JP5234675B2 - １，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定用バイオセンサ、それを用いた測定方法および測定用キット - Google Patents
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Description
本発明は、全血等の体液等の検体中の１，５−アンヒドログルシトールを電気化学的に測定するためのバイオセンサ、それを用いた１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定方法、及びそれを含む１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定用キットに関する。
近年、食生活が豊かになるのに伴い糖尿病患者が増大しているが、糖尿病患者の合併症発症を予防するためには血糖値を健常者に近いレベルにコントロールする必要があり、糖尿病患者の血糖コントロール状態を把握するためのマーカーとして１，５−アンヒドログルシトール（以下、「１，５−ＡＧ」と略記する場合がある。）が注目されている。１，５−ＡＧは食事の影響を受けにくく、過去１週間程度の比較的短期間の血糖コントロール状態を反映する等の利点を有している。
ごく最近、１，５−ＡＧは食後高血糖状態をヘモグロビンＡ１ｃ等の血糖マーカーに比べて、より正確に反映するマーカーである事も明らかになっている。
ごく最近、１，５−ＡＧは食後高血糖状態をヘモグロビンＡ１ｃ等の血糖マーカーに比べて、より正確に反映するマーカーである事も明らかになっている。
血糖コントロールの指標とするために、患者が家庭で全血試料を採取し、１，５−ＡＧを自分で測定する際に使用可能なバイオセンサが特許文献１及び特許文献２に開示されている。特許文献１には血球分離部と検出部を有するバイオセンサが記載され、特許文献２には、レドックスメディエータとしてオスミウム（ＩＩＩ）錯体を用い、安定化剤として２−スルホ安息香酸又は３−スルホ安息香酸を使用する１，５−ＡＧの電気化学的測定について記載されている。
一方、患者自身が家庭で血糖値を測定する自己血糖測定器が知られており、例えば、グルコカード（アークレイ（株））やフリースタイル（ニプロ（株））等の商品名で販売されている。
他の血糖マーカーであるグリコアルブミンやヘモグロビンＡ１ｃを測定することを目的としたバイオセンサも開発が進んでいる。
他の血糖マーカーであるグリコアルブミンやヘモグロビンＡ１ｃを測定することを目的としたバイオセンサも開発が進んでいる。
しかしながら、特許文献１又は特許文献２等に記載されている１，５−ＡＧ用バイオセンサは、家庭で患者自身が使用するバイオセンサとして供給するには以下の点で改良が必要であった。
流通や家庭における保存では、幅広い温度や湿度等の環境因子の影響を受けるためバイオセンサが劣化して一定の性能を保てないという点である。即ち、電極上にメディエータと酸化還元酵素を塗布・乾燥して作製したバイオセンサでは、保存期間が長くなるに従ってバイオセンサが劣化し、それを用いた１，５−ＡＧの測定値が低下する傾向を示した。
流通や家庭における保存では、幅広い温度や湿度等の環境因子の影響を受けるためバイオセンサが劣化して一定の性能を保てないという点である。即ち、電極上にメディエータと酸化還元酵素を塗布・乾燥して作製したバイオセンサでは、保存期間が長くなるに従ってバイオセンサが劣化し、それを用いた１，５−ＡＧの測定値が低下する傾向を示した。
また、家庭で患者が１，５−ＡＧを測定する際、利便性の故に血漿を分離採取せず、全血を測定に用いることから、全血に含まれるヘマトクリット等の影響を受けやすい点である。ヘマトクリットとは全血中に含まれる血球成分を指す。
１，５−ＡＧは糖尿病になるとその値が減少するため、糖尿病患者の１，５−ＡＧ値は極めて低い値となる。つまり、１，５−ＡＧ測定用バイオセンサには低値の１，５−ＡＧ値を正確に測定することが要求されるが、前記のような影響があると正しい１，５−ＡＧ値を測定することができなくなり、その結果、患者は適切な血糖コントロールができなくなる可能性があった。
また、糖尿病や食後高血糖の患者の血糖コントロールに血糖値を使用する場合、血糖値を頻回測定しなければならず患者の利便性は甚だ悪い。グリコアルブミンやヘモグロビンＡ１ｃでは一週間程度の短期の血糖コントロール状態を反映しないため、一般家庭で血糖コントロールマーカーとして使用するには不向きである。
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意研究の結果、バイオセンサの試薬層にある種の安定化剤を添加することで保存中のバイオセンサの安定化を図り、任意成分としてある種の酸性高分子を添加することで全血測定におけるヘマトクリット等の影響を防ぐことを可能とするバイオセンサを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、
［１］．１，５−アンヒドログルシトールを電気化学的に測定するための電極系と該電極系上に形成された試薬層を有するバイオセンサであって、該試薬層が、
（１）１，５−アンヒドログルシトール測定用酵素、
（２）フェノチアジン類、
（３）金属塩類、有機酸類及びアミノ酸類からなる化合物群から選ばれる安定化剤、及び
