（１０）に送ることもできる。次に試料
に前記４種類の溶液酵素を加え、反応させてから、図２
の装置でＬ−乳酸（等の基質還元体）を測定し、この値
から試料中のグルコースとＬ−乳酸に由来する値を補正
すればフラクトースの定量を行える。

【００４３】次に、グルコースおよびフラクトースから
Ｌ−乳酸を生成させるまでの反応に使用するヘキソキナ
ーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＬ−乳酸デヒド
ロゲナーゼ等の第２のデヒドロゲナーゼは前述したよう
に溶液で用いてもよいし、固定化して用いてもよい。固
定化する場合には、一部の酵素だけを固定化してもよい
し、すべての酵素を固定化してもよい。しかし、実用的
にはすべての酵素を固定化して速度論的に生成物の濃度
を求めるか、すべての酵素を溶液で使用して反応終了後
に測定する方法が簡便である。

【００４４】固定化して使用する場合は、これらの酵素
を固定化した担体を充填したリアクターを形成し、Ｌ−
乳酸オキシダーゼ固定化体の上流側になる位置に設置す
る。

【００４５】図２に例示したグルコースとＬ−乳酸の２
成分測定装置はフロー型の直列のものであるが、これに
限定されず、グルコース電極及び、Ｌ−乳酸オキシダー
ゼ固定化カラムと過酸化水素電極を並列に配置してもよ
い。各酵素を固定化して、本発明のフラクトース測定を
行うには、前記直列又は並列配置したＬ−乳酸オキシダ
ーゼ固定化カラムの上流側（前方）にヘキソキナーゼ、
グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６
−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＬ−乳酸デヒドロゲナ
ーゼ（等の第２のデヒドロゲナーゼ）の固定化体を配置
する（図３参照）。

【００４６】また反応に必要な、ＡＴＰ、マグネシウム
イオン、補酵素酸化型であるＮＡＤ（Ｐ）、ピルビン酸
（等の第２のデヒドロゲナーゼの基質酸化体）は前記４
種の酵素を溶液で使用する場合は、酵素とともに溶液で
加えるが、４種の酵素を固定化して用いる場合は、試料
に添加してからキャリヤー流へ注入してもよいが、緩衝
液等のキャリヤーに添加して送液することもできる。

【００４７】４種の酵素を溶液で使用し、反応が最終ま
で行う場合は、ＡＴＰ、マグネシウムイオン、ピルビン
酸（等）については試料中のグルコースとフラクトース
の合計量と同じモル数だけ必要である。ＮＡＤ（Ｐ）
（ＮＡＤまたはＮＡＤＰを示す）についてはリサイクル
するのでそれより少なくても、反応は進行する。そのた
め、溶液法で最終まで反応を行う場合は、ＡＴＰ、マグ
ネシウムイオン、ピルビン酸については測定範囲の１倍
以上の濃度が必要であり、ＮＡＤ（Ｐ）に関しては、そ
れより少なくても反応は進行する。

【００４８】また、４種の内少なくとも１種の酵素の固
定化体をもちいて測定する場合は、完全に反応を終了さ
せなくてもよいので、特に濃度について限定はないが、
少なければ測定範囲が狭くなり感度も小さくなる、ま
た、増加させれば固定化酵素の反応速度が早くなり、変
換率が上昇する。しかし増加させれば高価な補酵素を使
用するため分析コストは高くなる。また試料に添加する
場合は、グルコースとフラクトースの合計量との比率を
求めることができるが、緩衝液中に加える場合は試料の
拡散が起こるのでグルコースとフラクトースの合計量と
の比率は注入量や装置の配管系によって異なる。緩衝液
中に添加する場合のＡＴＰ、マグネシウムイオン、ピル
ビン酸およびＮＡＤ（Ｐ）については、例えばそれぞれ
０．１〜５ｍＭ程度の濃度で添加し、好ましくは０．５
〜２ｍＭ程度である。

