JP2021089141A - バイオセンサ - Google Patents

Abstract

【課題】 電気化学的測定方法に用いるバイオセンサであって、ブランク電流を低減することで高精度の測定が可能なバイオセンサを提供すること。【解決手段】 タンパク質とメディエータとを用いて被検液中の成分を分析するバイオセンサであって、絶縁性基材とカバーとの間にスペーサを介して形成された１つ以上の空間部を有し、少なくとも１つの前記空間部の内面には、導電部と非導電部とを有し、前記タンパク質を含む第１試薬部と前記メディエータを含む第２試薬部は前記内面の異なる場所に別々に配置され、前記第１試薬部と前記第２試薬部の少なくとも一方が、前記非導電部に配置されている。【選択図】図４

Description

本発明は、バイオセンサに関し、さらに詳しくは電気化学的測定法を用いたバイオセンサに関する。

医療分野や臨床検査分野等の種々の分野で生体試料内の検出対象物質を測定するためバイオセンサが用いられている。バイオセンサの一例として、電気化学的測定法を用いたバイオセンサが知られている（例えば、特許文献１）。このバイオセンサは、絶縁性基材上に作用極、対極および参照極を形成し、これらの電極に接して酵素と電子受容体（以下、メディエータという）とを含む酵素反応層（試薬部ともいう）を形成している。このようなバイオセンサによれば、原理的には、測定対象物質を基質とする酵素を選択することによって、様々な物質の測定が可能である。例えば、酵素にグルコースオキシダーゼを選択することで、試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサが実用化されている。

一方、近年、糖尿病診断の指標として、糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質の測定が広く行われている。例えば、ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃと略す）は糖化ヘモグロビンの１つであり、ＨｂＡ１ｃ値は、赤血球中のヘモグロビンのうち、糖と結合しているヘモグロビンの割合を示す検査値である。ＨｂＡ１ｃ値は、過去１〜２ヶ月の平均的な血糖値を反映するため、血液中のグルコース量と比較すると、検査前の食事の影響を受けにくく、糖尿病を管理する指標として重要である。ＨｂＡ１ｃ値は、光学的分光方法を用い、ＨＰＬＣ法や免疫法により測定されている。

特開平３−２０２７６４号公報

ＨｂＡ１ｃ値を測定する場合、検査試料は、溶血処理により、例えば１００倍程度に希釈される（以下、本明細書では、溶血処理等の前処理を行って測定に供される試料液を被検液という）。そのため、被検液中のＨｂＡ１ｃ濃度は、グルコース濃度に比べて大幅に低下し、通常、μＭオーダーの低濃度となる。このような低濃度のＨｂＡ１ｃ濃度を電気化学的測定法で測定しようとすると、ブランク電流の影響が大きくなり、Ｓ／Ｎ比が低下し、測定が困難となるという問題がある。そのため、電気化学的測定法を用いたＨｂＡ１ｃ値の測定方法は実用化されていない。ブランク電流を低減することができれば、電気化学的測定法を用いることで、高精度のＨｂＡ１ｃ値測定が可能となることが期待できる。また、被検出物質として、ＨｂＡ１ｃ以外のタンパク質、例えばヘモグロビン、糖化アルブミン、またはグルコース、コレステロール、乳酸、ケトン体（３−ヒドロキシ酪酸）、抗体等についても、ブランク電流を低減できれば、高精度の測定が可能となる。

そこで、本発明は、電気化学的測定方法に用いるバイオセンサであって、ブランク電流を低減することで高精度の測定が可能なバイオセンサを提供することを目的とした。

上記課題を解決するため、本発明のバイオセンサは、タンパク質とメディエータとを用いて被検液中の成分を分析するバイオセンサであって、絶縁性基材とカバーとの間にスペーサを介して形成された１つ以上の空間部を有し、少なくとも１つの前記空間部の内面には、導電部と非導電部とを有し、前記タンパク質を含む第１試薬部と前記メディエータを含む第２試薬部は前記内面の異なる場所に別々に配置され、前記第１試薬部と前記第２試薬部の少なくとも一方が、前記非導電部に配置されている、ことを特徴とする。

本発明によれば、ブランク電流を低減することで高精度の測定が可能なバイオセンサを提供することができる。

実施の形態１に係るバイオセンサＡの構造の一例を示す斜視図である。 図１のバイオセンサＡの分解斜視図である。 図１のバイオセンサＡを構成する絶縁性基材の平面図である。 図１のバイオセンサＡの長手方向に沿った縦断面図である。 実施の形態２に係るバイオセンサＢの構造の一例を示す分解斜視図である。 図５のバイオセンサＢの長手方向に沿った縦断面図である。 実施の形態３に係るバイオセンサＣを構成する絶縁性基材の平面図である。 実施の形態３に係るバイオセンサＣの長手方向に沿った縦断面図である。 参考例におけるブランク電流値を示すグラフである。 参考例におけるブランク電流値を示すグラフである。 参考例におけるブランク電流値を示すグラフである。 本発明における検出電流値と被検出物質の濃度の関係を示すグラフの一例である。