（４）任意成分として酸性高分子化合物
を含有するバイオセンサ；
［２］．１，５−アンヒドログルシトール測定用酵素が１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ又は１，５−アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼである上記［１］に記載のバイオセンサ；
［３］．フェノチアジン類がチオニンである上記［１］又は［２］に記載のバイオセンサ；
［４］．安定化剤が塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、ｏ−スルホ安息香酸サイクリック、アルギニン又はその塩、グルタミン酸又はその塩、及びリシン又はその塩からなる化合物群から選ばれる一種又は二種以上である上記［１］から［３］のいずれかに記載のバイオセンサ；
［５］．安定化剤がｏ−スルホ安息香酸サイクリックである上記［１］から［４］のいずれかに記載のバイオセンサ；
［６］．酸性高分子化合物が酸性官能基を有しフッ素原子で置換されていてもよい炭化水素化合物である上記［１］から［５］のいずれかに記載のバイオセンサ；
［７］．酸性高分子化合物がパーフルオロスルホン酸樹脂である上記［１］から［６］のいずれかに記載のバイオセンサ；
［８］．１，５−アンヒドログルシトール測定用酵素として、シュードモナス エスピー由来の１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼを用いる上記［１］から［７］のいずれかに記載のバイオセンサ；
［１］．１，５−アンヒドログルシトールを電気化学的に測定するための電極系と該電極系上に形成された試薬層を有するバイオセンサであって、該試薬層が、
（１）１，５−アンヒドログルシトール測定用酵素、
（２）フェノチアジン類、
（３）金属塩類、有機酸類及びアミノ酸類からなる化合物群から選ばれる安定化剤、及び
（４）任意成分として酸性高分子化合物
を含有するバイオセンサ；
［２］．１，５−アンヒドログルシトール測定用酵素が１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ又は１，５−アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼである上記［１］に記載のバイオセンサ；
［３］．フェノチアジン類がチオニンである上記［１］又は［２］に記載のバイオセンサ；
［４］．安定化剤が塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、ｏ−スルホ安息香酸サイクリック、アルギニン又はその塩、グルタミン酸又はその塩、及びリシン又はその塩からなる化合物群から選ばれる一種又は二種以上である上記［１］から［３］のいずれかに記載のバイオセンサ；
［５］．安定化剤がｏ−スルホ安息香酸サイクリックである上記［１］から［４］のいずれかに記載のバイオセンサ；
［６］．酸性高分子化合物が酸性官能基を有しフッ素原子で置換されていてもよい炭化水素化合物である上記［１］から［５］のいずれかに記載のバイオセンサ；
［７］．酸性高分子化合物がパーフルオロスルホン酸樹脂である上記［１］から［６］のいずれかに記載のバイオセンサ；
［８］．１，５−アンヒドログルシトール測定用酵素として、シュードモナス エスピー由来の１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼを用いる上記［１］から［７］のいずれかに記載のバイオセンサ；
［９］．上記［１］から［８］のいずれかに記載のバイオセンサを用いる検体中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定方法；及び
［１０］．上記［１］から［８］のいずれかに記載のバイオセンサを含む検体中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定用キット
に関する。
に関する。
本発明によれば、保存中の温度等の環境因子変化によるバイオセンサの劣化を防止し、１，５−ＡＧ測定値の変動を抑え、１，５−ＡＧを低値まで正確に測定でき保存安定性の向上したバイオセンサを作製することが可能となり、長期保存後も作製初期と同じ正確な１，５−ＡＧの測定値を得ることができる。また、全血測定においてヘマトクリット等の影響を受けずに広い範囲の検体の１，５−ＡＧの正確な測定を可能とするバイオセンサを提供することができる。
本発明は、１，５−ＡＧを電気化学的に測定するための電極系と該電極系上に形成された試薬層を有するバイオセンサであって、該試薬層が（１）１，５−ＡＧ測定用酵素、（２）レドックスメディエータとしてフェノチアジン類、（３）金属塩類、有機酸類及びアミノ酸類からなる化合物群から選ばれる安定化剤、（４）必要に応じて、任意成分として酸性高分子化合物を含有するバイオセンサである。
まず、本発明のバイオセンサの構造について図１から図４を例に参照して説明する。バイオセンサは、絶縁性基盤１と、作用極２、対極３、参照極４からなる電極系と、絶縁層５と、電極上に形成した試薬層６と、絶縁層５を形成しない検体検出部位７と、作用極２の端子部２ａ、対極３の端子部３ａ、参照極４の端子部４ａからなる。端子部２ａ、端子部３ａ、端子部４ａをまとめて端子部８とする。図２は図１のバイオセンサの作用極のほぼ中心部における断面を図示したものである。