【００４９】図３のように前記４種の酵素を固定化した
リアクター（Ａ）を具備する装置で測定する場合、緩衝
液等のキャリヤーにＡＴＰ、マグネシウムイオン、ピル
ビン酸およびＮＡＤ（Ｐ）を添加しないで測定した場合
（試料中に含まれていたＬ−乳酸等の測定）と緩衝液に
添加した場合（フラクトース，グルコース等より変換さ
れたＬ−乳酸と当初より含まれていたＬ−乳酸の値）を
比較することによりＬ−乳酸の影響を補正することがで
きる。

【００５０】またキャリヤではなく、試料液にＡＴＰ、
マグネシウムイオン、ピルビン酸およびＮＡＤ（Ｐ）を
添加して測定する場合は同様に、試料液中に添加しない
場合と比較するこによりＬ−乳酸の影響を補正すること
ができる。反応に利用する酵素量は特に限定されず、反
応時間、反応容量、分析コストを考慮にいれて決定すれ
ばよい。

【００５１】グルコースオキシダーゼ、Ｌ−乳酸オキシ
ダーゼをはじめ、その他の酵素の固定化法は、吸着法、
化学結合法、包括法等のいずれでも良い。固定化に用い
る担体にはケイソウ土、シリカゲル、ガラスビーズ、ア
ルミナ、セラミック、カーボン、活性炭、モレキュラー
シーブ、シリコンゴム、セルロース、アガロース、アミ
ノ酸系ポリマー等が使用できる。固定化酵素は、例えば
カラム等につめてリアクターを構成してもよいし、電極
表面の膜上に固定化してもよい。

【００５２】酵素を固定化してもちいる場合は、固定化
リアクターの容量を増加させると多くの酵素を固定化で
きるが、試料の通過時間が多くなり、拡散も大きくなる
ので測定には不利になる。そのため、実用的なリアクタ
ーの容量は１０〜５００μｌ程度、望ましくは５０〜２
００μｌ程度である。測定装置において送液するキャリ
ヤとしては緩衝液が利用できる。緩衝液としては装置に
もちいる固定化酵素の使用ｐＨに適したものが使用され
る。そして、これらの酵素に関してはｐＨ６〜９程度で
あり、好ましくは７〜８である。このｐＨ域で緩衝能が
あり、しかも酵素反応を阻害したり、電極を妨害しない
ものが使用でき、例えばトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン塩や、ホウ酸塩等がもちいられる。

【００５３】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。

【００５４】実施例１ 試料としてグルコース、フラクトースそれぞれの溶液に
ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラー
ゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＬ
−乳酸デヒドロゲナーゼとその反応に必要なＡＴＰ、マ
グネシウムイオン、ＮＡＤおよびピルビン酸を加え一定
時間反応させた後にＬ−乳酸オキシダーゼ固定化カラム
と白金電極により電流値を測定した。

【００５５】また反応開始前の溶液を、グルコースオキ
シダーゼを白金電極表面上に固定化したグルコース電極
により測定した。

【００５６】１）Ｌ−乳酸オキシダーゼ固定化カラムの
製造方法 ケイソウ土を焼成した耐火レンガ（３０〜６０メッシ
ュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロピ
ルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬
した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうしてア
ミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒドに
１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ
７．０、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液で置き換
え、この緩衝液をできるだけ除いておく。このホルミル
化した耐火レンガにｐＨ７．０、１００ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液にＬ−乳酸オキシダーゼ（シグマ社製、ペ
ディオコッカス由来）５０ユニット／ｍｌの濃度で溶解
した溶液２００μｌを接触させ、０〜４℃で１日放置し
固定化する。この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長
さ３０ｍｍのカラムに充填しＬ−乳酸オキシダーゼ固定
化カラムとする。

【００５７】２）過酸化水素電極の製造方法 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極を参照極として、０．１Ｍ
硫酸中、＋２．０Ｖで１０分間の電解処理を行う。その
後白金線をよく水洗した後、４０℃で１０分間乾燥し、
１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水ト
ルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄する。牛血清アルブミ
ン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ）２０ｍｇを蒸
留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタルアルデヒドを
０．２％になるように加える。この混合液を手早く先に
用意した白金線上に５μｌのせ、４０℃で１５分間乾燥
硬化して過酸化水素選択透過膜を形成した。これを過酸
化水素電極とする。