以下、図面等を参照することで本発明の実施の形態について詳細に説明する。

本発明のバイオセンサは、タンパク質とメディエータとを用いて被検液中の成分を分析するバイオセンサであって、絶縁性基材とカバーとの間にスペーサを介して形成された１つ以上の空間部を有し、少なくとも１つの前記空間部の内面には、導電部と非導電部とを有し、前記タンパク質を含む第１試薬部と前記メディエータを含む第２試薬部は前記内面の異なる場所に別々に配置され、前記第１試薬部と前記第２試薬部の少なくとも一方が、前記非導電部に配置されている、ことを特徴とするものである。

実施の形態１
図１は本実施の形態に係るバイオセンサＡの構造の一例を示す斜視図であり、図２は分解斜視図である。バイオセンサＡは、導電部４を有する絶縁性基材１とカバー２とが、スペーサ３を介して積層されている。図１では、Ｘ方向を長手方向とし、Ｙ方向を幅方向とする長矩形片形状を有する例を示している。

対向する一対の主面を有する絶縁性基材１の一方の主面には導電部４が形成されている。導電部４は、導電性部分であり、第１電極対４１と第２電極対４２、絶縁性基材１の一端部に形成された端子部４３、第１電極対４１および第２電極対４２と端子部４３とを接続するリード部４４を有している。図３は、絶縁性基材１の平面図であり、第１電極対４１は、長手方向に配置され、互いに導通する一対の作用電極４１ａ，４１ａと、平面視で各作用電極４１ａを挟むように微小空隙（後述する）を介して各作用電極４１ａと対向する一対の対極４１ｂ、４１ｂを２対、有している。また、第２電極対４２は、第１電極対４１と離間するように長手方向に配置された作用電極４２ａと、平面視で作用電極４２ａを挟むように微小空隙（後述する）を介して作用電極４２ａと対向する一対の対極４２ｂ、４２ｂを有している。一対の作用極４１ａ，４１ａはリード４４ａを介して端子４３ａに接続され、２対の対極４１ｂ，４１ｂはリード４４ｄを介して端子４３ｄに接続され、作用極４２ａはリード４４ｂを介して端子４３ｂに接続され、一対の対極４２ｂ、４２ｂはリード４４ｃを介して端子４３ｃに接続されている。なお、図２の場合も図３の場合も、後述する第１試薬部と第２試薬部を除いた構造を示している。また、第１電極対４１と第２電極対４２の２つの電極対は、被検液中の異なる２種の被検出物質を測定する場合に用いることができる。２種の被検出物質を測定する場合としては、例えば、ＨｂＡ１ｃ値を測定する場合であり、第１電極対４１でＨｂＡ１ｃの濃度を測定し、第２電極対４２でＨｂの濃度を測定することができる。また、第１電極対４１には２つの作用極を用いた例を示したが、第２電極対４２の場合と同様に１つの作用極を用いた構成とすることもできる。

スペーサ３には、少なくとも１つの開口部があればよいが、本実施の形態では、長手方向に沿って互いに離間して形成された２つの開口部３ａ，３ｂを有している。また、スペーサ３は、端子部４３が露出するように、絶縁性基材１よりも長さを短くしている。また、カバー２は、長手方向の一端部に開口部２ａ、他端部に開口部２ｃを有するとともに、開口部２ａと開口部２ｂとの中間部に開口部２ｂを有している。また、カバー２も、スペーサ３の場合と同様に、端子部４３が露出するように、絶縁性基材１よりも長さを短くしている。ここで、スペーサ３の開口部とカバー２の開口部とは、スペーサ３とカバー２とを積層した時に、カバー２の中央部の開口部２ｂが、スペーサ３の開口部３ａの中央側端部と開口部３ｂの中央側端部の両方と一部が重なるように配置され、またカバー２の一端部の開口２ａがスペーサ３の開口部３ａの側端部と少なくとも一部が重なり、カバー２の他端部の開口２ｃがスペーサ３の開口部３ｂの側端部と少なくとも一部が重なるように配置される。

図４は、図１に示すバイオセンサＡの長手方向に沿った縦断面図である。スペーサ３の開口部３ａ，３ｂは、スペーサ３が、絶縁性基材１とカバー２との間に挟まれることにより、互いに独立した２つの第１空間部６と第２空間部７を形成している。第１空間部６と第２空間部７の各空間部において、空間部に露出する絶縁性基材１の一方の主面は空間部の底面を構成する。また、カバー２は、対向する一対の主面を有し、空間部に露出する一方の主面は空間部の頂面を構成する。また、スペーサ３の開口部の内面は空間部の側面を構成する。