電極の材質としては、例えば、金、白金、カーボン、パラジウム、銀又は銀塩化銀で形成することができる。
絶縁性基板は、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート若しくはポリビニルカーボネート等のプラスチック又はガラス等で作製され、中でもポリエチレンテレフタレートが好ましい。これらの基板上に、スクリーン印刷法、真空蒸着法、スパッタ法等により電極を形成することができ、中でもスクリーン印刷法が好ましい。即ち、ポリエチレンテレフタレートの基板に導電性カーボンインクを用いてスクリーン印刷により電極を形成するのが好ましい。
絶縁性基板は、例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート若しくはポリビニルカーボネート等のプラスチック又はガラス等で作製され、中でもポリエチレンテレフタレートが好ましい。これらの基板上に、スクリーン印刷法、真空蒸着法、スパッタ法等により電極を形成することができ、中でもスクリーン印刷法が好ましい。即ち、ポリエチレンテレフタレートの基板に導電性カーボンインクを用いてスクリーン印刷により電極を形成するのが好ましい。
また、図３のようにスペーサー９を配しカバー１０を設置する構造であってもよい。カバーを設置した場合は、例えば、検体はカバーの四辺のうちスペーサーを配していない二辺のどちらかから毛細管現象等を利用して電極系上に導けばよい。図４は図３のバイオセンサの作用極のほぼ中心部における断面を図示したものである。
なお、これらの図は電極構造の一例を示したのであり、本発明はこの電極構造に限定されるものではない。例えば、対極３を配置せず、参照極４に対極の機能を持たせることも可能であり、電極形状は円形等でも構わない。
なお、これらの図は電極構造の一例を示したのであり、本発明はこの電極構造に限定されるものではない。例えば、対極３を配置せず、参照極４に対極の機能を持たせることも可能であり、電極形状は円形等でも構わない。
本発明のバイオセンサに設けられる試薬層は、１，５−ＡＧ測定用酵素、フェノチアジン類、安定化剤の各成分と、必要に応じて任意成分としての酸性高分子化合物を、各成分から１ないし複数化合物を選んで水に溶解し電極試薬溶液とし、それを電極系上に塗布・乾燥させることで形成される。試薬層の形成場所としては、作用極上を含む電極系上ならどこでも構わないが、作用極上が望ましい。
該１，５−ＡＧ測定用酵素としては、１，５−ＡＧの酸化還元酵素又は１，５−ＡＧ変換体の酸化還元酵素等を使用することができる。
１，５−ＡＧの酸化還元酵素としては、ピラノースオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ、Ｌ−ソルボースデヒドロゲナーゼ等を使用することができる。１，５−ＡＧ変換体の酸化還元酵素としては、例えば、１，５−アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼ（１，５−ＡＧ６リン酸デヒドロゲナーゼ）等を使用することができる。
中でも好ましくは、１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼである。
１，５−ＡＧの酸化還元酵素としては、ピラノースオキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ、Ｌ−ソルボースデヒドロゲナーゼ等を使用することができる。１，５−ＡＧ変換体の酸化還元酵素としては、例えば、１，５−アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼ（１，５−ＡＧ６リン酸デヒドロゲナーゼ）等を使用することができる。
中でも好ましくは、１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼである。
該１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼとしては、例えば、特開平７−６７６９７号公報記載のサイトファーガ属細菌、日本特許第２８７２９８３号公報及び特許第３８１９０９４号公報に記載のアグロバクテリウム・ツメファシエンス、特開平１１−１８７６２号公報記載のラフネラ・アクアティリス、エンテロバクター・クロアカエやセラチア・マルセッセンス、特開平２−２６８６７９号公報記載のオイペニシリウム・クルクルセタセウム、ハンセヌラ・カリホニア、ピチア・カルソニー、ピチア・シュードポリモルファ等の真菌類、特開２０００−１３５０７９号公報記載のトリコデルマ・ロンギブラキアツム等由来の酵素を使用することができる。より好ましくは、特願２００８−１５９９２７号およびＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６１０７４号に記載のシュードモナス エスピー由来の遺伝子改変酵素が挙げられる。
上記の他の酵素としては、特許文献１又は特許文献２等に例示の酵素も使用可能である。
該１，５−ＡＧ６リン酸デヒドロゲナーゼとしては、例えば、特開平１０−８４９５３号公報に記載のエシェリヒア・コリＤＨ１株等由来の酵素が挙げられる。