【００５８】また参照電極としてはＡｇ／ＡｇＣｌ参照
電極を用い、対極には導電性の配管を用いた。

【００５９】３）グルコース電極の製造方法 ２）で作製した過酸化水素電極と同じ過酸化水素電極を
もちいて、そのアルブミン製の選択透過膜上に、グルコ
ースオキシダーゼ（シグマ社製、Ｔｙｐｅ ＩＩ）５ｍ
ｇ／ｍｌと牛血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔ
ｉｏｎ Ｖ）５ｍｇ／ｍｌにグルタルアルデヒドを０．
２％になるように加えた溶液を５μｌのせ４０℃で１５
分間乾燥硬化させて、グルコースオキシダーゼ固定化膜
を形成した。これを作用極とし、参照電極としてはＡｇ
／ＡｇＣｌ参照電極を用い、対極には導電性の配管を用
いた。

【００６０】４）グルコース・Ｌ−乳酸測定装置 図２はフロー型のグルコースとＬ−乳酸の２成分測定装
置である。緩衝液槽（１）より緩衝液をポンプ（２）に
より送液し、オートサンプラー（３）より試料５μｌを
注入する。送液された試料は、恒温槽（４）中の過酸化
水素電極の表面にグルコースオキシダーゼを固定化した
グルコース電極（５）によりグルコースから過酸化水素
が生成し電流値の変化をとらえる。その後方ではＬ−乳
酸オキシダーゼ固定化カラム（６）によってＬ−乳酸よ
り過酸化水素が生成し、過酸化水素電極（７）により電
流値の変化が捕らえられる。これらの電流値の変化は、
検出器（８）により検出される。さらに信号をパーソナ
ルコンピューター（１０）に送ることもできる。

【００６１】緩衝液は１００ｍＭトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン、５０ｍＭ塩化カリウムを含みｐＨ
７．５である。

【００６２】５）測定方法 試料として、グルコースまたはフラクトースをそれぞれ
２、４、１０ｍＭ含有する６種類の溶液各１ｍｌに、ヘ
キソキナーゼ（酵母由来）１Ｕ／ｍｌ、グルコース−６
−リン酸イソメラーゼ（酵母由来）３Ｕ／ｍｌ、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓ
ｔｏｃ種由来）１Ｕ／ｍｌおよびＬ−乳酸デヒドロゲナ
ーゼ（ブタ筋肉由来）５Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰ２０ｍＭ、マ
グネシウムイオン２０ｍＭ、ＮＡＤ１０ｍＭおよびピル
ビン酸２０ｍＭを含む２００ｍＭトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン緩衝液ｐＨ７．５を１ｍｌ加え、３
０℃で１時間反応させた。

【００６３】酵素溶液を添加する前後でグルコース、フ
ラクトース溶液のグルコース、Ｌ−乳酸濃度を測定し
た。

【００６４】６）結果 表２に４種の酵素反応前と酵素反応後のグルコースとＬ
−乳酸の測定値を示す。反応終了後の試料は、半分に希
釈されているので得られた値を２倍してＬ−乳酸濃度を
求めた。グルコースおよびフラクトースから、同じモル
濃度のＬ−乳酸が生成した。また反応前のグルコース溶
液はグルコース電極でグルコースが検知されたが、反応
終了後にはグルコースは検知されなかった。

【００６５】

【表２】

【００６６】このように酵素溶液を用いて溶液系で充分
反応時間をかけた場合は、図１に従ってフラクトースま
たはグルコースはそれぞれ同モル量のＬ−乳酸を生じさ
せる。従って、例えば試料に対し上記酵素反応を行い、
次にＬ−乳酸を測定した値（Ｌ−乳酸、グルコース、フ
ラクトースの合計量）から、試料中の当初グルコース測
定値と試料中の当初のＬ−乳酸値を引けば、試料中のフ
ラクトース量が得られることが判明した。