本発明のバイオセンサは、空間部の内面に導電部と非導電部を有している。ここで、導電部とは、上記の通り、導電性部分であり、作用極と対極を含む電極と、リード部と、端子部とを含んでいる。第１空間部６における導電部とは、第１電極対４１とリード部である。これに対し、第１空間部６における非導電部とは、導電性ではない部分、具体的には、絶縁性基材１において電極やリードが形成されていない部分、スペーサ３の開口部３ａの内周面、およびスペーサ３の対向する一対の主面のうち、カバー２と接していない主面５（以下、裏面ともいう）を挙げることができる。また、第２空間部７における導電部とは、第２電極対４２とリード部である。これに対し、第２空間部７の非導電部とは、絶縁性基材１において電極やリードが形成されていない部分、スペーサ３の開口部３ｂの内周面、スペーサ３の対向する一対の主面のうち、カバー２と接していない裏面５挙げることができる。

本発明では、タンパク質を含む第１試薬部とメディエータを含む第２試薬部は少なくとも１つの空間部の内面の異なる場所に別々に配置され、第１試薬部と第２試薬部の少なくとも一方が、非導電部に配置される。本実施の形態では、第１空間部６において、第１試薬部８が、導電部である第１電極対４１と第２電極対４２の表面に配置され、第２試薬部９が、非導電部であるカバー２の裏面５に配置されている。また、第２空間部７においては、第２電極対４２の表面に第２試薬部９を配置している。

なお、カバー２の中央部の開口部２ｂは、被検液の導入開口として用いることができ、開口部２ｂに被検液を滴下すると、被検液は第１空間部６と第２空間部７へと流れていき、第１空間部６では、第１試薬部８と第２試薬部９と接する。即ち、本発明における空間部とは、被検液を保持する保持領域と、被検液と第１試薬部および第２試薬部との反応を進行させる反応領域を提供する。また、カバー２の両端部の開口２ａ，２ｃは、それぞれ、第１空間部６と第２空間部７の内部に空気を提供するとともに、カバー２の中央部の開口部２ｂから被検液が滴下された時には、被検液の引き込みに伴い、内部の空気を逃がす働きをする。

絶縁性基材に用いる材料は特に限定されないが、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリオキシメチレン、モノマーキャストナイロン、ポリブチレンテレフタレート、メタクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂等の樹脂材料、あるいはガラス材料を用いることができる。好ましくはポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、およびポリイミドであり、より好ましくはポリエチレンテレフタレートである。絶縁性基材の大きさは特に限定されない。例えば、全長は５〜１００ｍｍ、幅は２〜５０ｍｍ、厚さは０．０５〜２ｍｍであり、好ましくは、全長は７〜５０ｍｍ、幅は３〜２０ｍｍ、厚さは０．１〜１ｍｍであり、より好ましくは、全長は１０〜３０ｍｍ、幅は３〜１０ｍｍ、厚さは０．１〜０．６ｍｍである。

絶縁性基材上の導電部は、例えば、カーボン、金、白金、パラジウム等を材料として、スパッタリング法や蒸着法を用いて導電層を形成し、次いでレーザトリミング法を用いて所定の電極パターンに加工することで形成することができる。ここで、レーザトリミング法により、作用極と対極との間の微小空隙、リード間の微小空隙、および端子間の微小空隙を形成することで、電極間、リード間、および端子間の電気絶縁性を確保している。

スペーサの材料は特に限定されない。例えば、絶縁性基材と同様の材料を用いることができる。また、スペーサの大きさも特に制限されない。例えば、全長は５〜１００ｍｍ、幅は２〜５０ｍｍ、厚さは０．０１〜１ｍｍ、好ましくは、全長は７〜５０ｍｍ、幅は３〜２０ｍｍ、厚さは０．０５〜０．５ｍｍ、より好ましくは、全長は１０〜３０ｍｍ、幅は３〜１０ｍｍ、厚さは０．０５〜０．２５ｍｍである。

カバーの材料は特に限定されない。例えば、絶縁性基材と同様の材料を用いることができる。カバーの大きさも特に制限されない。例えば、全長は５〜１００ｍｍ、幅は３〜５０ｍｍ、厚さは０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは、全長は１０〜５０ｍｍ、幅は３〜２０ｍｍ、厚さは０．０５〜０．２５ｍｍ、より好ましくは、全長は１５〜３０ｍｍ、幅は５〜１０ｍｍ、厚さは０．０５〜０．１ｍｍである。カバーには空気孔または被検液導入口として用いる複数の開口が形成されていることが好ましい。開口の形状は、例えば、円形、楕円形、多角形等を用いることができる。開口の大きさは、例えば、最大直径が、０．０１〜１０ｍｍ、好ましくは０．０５〜５ｍｍ、より好ましくは０．１〜２ｍｍである。開口は、レーザやドリルで穿孔して形成してもよく、あるいは金型を用いて成形することで形成することもできる。