上記の他の酵素としては、特許文献１又は特許文献２等に例示の酵素も使用可能である。
該１，５−ＡＧ６リン酸デヒドロゲナーゼとしては、例えば、特開平１０−８４９５３号公報に記載のエシェリヒア・コリＤＨ１株等由来の酵素が挙げられる。
１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼの使用量は、バイオセンサのチップ１枚当たり好ましくは０．１ｍＵから２００ｍＵ、より好ましくは１ｍＵから２０ｍＵである。
１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼの活性値は、下記条件（試薬組成、手順及び計算式）において２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム １ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）（（株）同仁化学研究所製）を基質として用い、１分間に１μｍｏｌのＷＳＴ−１と反応する酵素量を１単位（Ｕ）と定義して表した。具体的には次の方法による。
１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼの活性値は、下記条件（試薬組成、手順及び計算式）において２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム １ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）（（株）同仁化学研究所製）を基質として用い、１分間に１μｍｏｌのＷＳＴ−１と反応する酵素量を１単位（Ｕ）と定義して表した。具体的には次の方法による。
試薬組成：
（Ａ） １００ｍＭ ＴＡＰＳ（３−（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン−１−スルホン酸）緩衝液、ｐＨ８．０
（Ｂ） ２０ｍＭ ＷＳＴ−１／１００ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液
（Ｃ） ミリＱ水
（Ｄ） １Ｍ １，５−ＡＧ ｉｎ ミリＱ水
（Ｅ） 酵素液 ｉｎ １００ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液
（Ａ） １００ｍＭ ＴＡＰＳ（３−（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン−１−スルホン酸）緩衝液、ｐＨ８．０
（Ｂ） ２０ｍＭ ＷＳＴ−１／１００ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液
（Ｃ） ミリＱ水
（Ｄ） １Ｍ １，５−ＡＧ ｉｎ ミリＱ水
（Ｅ） 酵素液 ｉｎ １００ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液
手順：
（１）使用直前に下記反応混液を調製する。
（Ａ）１４０μＬ、（Ｂ）１２０μＬ、（Ｃ）１３０μＬ、（Ｄ）２００μＬ
（２）反応混液をガラス試験管に入れ３７℃で５分間予備加温する。
（３）酵素液（Ｅ）１０μＬを反応混液に添加し、ボルテックスで混和後、予め３７℃に加温しておいた光路長１ｃｍの石英キュベットに速やかに移し、３７℃に保ったまま１分間における４３８ｎｍの吸光度の増加（Δ４３８／ｍｉｎ）を測定する。
（１）使用直前に下記反応混液を調製する。
（Ａ）１４０μＬ、（Ｂ）１２０μＬ、（Ｃ）１３０μＬ、（Ｄ）２００μＬ
（２）反応混液をガラス試験管に入れ３７℃で５分間予備加温する。
（３）酵素液（Ｅ）１０μＬを反応混液に添加し、ボルテックスで混和後、予め３７℃に加温しておいた光路長１ｃｍの石英キュベットに速やかに移し、３７℃に保ったまま１分間における４３８ｎｍの吸光度の増加（Δ４３８／ｍｉｎ）を測定する。
計算式：
酵素活性（Ｕ／ｍＬ）＝（Δ４３８／ｍｉｎ×０．６（ｍＬ）×酵素液の希釈倍率）／（３７．０×０．０１（ｍＬ））
ここで３７．０はＷＳＴ−１のミリモル分子吸光係数である。
１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ以外の他の１，５−ＡＧ測定用酵素の使用量も同様にして決めることができる。
酵素活性（Ｕ／ｍＬ）＝（Δ４３８／ｍｉｎ×０．６（ｍＬ）×酵素液の希釈倍率）／（３７．０×０．０１（ｍＬ））
ここで３７．０はＷＳＴ−１のミリモル分子吸光係数である。
１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ以外の他の１，５−ＡＧ測定用酵素の使用量も同様にして決めることができる。
該フェノチアジン類は１，５−ＡＧ測定用酵素と電極間で電子を授受するメディエータとしての役割を果たす。
フェノチアジン類としてはメチレンブルー、チオニン、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、アズールＩ、トルイジンブルー等が挙げられ、中でもチオニンが特に好ましい。チオニンは塩化物塩、酢酸塩等の塩を使用するのが好ましく、中でも酢酸塩が特に好ましい。フェノチアジン類の使用量は、バイオセンサチップ１枚当たり好ましくは０．０１ｎｍｏｌから２０ｎｍｏｌ程度、より好ましくは０．１ｎｍｏｌから１ｎｍｏｌ程度である。