【００６７】実施例２ 実施例１で用いた図２の装置のＬ−乳酸オキシダーゼ固
定化カラム（６）の上流側にヘキソキナーゼ、グルコー
ス−６−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼおよびＬ−乳酸デヒドロゲナーゼの固
定化カラム（Ａ）を設け、緩衝液にＡＴＰ、マグネシウ
ムイオン、ＮＡＤおよびピルビン酸を加えて測定を行っ
た。試料としては、グルコース液、フラクトース液、又
はＬ−乳酸液を用いた。

【００６８】１）ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リ
ン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼおよびＬ−乳酸デヒドロゲナーゼの固定化カラム
（図３にＡとして示したカラム）の製造方法 ケイソウ土を焼成して得た耐火レンガ（６０〜８０メッ
シュ）１５０ｍｇをよく乾燥し、１０％γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸
漬した後、よくトルエンで洗浄し、乾燥する。こうして
アミノシラン化処理した担体を５％グルタルアルデヒド
に１時間浸漬した後、よく蒸留水で洗浄し、最後にｐＨ
７．５、１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン緩衝液で置き換え、この緩衝液をできるだけ除い
ておく。このホルミル化した耐火レンガにヘキソキナー
ゼ（酵母由来）５０ユニット、グルコース−６−リン酸
イソメラーゼ（酵母由来）５０ユニット、グルコース−
６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ
種由来）５０ユニットおよびＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ
（ブタ筋肉由来）５０ユニットを、ｐＨ７．５、１００
ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液５
００μｌに溶解した溶液を接触させ、０〜４℃で１日放
置し固定化する。

【００６９】この酵素固定化担体を内径３．５ｍｍ、長
さ３０ｍｍのカラムに充填しヘキソキナーゼ、グルコー
ス−６−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼおよびＬ−乳酸デヒドロゲナーゼの固
定化カラムとする。

【００７０】２）グルコース・フラクトース・Ｌ−乳酸
測定装置 図３に示すフロー型装置を用いる。これは図２のグルコ
ース電極（５）とＬ−乳酸オキシダーゼ固定化カラム
（６）の間にヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸
イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼおよびＬ−乳酸デヒドロゲナーゼの固定化カラム
（Ａ）を設けた。

【００７１】緩衝液の組成は１００ｍＭトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン、５０ｍＭ塩化カリウムを含
み、ＡＴＰ、マグネシウムイオン、ＮＡＤおよびピルビ
ン酸をそれぞれ０．５ｍＭ添加し、ｐＨ７．５である。
また、流速１．０ｍｌ／分、恒温槽の温度３０℃で測定
した。

【００７２】３）測定方法 ２）の測定装置を用いて、グルコースまたはフラクトー
スそれぞれ５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭの溶液、及びＬ
−乳酸の５ｍＭ液をそれぞれオートサンプラーを用いて
５μｌ注入した。

【００７３】４）結果 それぞれの試料の電流値は表３のようになり、グルコー
ス、フラクトースのグルコース電極、過酸化水素電極で
の検量線は以下のようになった。ただしｒは相関係数、
Ｘは濃度（ｍＭ）、Ｙは電流値（ｎＡ）を示す。

【００７４】

【表３】

【００７５】グルコース電極 グルコース検量線 Ｙ＝１１．２０Ｘ＋０．１６ ｒ
＝１．０００

【００７６】過酸化水素電極 グルコース検量線 Ｙ＝ ５．３９Ｘ＋０．１９ ｒ
＝０．９９９ フラクトース検量線 Ｙ＝ １．６９Ｘ−０．１０ ｒ
＝０．９９９

【００７７】Ｌ−乳酸検量線 Ｙ＝ ２１．９８Ｘ

【００７８】上記のように、グルコース電極では注入し
たグルコース濃度に比例した電流値が、過酸化水素電極
ではグルコースとフラクトースそれぞれに比例した電流
値が得られることがわかった。そのため、試料中のグル
コース濃度とフラクトース濃度は、グルコース電極と過
酸化水素電極の両方で得られた電流値から求めることが
できる。