バイオセンサは、絶縁性基材、スペーサ、およびカバーをこの順で積層し、接着剤や熱融着等で貼り合わせて一体化することで製造することができる。接着剤には、エポキシ系接着剤、アクリル系接着剤、ポリウレタン系接着剤、ホットメルト接着剤、ＵＶ硬化性接着剤等を用いることができる。

本発明のバイオセンサは、第１試薬部がタンパク質を含み、第２試薬部がメディエータを含む。タンパク質としては、酵素、抗体、免疫グロブリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン等を挙げることができる。酵素としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ等の酸化還元酵素を挙げることができる。これらの酸化還元酵素は、グルコース、乳酸、コレステロール、ビリルビン、糖化アミノ酸、または糖化ペプチド、ケトン体（３−ヒドロキシ酪酸）に作用する酸化酵素または脱水素酵素である。酸化還元酵素の量は、例えば、センサ１個当り、もしくは１回の測定当り、例えば、０．０１〜１００Ｕであり、好ましくは、０．０５〜１０Ｕであり、より好ましくは、０．１〜５Ｕである。

メディエータには、限定するものではないが、金属錯体（例えば、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、鉄錯体等）、キノン化合物（例えば、ベンゾキノン、ナフトキノン、フェナントレンキノン、フェナントロリンキノン、アントラキノン、及びそれらの誘導体等）、フェナジン化合物、ビオロゲン化合物、フェノチアジン化合物、及びフェノール化合物が挙げられる。より具体的にはフェリシアン化カリウム、ヘキサアンミンルテニウム、フェロセン、ポリ（１−ビニルイミダゾール）−ビス（ビピリジン）クロロオスミウム、ヒドロキノン、２−メチル−１，４−ベンゾキノン、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸塩、９，１０−フェナントレンキノン−２−スルホン酸塩、９，１０−フェナントレンキノン−２，７−ジスルホン酸塩、１，１０−フェナントロリン−５，６−ジオン、アントラキノン−２−スルホン酸塩、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、メチルビオロゲン、ベンジルビオロゲン、メチレンブルー、メチレングリーン、２−アミノフェノール、２−アミノ−４−メチルフェノール、及び２，４−ジアミノフェノールからなる群から選ばれる１種以上が用いられる。上記塩としては、限定するものではないが、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩等が挙げられる。メディエータの配合量は、特に制限されず、１回の測定当り若しくはバイオセンサ１個当り、例えば、０．１ｐｍｏｌ〜１００μｍｏｌであり、好ましくは、１０ｐｍｏｌ〜１０μｍｏｌであり、より好ましくは、５０ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌである。

本発明では、タンパク質を含む第１試薬部とメディエータを含む第２試薬部を空間部の内面の異なる場所に別々に配置するため、タンパク質を含む第１試薬部とメディエータを含む第２試薬部とは別々に調製する。第１試薬部と第２試薬部には、それぞれ必要に応じて、緩衝剤、親水性高分子等の添加剤を添加することもできる。また、第１試薬部には酵素安定化剤を添加することもできる。これらの各物質を水に溶解させ、被塗布部に塗布し、乾燥させることで、試薬部を形成する。被塗布部とは、本実施の形態では、第１試薬部の場合は、導電部である第１電極対であり、また第２試薬部の場合は、カバーの裏面である。

以下、バイオセンサＡを用いた被検液の測定手順について、ＨｂＡ１ｃ値を測定する場合について、図１，４を参照して説明する。
まず、被検者から採取した検体について、必要に応じて前処理を行い、被検液を用意する。

バイオセンサＡの第１電極対４１を用いて測定する場合、端子部４３の端子を測定装置（非図示）に接続する。

被検液をスポイトで吸い取り、カバー２の被検液導入用の開口２ｂに被検液を滴下する。

ＨｂＡ１ｃ値を測定する場合には、第１電極対４１でＨｂＡ１ｃの濃度を測定し、第２電極対４２でＨｂの濃度を測定する。ここで、第１空間部６の第１試薬部８は、例えばフルクトシルペプチドオキシダーゼを含み、第２試薬部は、例えばフェリシアン化カリウムを含む。カバー２の被検液導入用の開口部２ｂに滴下された被検液中のフルクトシルバリルヒスチジンは、第１空間部６内に配置された第１試薬部８のフルクトシルペプチドオキシダーゼと反応し、第２試薬部９に含まれるフェリシアン化カリウムはフェロシアン化カリウムに還元されるが、電圧印加に伴い、フェリシアン化カリウムに酸化される。その酸化電流は被検液中のＨｂＡ１ｃの濃度に応じて変化するので、その酸化電流を測定することで被検液中のＨｂＡ１ｃの濃度を測定することができる。