フェノチアジン類としてはメチレンブルー、チオニン、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、アズールＩ、トルイジンブルー等が挙げられ、中でもチオニンが特に好ましい。チオニンは塩化物塩、酢酸塩等の塩を使用するのが好ましく、中でも酢酸塩が特に好ましい。フェノチアジン類の使用量は、バイオセンサチップ１枚当たり好ましくは０．０１ｎｍｏｌから２０ｎｍｏｌ程度、より好ましくは０．１ｎｍｏｌから１ｎｍｏｌ程度である。
該安定化剤としては、金属塩類、有機酸類、アミノ酸類（アミノ酸又はその塩）等を使用することができる。金属塩類としては塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が好ましく、有機酸類としては有機酸、有機酸塩、有機酸無水物等が挙げられ、クエン酸ナトリウム、ｏ−スルホ安息香酸サイクリック（２−スルホ安息香酸無水物）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）等が好ましく、アミノ酸又はその塩としてはグルタミン酸又はその塩、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ）又はその塩、アルギニン又はその塩、イソロイシン又はその塩、ヒスチジン又はその塩、アスパラギン酸又はその塩等が好ましい。より好ましくは、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、ｏ−スルホ安息香酸サイクリックが挙げられ、ｏ−スルホ安息香酸サイクリックが特に好ましい。
安定化剤の使用量は、バイオセンサ１枚当たり好ましくは１０ｎｍｏｌから２０００ｎｍｏｌ程度、より好ましくは１００ｎｍｏｌから４００ｎｍｏｌ程度である。
安定化剤のｐＨは、ｐＨ５からｐＨ１１が好ましい。
これら安定化剤は単独で用いてもよいし、二種以上を用いてもよい。
安定化剤のｐＨは、ｐＨ５からｐＨ１１が好ましい。
これら安定化剤は単独で用いてもよいし、二種以上を用いてもよい。
任意成分としての酸性高分子化合物を用いた場合には、全血を検体とし、検体中の１，５−ＡＧの測定においてヘマトクリット等の影響を受けずに広い範囲の検体の１，５−ＡＧ濃度の正確な測定が可能となるので、本発明のバイオセンサでは使用するのが好ましい。任意成分としての酸性高分子化合物としては、スルホン酸基、リン酸基、カルボキシ基等の酸性官能基を有しフッ素原子で置換されていてもよい炭化水素化合物が挙げられ、例えば、スルホン化ポリ（４−フェノキシベンゾイル−１，４−フェニレン）樹脂、アルキルスルホン化ポリベンゾイミダゾール樹脂等の芳香族縮合高分子、ナフィオン（登録商標；デュポン（株）製、ＣＡＳ Ｒｅｇ．Ｎｏ．３１１７５−２０−９）等のパーフルオロスルホン酸樹脂、アシプレックス（旭化成（株）製）、カルボキシ基含有パーフルオロカーボン（フレミオンＳ膜）（旭硝子（株）製）、日本特許第４３２４５１８号公報や特開２００８−２９１２２４号公報記載のポリエーテルスルホン系樹脂、アルギン酸又はその塩、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。中でも、パーフルオロスルホン酸樹脂であるナフィオン（登録商標）が特に好ましい。
酸性高分子化合物を使用する場合、ナフィオン（登録商標）を使用するのであれば、その使用量はバイオセンサ１枚当たり好ましくは０．０１ｍｇから１０．０ｍｇ程度、より好ましくは０．２ｍｇから０．６ｍｇ程度である。その他の酸性高分子化合物を使用する場合にも、同様に、その使用量は用いる化合物の性質等に応じて任意に決めることができる。
該酸性高分子化合物は、１，５−ＡＧ測定用酵素、フェノチアジン類、安定化剤等と共に電極試薬溶液として調製し、電極系上に塗布・乾燥して試薬層とすることができる。また、１，５−ＡＧ測定用酵素、フェノチアジン類、安定化剤等からなる電極試薬溶液を調製し、この液を電極系上に塗布・乾燥して試薬層として配した後、適当濃度に調製した酸性高分子化合物を先の試薬層の上に塗布・乾燥して積層することで二層からなる試薬層を形成してもよい。
乾燥方法としては真空乾燥、熱乾燥、自然乾燥、凍結乾燥等から適宜選択すればよい。
又、該試薬層には、必要に応じて１，５−ＡＧを１，５−ＡＧ変換体に変換する試薬を含んでいてもよい。
乾燥方法としては真空乾燥、熱乾燥、自然乾燥、凍結乾燥等から適宜選択すればよい。
又、該試薬層には、必要に応じて１，５−ＡＧを１，５−ＡＧ変換体に変換する試薬を含んでいてもよい。
電極試薬溶液を電極系上に配する方法としては、塗布・乾燥以外の、スピンコーターを用いて薄膜を形成する方法、電極試薬溶液にバイオセンサをディップする方法等でもよい。
また、高分子膜や樹脂等を用いて電極系上や流路上に固定化しても構わない。ここで流路とは、検体を点着する位置と電極系が離間している場合の検体が通過する経路を指す。
また、高分子膜や樹脂等を用いて電極系上や流路上に固定化しても構わない。ここで流路とは、検体を点着する位置と電極系が離間している場合の検体が通過する経路を指す。
次いで、前記のバイオセンサを用いて１，５−ＡＧを電気化学的に測定する方法を例示する。