【００７９】具体的には、まずグルコース電極で得られ
た電流値を、グルコース電極のグルコース検量線に代入
してグルコース濃度を求める。次に、このグルコース濃
度を過酸化水素電極のグルコース電極検量線に代入する
ことにより、過酸化水素電極における電流値からグルコ
ース由来の電流値を求めることができる。そして、過酸
化水素電極の電流値のうち、グルコース由来の電流値を
差し引いた残りの電流値をフラクトースの検量線に代入
しフラクトース濃度を求めることができる。

【００８０】以上の方法は、試料中にＬ−乳酸を含まな
い場合の測定方法であるが、試料中にＬ−乳酸が含まれ
る場合は、あらかじめＬ−乳酸だけを別に測定する。そ
の方法は、緩衝液中のＡＴＰ，マグネシウムイオン，Ｎ
ＡＤおよびピルビン酸のうちいずれか１種以上の成分を
除いて、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソ
メラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼお
よびＬ−乳酸デヒドロゲナーゼの固定化カラムが作用し
ないようにすればよい。また、実施例１に用いた図２の
装置のように、カラムをはずしてもよい。

【００８１】その後２）のように測定するが、このとき
Ｌ−乳酸の検量線も求めておく。そして、過酸化水素電
極の電流値よりＬ−乳酸由来の電流値を差し引いて、前
記した方法と同様にグルコースとフラクトースの濃度を
求めればよい。

【００８２】

【発明の効果】本発明によればフラクトースを電気化学
的に精度良く測定することが出来た。また、グルコース
とフラクトースを同時に測定することもでき、グルコー
ス，フラクトースとＬ−乳酸を同時に測定することもで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の酵素反応の一例の模式図であ
る。

【図２】図２は実施例１で使用したフロー方式のグルコ
ース・Ｌ−乳酸測定装置を示す。

【図３】図３は実施例２で使用したフロー方式のグルコ
ース・フラクトース・Ｌ−乳酸測定装置を示す。

【符号の説明】

１ 緩衝液槽 ２ ポンプ ３ サンプラー ４ 恒温槽 ５ グルコースオキシダーゼ固定化電極 ６ Ｌ−乳酸オキシダーゼ固定化カラム ７ 過酸化水素電極 ８ 検出器 ９ シングルボードコンピュータ １０ パーソナルコンピュータ １１ ＲＳ２３２Ｃコード １２ サンプラ制御信号 １３ 送液ポンプ制御信号 １４ 廃液 Ａ ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラ
ーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−
乳酸デヒドロゲナーゼ固定化カラム

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中のフラクトースをヘキソキナーゼ
   によりフラクトース−６−リン酸にリン酸化し、前記フ
   ラクトース−６−リン酸にグルコース−６−リン酸イソ
   メラーゼを作用させてグルコース−６−リン酸に異性化
   し、 前記グルコース−６−リン酸に、補酵素酸化体とグルコ
   ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作用させグルコノ
   −δ−ラクトン−６−リン酸と補酵素還元体を生成さ
   せ、 前記補酵素還元体に、前記補酵素還元体に作用する第２
   のデヒドロゲナーゼ及びその基質酸化体を作用させるこ
   とにより、前記補酵素還元体を酸化するとともに前記基
   質酸化体を還元し、 得られた基質還元体にオキシダーゼを作用させ、増加又
   は減少する電極活性物質を検出するフラクトース測定方
   法。
2. 【請求項２】 あらかじめ試料中に存在するグルコース
   を検出し、フラクトース測定値を補正する請求項１記載
   のフラクトース測定方法。
3. 【請求項３】 ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン
   酸イソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
   ーゼ、及び第２のデヒドロゲナーゼのうち、少なくとも
   １種の酵素を固定化して用いる請求項１記載のフラクト
   ース測定方法。
4. 【請求項４】 緩衝液の送液機構、その下流に試料注入
   機構、前記試料注入機構の下流にグルコースオキシダ
   ーゼを固定化したグルコース電極、ヘキソキナーゼ、
   グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グルコース−６
   −リン酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−乳酸デヒドロゲナー
   ゼの固定化体、Ｌ−乳酸オキシダーゼ固定化体、並び
   に過酸化水素電極または酸素電極を具備する測定装置
   であり、前記，，は上流側よりこの順番に直列に
   配置されているフロー方式のフラクトース測定装置。