一方、第２空間部７に導入された被検液中のＨｂと第２試薬部９に含まれるフェリシアン化カリウムとは酸化還元反応を行う。この反応に伴う電流を第２電極対４２で測定することにより、Ｈｂの濃度を測定することができる。これにより、ＨｂＡ１ｃ値を算出することができる。

従来のバイオセンサでは、酵素とメディエータの両方を含む塗液を電極に塗布して乾燥した塗膜を試薬部として用いていた。これに対し、本実施の形態によれば、タンパク質を含む第１試薬部とメディエータを含む第２試薬部を別々に配置するとともに、第１試薬部と第２試薬部の少なくとも一方を、非導電部に配置することで、従来のバイオセンサに比べ、ブランク電流値を大幅に低下させることが可能となる。これにより、Ｓ／Ｎ比を高くできるので、低濃度の被検出物質であっても高精度の測定が可能となる。この理由については、従来のバイオセンサでは、酵素とメディエータの両方を含む塗液を電極に塗布して乾燥した塗膜を試薬部として用いていることから、塗液乾燥により酵素とメディエータの高濃度状態が持続し、酵素内の電子供与性をもつアミノ基がメディエータを一部還元することで、ブランク電流を増加させていることが考えられる。また、第１試薬部及び第２試薬部は湿度等の外部環境の影響を受けやすく、膨潤と乾燥が繰り返されることで試薬部と接触している電極上にクラックが発生することがある。第１試薬部及び第２試薬部を導電部に近接して配置した場合、導電部にクラックが発生し、性能に大きく影響することがあるが、第１試薬部と第２試薬部の少なくとも一方を、非導電部に配置することで、導電部上にクラックが発生するのを防止することができる。

なお、本実施の形態では、第１試薬部を第１電極対の表面に配置し、第２試薬部をカバーの裏面に配置した例を示したが、第１試薬部をカバーの裏面に配置し、第２試薬部を第１電極対の裏面に配置しても同様の効果を得ることができる。また、本実施の形態では、第２空間部内に第２試薬部を設けて２種の被検出物質の測定に用いる例について説明したが、第２空間部内に試薬部を設けないことで、第１電極対のみを用いて１種の２種の被検出物質の測定に用いることもでき、被検出物質の数に合わせて複数の電極対を絶縁性基材上に設けることができる。

実施の形態２
実施の形態１では、第１電極対と第２電極対の２つの電極対を用いた例について説明したが、本実施の形態では、１つの電極対を用いた例について説明する。以下の説明では、実施の形態１の説明と重複する部分については説明を省略する。

図５は、本実施の形態に係るバイオセンサＢの構造の一例を示す分解斜視図である。バイオセンサＢは、導電部２４を有する絶縁性基材２１とカバー２２とが、スペーサ２３を介して積層されている。対向する一対の主面を有する絶縁性基材２１の一方の主面には導電部２４が形成されている。導電部２４は、導電性部分であり、第１電極対２４１、絶縁性基材２１の一端部に形成された端子部２４３、第１電極対２４１と端子部４３とを接続するリード部２４２を有している。第１電極対２４１は、作用電極２４１ａと、平面視で作用電極２４１ａを挟むように微小空隙を介して作用電極２４１ａと対向する一対の対極２４１ｂ、２４１ｂを有している。作用極２４１はリード２４２ａを介して端子２４３ａに接続され、１対の対極２４１ｂ，２４１ｂはリード２４２ｂを介して端子２４３ｂに接続されている。

図６は、バイオセンサＢの長手方向に沿った縦断面図である。スペーサ２３の開口部２３ａは、スペーサ２３が、絶縁性基材２１とカバー２２との間に挟まれることにより、１つの空間部として第１空間部２６を形成している。第１空間部２６における導電部とは、第１電極対２４１とリード部である。これに対し、第１空間部２６における非導電部とは、導電性ではない部分、具体的には、絶縁性基材２１において電極やリードが形成されていない部分、スペーサ２３の開口部２３ａの内周面、およびスペーサ２３の対向する一対の主面のうち、カバー２２と接していない主面２５（以下、裏面ともいう）を挙げることができる。

第１空間部２６において、第１試薬部２８が、導電部である第１電極対２４１の表面に配置され、第２試薬部２９が、非導電部であるカバー２２の裏面２５に配置されている。カバー２２の長手方向端部の開口部２２ａは、被検液の導入開口として用いることができ、開口部２２ａに被検液を滴下すると、被検液は第１空間部２６へと流れていき、第１空間部２６では、第１試薬部２８と第２試薬部２９と接する。また、カバー２２の中央部の開口部２２ｂは、第１空間部２６の内部に空気を提供するとともに、カバー２２の端部の開口部２２ａから被検液が滴下された時には、被検液の引き込みに伴い、内部の空気を逃がす働きをする。