電気化学検出器としては、例えば、（株）東方技研製ＧＰＩＢ ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ マルチポテンショスタット ＭＯＤＥＬ ＰＳ−０８を使用し、この検出器に前記バイオセンサの作用極、参照極、対極の端子部を接続する。測定検体を、好ましくは、後記するグルコース変換試薬と混合した後、試薬層を配したバイオセンサの電極上に点着し、所定の電圧を印加して１，５−ＡＧ測定値を求める。
以下、電圧は銀／塩化銀参照極に対する作用極の電圧として示す。
電気化学検出器としては、例えば、（株）東方技研製ＧＰＩＢ ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ マルチポテンショスタット ＭＯＤＥＬ ＰＳ−０８を使用し、この検出器に前記バイオセンサの作用極、参照極、対極の端子部を接続する。測定検体を、好ましくは、後記するグルコース変換試薬と混合した後、試薬層を配したバイオセンサの電極上に点着し、所定の電圧を印加して１，５−ＡＧ測定値を求める。
以下、電圧は銀／塩化銀参照極に対する作用極の電圧として示す。
グルコース変換試薬とは、検体中に含まれるグルコースを１，５−ＡＧ測定用酵素と反応しない変換体へ変換若しくはイオン交換法等により除去するための試薬や担体等を指す。１，５−ＡＧの全血中濃度は健常者でもグルコースに比べて約１００分の１程度であり、１，５−ＡＧ測定時にグルコースが存在すると酵素を用いた１，５−ＡＧ測定の際に誤差を生じさせる。グルコース変換試薬は、グルコースを含む検体中の１，５−ＡＧを測定する際に使用することが好ましい。
例えば、特許文献２に記載の１０．０ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）に１７．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１７．６ｍＭのＫＣｌ、１７５．７ｍＭのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、１７．６ｍＭのＡＴＰ、１２３Ｕ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、７５Ｕ／ｍＬのグルコキナーゼ、２００Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸酸化酵素、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮａＮ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）、０．０６％のＢＳＡ（牛血清アルブミン）を溶解混合し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．０に調整してグルコース変換試薬として使用すればよい。
グルコース変換試薬と検体の混合比は、グルコース変換試薬１体積量に対して、検体０．０１から２体積量になるように混合すればよい。
印加する電圧は、用いるフェノチアジン類によって適宜選択すればよく、例えば、チオニン酢酸塩を用いる場合には０Ｖ程度が適している。印加時間は１，５−ＡＧ濃度に比例した測定値が得られ、測定間再現性が得られる程度に設定すればよい。好ましくは２秒から５分程度、より好ましくは３０秒から３分程度である。
また、この電圧を印加する前に、それより０．１Ｖ程度低い電圧を３秒から２０秒程度印加してもよい。これにより、バイオセンサ間測定誤差が解消される場合がある。例えば、チオニン酢酸塩を用いて測定する場合、−０．１Ｖを１０秒程度印加するのが適している。
また、この電圧を印加する前に、それより０．１Ｖ程度低い電圧を３秒から２０秒程度印加してもよい。これにより、バイオセンサ間測定誤差が解消される場合がある。例えば、チオニン酢酸塩を用いて測定する場合、−０．１Ｖを１０秒程度印加するのが適している。
１，５−ＡＧ測定のために、電圧を印加して得られる時間−電流の減衰曲線から適当なパラメータを測定値とすることができる。即ち、電圧を印加してある時間経過後における電流値や一定時間内の電荷量を使用すればよい。例えば、電圧を印加してから５秒後の電流値や電圧を印加してから１００秒間の電荷量を用いればよい。
ここではアンペロメトリー法とクーロメトリー法について述べたが、他にもサイクリックボルタンメトリー法でピーク強度を測定値としても差し支えない。
本発明には前記のバイオセンサを用いる検体中の１，５−ＡＧの電気化学的測定方法も含まれる。但し、具体的に示した前記の測定方法には限定されない。
ここではアンペロメトリー法とクーロメトリー法について述べたが、他にもサイクリックボルタンメトリー法でピーク強度を測定値としても差し支えない。
本発明には前記のバイオセンサを用いる検体中の１，５−ＡＧの電気化学的測定方法も含まれる。但し、具体的に示した前記の測定方法には限定されない。
本発明には、少なくとも前記バイオセンサと、例えば、全血採取に使用する穿刺器具及び全血採取器具とを含む全血中の１，５−アンヒドログルシトール測定用キットも含まれる。穿刺器具は一般的な自己血糖測定器に付属されている穿刺器具と同様のものでもよい。このキットには、更にグルコース変換試薬が含まれていてもよい。