バイオセンサＢは、１種の被検出物質を測定する場合に用いることができる。例えば、グルコースを測定する場合に用いることができる。この場合、第１空間部２６の第１試薬部２８が、例えばグルコースデヒドロゲナーゼを含み、第２試薬部が、例えばフェリシアン化カリウムを含んでもよい。カバー２２の被検液導入用の開口部２２ａに滴下された被検液中のグルコースは、第１空間部２６内に配置された第１試薬部２８のグルコースデヒドロゲナーゼと反応し、第２試薬部２９に含まれるフェリシアン化カリウムはフェロシアン化カリウムに還元されるが、電圧印加に伴い、フェリシアン化カリウムに酸化される。その酸化電流は被検液中のグルコースの濃度に応じて変化するので、その酸化電流を測定することで被検液中のグルコースの濃度を測定することができる。

本実施の形態に係るバイオセンサも、実施の形態１に係るバイオセンサを同様の効果を有し、１種の被検出物質を測定する場合に好適に用いることができる。

実施の形態３
実施の形態１では、第２試薬部をカバーの裏面に配置した例について説明したが、本実施の形態では、第２試薬部を絶縁性基材上の非導電部に配置した例について説明する。以下の説明では、実施の形態１の説明と重複する部分については説明を省略する。

図７は、本実施の形態に係るバイオセンサＣに用いる絶縁性基材３１の平面図であり、図８は、バイオセンサＣの長手方向に沿った縦断面図である。

対向する一対の主面を有する絶縁性基材３１の一方の主面には導電部３４が形成されている。導電部３４は、第１電極対３４１と第２電極対３４２、絶縁性基材３１の一端部に形成された端子部３４３、第１電極対３４１または第２電極対３４２と端子部３４３とを接続するリード部３４４を有している。第１電極対３４１は、作用電極３４１ａと、平面視で作用電極３４１ａを挟むように微小空隙を介して作用電極３４１ａと対向する一対の対極３４１ｂ、３４１ｂを有している。また、第２電極対３４２は、第１電極対３４１と離間して長手方向に配置され、作用電極３４２ａと、平面視で作用電極３４２ａを挟むように微小空隙を介して作用電極３４２ａと対向する一対の対極３４２ｂ、３４２ｂを有している。一対の作用極３４１ａ，３４１ａはリード３４４ａを介して端子３４３ａに接続され、２対の対極３４１ｂ，３４１ｂはリード３４４ｄを介して端子３４３ｄに接続されている。また、作用極３４２ａはリード３４４ｂを介して端子３４３ｂに接続され、一対の対極３４２ｂ、３４２ｂはリード３４４ｃを介して端子３４３ｃに接続されている。また、符号３５１は、導電部が形成されていない領域であり、非導電部に相当する。なお、図７の場合、後述する第１試薬部と第２試薬部を除いた構造を示している。

スペーサ３３の開口部３３ａ，３３ｂは、スペーサ３３が、絶縁性基材３１とカバー３２との間に挟まれることにより、互いに独立した２つの第１空間部３６と第２空間部３７を形成している。第１空間部３６における導電部とは、第１電極対３４１とリード部である。これに対し、第１空間部３６における非導電部とは、絶縁性基材３１において電極やリードが形成されていない部分としての絶縁性基材面３５２、スペーサ３３の開口部３３ａの内周面、およびスペーサ３３の対向する一対の主面のうち、カバー３２と接していない主面３５１（以下、裏面ともいう）を挙げることができる。また、第２空間部３７における導電部とは、第２電極対４２とリード部である。これに対し、第２空間部３７の非導電部とは、絶縁性基材３１において電極やリードが形成されていない部分、スペーサ３３の開口部３３ｂの内周面、スペーサ３３の対向する一対の主面のうち、カバー３２と接していない裏面３５１を挙げることができる。

本実施の形態では、第１空間部３６において、第１試薬部３８が、導電部である第１電極対３４１に配置され、第２試薬部３９が、非導電部である絶縁性基材面３５２に配置されている。また、第２空間部３７においては、第２電極対３４２の表面に第２試薬部３９を配置している。

実施の形態１の場合と同様に、カバー３２の中央部の開口部３２ｂは、被検液の導入開口として用いることができ、開口部３２ｂに被検液を滴下すると、被検液は第１空間部３６と第２空間部３７へと流れていき、第１空間部３６では、第１試薬部３８と第２試薬部３９と接する。また、カバー３２の両端部の開口３２ａ，３２ｃは、それぞれ、第１空間部３６と第２空間部３７の内部に空気を提供するとともに、カバー３２の中央部の開口部３２ｂから被検液が滴下された時には、被検液の引き込みに伴い、内部の空気を逃がす働きをする。