グルコース変換試薬の保持方法、検体の分取方法及びグルコース変換試薬との混合方法、電極への点着方法としては、当該業者や患者が測定に適した方法を適宜選択すればよいが、例えば、密閉性のあるマイクロチューブ等の小容器にグルコース変換試薬を保持し、特許文献２に記載のキャピラリー等を用いて検体を分取し、そのまま小容器内のグルコース変換試薬とピペッティングにより混合し、電極に該キャピラリーで点着する方法が挙げられる。また、グルコース変換試薬を乾燥状態にしてバイオセンサ上に保持し、毛細管現象を用いて検体である全血を分取し、バイオセンサ上にてグルコース変換試薬と混合し、そのまま電極上に流路を介して導くことも可能である。グルコース変換試薬をバイオセンサ上に保持する方法としては、塗布・乾燥する方法以外にも、高分子膜や樹脂等を用いて電極系上や流路上に固定化しても構わない。検体を点着する位置であっても何ら問題はない。ここで流路とは、検体を点着する位置と電極系が離間している場合の検体が通過する経路を指す。
ここに例として挙げたグルコース変換試薬の保持方法、検体の分取方法、グルコース変換試薬との混合方法及び電極への点着方法は、本発明をなんら限定するものではない。
ここに例として挙げたグルコース変換試薬の保持方法、検体の分取方法、グルコース変換試薬との混合方法及び電極への点着方法は、本発明をなんら限定するものではない。
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、ここに示したのは本発明の一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
遺伝子改変１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ、チオニン酢酸塩、ｏ−スルホ安息香酸サイクリック及びナフィオンを含む試薬層を有する１，５−ＡＧ測定用バイオセンサ
１．バイオセンサの作製
１，５−ＡＧ測定用酵素として特願２００８−１５９９２７号及びＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６１０７４号記載のシュードモナス エスピー由来の遺伝子改変１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ（具体的には、ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６１０７４号に記載のシュードモナス エスピー由来の遺伝子改変酵素の一つである１，５ＡＧデヒドロゲナーゼＶｅｒ．３．２であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなる１，５ＡＧデヒドロゲナーゼＶｅｒ．３．２を用いた。）、フェノチアジン類としてチオニン酢酸塩、安定化剤としてｏ−スルホ安息香酸サイクリック、酸性高分子としてナフィオン（登録商標）を用いて電極試薬溶液を調製した。センサチップ１枚当たりの各使用量は、１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼが６．５２ｍＵ、チオニン酢酸塩が０．２４ｎｍｏｌ、ｏ−スルホ安息香酸サイクリックが１００ｎｍｏｌ、ナフィオン（登録商標）が０．２ｍｇである。
遺伝子改変１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ、チオニン酢酸塩、ｏ−スルホ安息香酸サイクリック及びナフィオンを含む試薬層を有する１，５−ＡＧ測定用バイオセンサ
１．バイオセンサの作製
１，５−ＡＧ測定用酵素として特願２００８−１５９９２７号及びＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６１０７４号記載のシュードモナス エスピー由来の遺伝子改変１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ（具体的には、ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０６１０７４号に記載のシュードモナス エスピー由来の遺伝子改変酵素の一つである１，５ＡＧデヒドロゲナーゼＶｅｒ．３．２であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列の４番目のアラニン残基がグリシン残基であり、１４番目のスレオニン残基がセリン残基であり、３７番目のアルギニン残基がスレオニン残基であり、６７番目のグリシン残基がグルタミン酸残基であり、８０番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、９３番目のメチオニン残基がバリン残基であり、１５６番目のプロリン残基がアルギニン残基であり、２０２番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基であり、２３５番目のアラニン残基がスレオニン残基であり、３４８番目のチロシン残基がアスパラギン残基であり、４７３番目のアラニン残基がバリン残基であるアミノ酸配列からなる１，５ＡＧデヒドロゲナーゼＶｅｒ．３．２を用いた。）、フェノチアジン類としてチオニン酢酸塩、安定化剤としてｏ−スルホ安息香酸サイクリック、酸性高分子としてナフィオン（登録商標）を用いて電極試薬溶液を調製した。センサチップ１枚当たりの各使用量は、１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼが６．５２ｍＵ、チオニン酢酸塩が０．２４ｎｍｏｌ、ｏ−スルホ安息香酸サイクリックが１００ｎｍｏｌ、ナフィオン（登録商標）が０．２ｍｇである。