本実施の形態によれば、第１空間部３６において、第１試薬部３８を、導電部である第１電極対３４１に配置し、第２試薬部３９を、非導電部である絶縁性基材面３５２に配置することで、実施の形態１と同様の効果を得ることができる。また、第１電極対３４１と第２電極対３４２の２つの電極対を有しているので、被検液中の異なる２種の被検出物質を測定する場合に用いることができる。

以下に、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

参考例
従来のバイオセンサでは、タンパク質、例えば酵素と、メディエータの両方を含む塗液を電極に塗布して乾燥した塗膜を試薬部として用いていた。本参考例では、試薬部として、タンパク質とメディエータの両方を含む塗液を用いた塗膜を用いる場合（以下、混合担持塗膜という）と、タンパク質を含む塗膜とメディエータを含む塗膜を用いる場合（以下、別担持塗膜という）とについて、ブランク電流値を比較した。

（実験方法）
混合担持塗膜は、以下の組成の試薬液を、図１のバイオセンサＡを構成する絶縁性基材上に蒸着法を用いて作製したパラジウムシートに所定量点着させ、２５℃、湿度５０％で、約３時間乾燥させて作製した。この塗膜を、試薬液と同量のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、５０ｍＭ）で再溶解し、その再溶解液を吸引して回収した。一方、別担持塗膜は、メディエータを含まない試薬液を調製し、その試薬液を担持用シートに点着した以外は、混合担持塗膜の場合と同様の方法を用いて作製した。
＜試薬液＞
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０） １０ｍＭ
メディエータ ６ｍＭ
タンパク質溶液 １０ｍｇ／ｍＬまたは２０ｍｇ／ｍＬ
＜メディエータ＞
１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（ＰＭＳ）
９，１０−フェナントレンキノン−２−スルホン酸ナトリウム（ＰＱＳＡ）
＜タンパク質＞
フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ）
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）

その再溶解液を図１に示すバイオセンサＡに点着し、電気化学測定を行った。電気化学測定は、バイオセンサＡをポテンショスタットに接続し、作用極−対極間に０．２Ｖの電圧を３０秒間印加し、印加後１０秒経過した時の電流値をブランク電流とした。

結果を図９〜１１に示す。また、ブランク電流の数値を表１に示す。図９はタンパク質だけを含む別担持塗膜の結果であり、図１０は、メディエータに１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（ＰＭＳ）を用いた混合担持塗膜の結果であり、図１１は、メディエータに９，１０−フェナントレンキノン−２−スルホン酸ナトリウム（ＰＱＳＡ）を用いた混合担持塗膜の結果である。タンパク質の別担持塗膜の場合、ブランク電流は２５ｎＡ以下であった。また、メディエータの別担持塗膜の場合、ＰＭＳとＰＱＳＡのブランク電流は、それぞれ２３５ｎＡ、１８ｎＡであった。一方、混合担持塗膜では、タンパク質の別担持塗膜やメディエータの別担持塗膜に比べてブランク電流が増加し、特にメディエータにＰＭＳを用いた場合、顕著に増加した。例えば、ＰＱＳＡの場合、タンパク質の種類と濃度に応じて、７５〜１８９ｎＡまで増加した。これに対し、ＰＭＳの場合、タンパク質の種類と濃度に応じて、５１３〜２７０７ｎＡまで増加した。この結果から、混合担持塗膜ではなく、別担持塗膜を試薬部に用いることで、ブランク電流を抑制できることが期待できる。なお、混合担持塗膜の場合、ブランク電流が大きいことの理由は必ずしも明らかではないが、塗液乾燥により酵素とメディエータの高濃度状態が持続し、酵素内の電子供与性をもつアミノ基がメディエータを一部還元することで、ブランク電流を増加させていることが考えられる。

実施例１
＜バイオセンサの作製＞
図１のバイオセンサＡを構成する絶縁性基材上の第１電極対の表面に、以下の試薬液１を４μＬ塗布し、２５℃、湿度５０％で約３時間乾燥して第１試薬部を形成した。一方、図１のバイオセンサＡを構成するカバーの裏面に、以下の試薬液２を２４μＬ塗布し、２５℃、湿度５０％で約３時間乾燥して第２試薬部を形成した。そして、図１に示すバイオセンサを作製した。
＜試薬液１＞
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ２５ｍＭ
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ） ２０００Ｕ／ｍＬ
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ） ０．２％
ドデシルマルトシド ０．００６５％
＜試薬液２＞
９，１０−フェナントレンキノン−２−スルホン酸ナトリウム（ＰＱＳＡ） １０ｍＭ

バイオセンサＡに以下の組成の被検液５０μＬを点着し、電気化学測定を行った。電気化学測定は、バイオセンサＡをポテンショスタットに接続し、作用極−対極間に０．２Ｖの電圧を３０秒間印加し、印加後１０秒経過した時の電流値を測定した。
＜被検液＞
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ２５ｍＭ
グルコース ０，２０，５０，１００μＭ

図１２に、グルコース濃度と検出電流値との関係を示す（△印）。０〜１００μＭ
の範囲で直線関係が得られた。

比較例１
＜バイオセンサの作製＞
図１のバイオセンサＡを構成する絶縁性基材上の第１電極対の表面に、以下の試薬液３を４μＬ塗布し、２５℃、湿度５０％で約３時間乾燥して試薬部を形成した以外は、実施例１と同様の方法により、バイオセンサを作製した。
＜試薬液３＞
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ２５ｍＭ
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ） ２０００Ｕ／ｍＬ
９，１０−フェナントレンキノン−２−スルホン酸ナトリウム（ＰＱＳＡ） ３０ｍＭ
カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ） ０．２％
ドデシルマルトシド ０．００６５％

作製したバイオセンサに点着し、実施例１の場合と同様の方法により電気化学測定を行った。

図１２に、グルコース濃度と検出電流値との関係を示す（○印）。０〜１００μＭ
の範囲で直線関係が得られた。

（結果）
図１２に示すように、実施例１の場合、比較例１に比べて、ブランク電流値が減少していることがわかる。Ｓ／Ｎ比（１００μＭの電流値／ブランク電流値）を算出すると、比較例１が２．２９であるのに対し、実施例１では、５．２７であった。これにより、本発明によれば、従来に比べ、Ｓ／Ｎ比を大幅に向上できることが確認できた。

本発明によれば、高精度の測定が可能なバイオセンサを提供することができる。

１，２１，３１ 絶縁性基材
２，２２，３２ カバー
２ａ，２ｂ，２ｃ カバー開口部
２２ａ，２２ｂ カバー開口部
３２ａ，３２ｂ カバー開口部
３，２３，３３ スペーサ
３ａ，３ｂ スペーサ開口部
２３ａ スペーサ開口部
３３ａ，３３ｂ スペーサ開口部
４，２４，３４ 導電部
４１，２４１，３４１ 第１電極対
４１ａ，２４１ａ，３４１ａ 作用極
４１ｂ，２４１ｂ，３４１ｂ 対極
４２，３４２ 第２電極対
４２ａ，３４２ａ 作用極
４２ｂ，３４２ｂ 対極
４３，３４３ 端子部
４３ａ，４３ｂ，４３ｃ，４３ｄ 端子
２４３ａ，２４３ｂ 端子
３４３ａ，３４３ｂ，３４３ｃ，３４３ｄ 端子
４４，２４２，３４４ リード部
４４ａ，４４ｂ，４４ｃ，４４ｄ リード
２４２ａ，２４２ｂ リード
３４４ａ，３４４ｂ，３４４ｃ，３４４ｄ リード
５，２５，３５１，３５２ 非導電部
６，２６，３６ 第１空間部
７，２７，３７ 第２空間部
８，２８，３８ 第１試薬部
９，２９，３９ 第２試薬部

Claims (8)

1. タンパク質とメディエータとを用いて被検液中の成分を分析するバイオセンサであって、
   絶縁性基材とカバーとの間にスペーサを介して形成された１つ以上の空間部を有し、
   少なくとも１つの前記空間部の内面には、導電部と非導電部とを有し、
   前記タンパク質を含む第１試薬部と前記メディエータを含む第２試薬部は前記内面の異なる場所に別々に配置され、前記第１試薬部と前記第２試薬部の少なくとも一方が、前記非導電部に配置されている、バイオセンサ。
2. 前記第１試薬部と前記第２試薬部の一方が、前記非導電部に配置され、他方が前記導電部に配置されている、請求項１記載のバイオセンサ。
3. 前記第１試薬部が前記導電部に配置され、前記第２試薬部が前記非導電部に配置されている、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
4. 前記第１試薬部と前記第２試薬部が、前記非導電部の異なる場所に配置されている、請求項１記載のバイオセンサ。
5. 前記絶縁性基材は、対向する一対の主面を有し、前記空間部に露出する一方の主面は前記空間部の底面を構成し、前記カバーは、対向する一対の主面を有し、前記空間部に露出する一方の主面は前記空間部の頂面を構成し、前記スペーサは、少なくとも１つの開口部を有し、前記開口部の内面は前記空間部の側面を構成する、請求項１から４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
6. 前記底面が前記導電部を有し、前記頂面が前記非導電部を有する、請求項５記載のバイオセンサ。
7. 前記底面が前記導電部と前記非導電部を有する、請求項５記載のバイオセンサ。
8. 前記導電部が、少なくとも作用極と対極を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のバイオセンサ。

Images