調製した電極試薬溶液を、作用極としてカーボン、対極としてカーボン、参照極として銀／塩化銀をスクリーン印刷した電極上に塗布し、５０℃のインキュベータ内で５分間乾燥させて試薬層を配した１，５−ＡＧ測定用バイオセンサを得た。
２．バイオセンサの安定性の評価
このバイオセンサを（株）東方技研製ＧＰＩＢ ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ マルチポテンショスタット ＭＯＤＥＬ ＰＳ−０８に端子部で接続した。
検体として１，５−ＡＧ標準液 ０μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬを用い、前記のグルコース変換試薬（具体的には、段落番号００３６に記載した特許文献２に記載の試薬）と１：２の比で混合した後、試薬層を配した電極上に点着して測定を行った。測定は−０．１Ｖ電圧を１０秒印加後、０Ｖ電圧を１００秒印加して行い、０Ｖ電圧を印加した１００秒間の電荷量を測定した。
このバイオセンサを（株）東方技研製ＧＰＩＢ ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ マルチポテンショスタット ＭＯＤＥＬ ＰＳ−０８に端子部で接続した。
検体として１，５−ＡＧ標準液 ０μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬを用い、前記のグルコース変換試薬（具体的には、段落番号００３６に記載した特許文献２に記載の試薬）と１：２の比で混合した後、試薬層を配した電極上に点着して測定を行った。測定は−０．１Ｖ電圧を１０秒印加後、０Ｖ電圧を１００秒印加して行い、０Ｖ電圧を印加した１００秒間の電荷量を測定した。
バイオセンサ安定性の試験は５５℃による加速試験で行った。前記の方法で作成したバイオセンサをシリカゲルと共に密閉して一定期間５５℃で保存した。この加速試験により、室温での安定性を予想することができる。
ブランクである１，５−ＡＧ ０μｇ／ｍＬについては電荷量で経時変化を図５に示した。
シグナルである１，５−ＡＧ ５０μｇ／ｍＬについては、バイオセンサ作製後３日目の測定値を起点とし、その後の測定値を変動率として経時変化を図６に示した。バイオセンサ作製後ｘ日目の１，５−ＡＧ ５０μｇ／ｍＬの測定値を、作製後３日目の１，５−ＡＧ ５０μｇ／ｍＬの測定値で割った値を、ｘ日間保存後の変動率とした。ｘをｘ軸の値とした。
シグナルである１，５−ＡＧ ５０μｇ／ｍＬについては、バイオセンサ作製後３日目の測定値を起点とし、その後の測定値を変動率として経時変化を図６に示した。バイオセンサ作製後ｘ日目の１，５−ＡＧ ５０μｇ／ｍＬの測定値を、作製後３日目の１，５−ＡＧ ５０μｇ／ｍＬの測定値で割った値を、ｘ日間保存後の変動率とした。ｘをｘ軸の値とした。
比較例
安定化剤及び酸性高分子化合物を含まない試薬層を有する１，５−ＡＧ測定用バイオセンサ
比較例として、安定化剤及び酸性高分子化合物を用いないで電極試薬溶液を調製し、実施例１と全く同様に試薬層を配したバイオセンサを作製し、実施例１と同様に試験した。
安定化剤及び酸性高分子化合物を含まない試薬層を有する１，５−ＡＧ測定用バイオセンサ
比較例として、安定化剤及び酸性高分子化合物を用いないで電極試薬溶液を調製し、実施例１と全く同様に試薬層を配したバイオセンサを作製し、実施例１と同様に試験した。
ブランクである１，５−ＡＧ ０μｇ／ｍＬについて測定した電荷量の経時変化を図５に、１，５−ＡＧ ５０μｇ／ｍＬについて測定した電荷量の経時変化を図６に示した。
図５、図６から明らかな様に、比較例と比べて実施例１は保存安定性が格段に向上しており、保存後もバイオセンサ作製初期と同等の測定が可能であることを示している。また、ブランクである１，５−ＡＧ ０μｇ／ｍＬの測定値が比較例に比べて低くなり、Ｓ／Ｎ比が向上することで測定の感度も向上している。
図５、図６から明らかな様に、比較例と比べて実施例１は保存安定性が格段に向上しており、保存後もバイオセンサ作製初期と同等の測定が可能であることを示している。また、ブランクである１，５−ＡＧ ０μｇ／ｍＬの測定値が比較例に比べて低くなり、Ｓ／Ｎ比が向上することで測定の感度も向上している。
実施例２
遺伝子改変１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ、チオニン酢酸塩及びｏ−スルホ安息香酸サイクリックを含む試薬層を有する１，５−ＡＧ測定用バイオセンサ
１．バイオセンサの作製
１，５−ＡＧ測定用酵素として実施例１と同様なシュードモナス エスピー由来の１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ、フェノチアジン類としてチオニン酢酸塩、安定化剤としてｏ−スルホ安息香酸サイクリックを用いて電極試薬溶液を調製した。センサチップ１枚当たりの各使用量は、１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼが６．５２ｍＵ、チオニン酢酸塩が０．２４ｎｍｏｌ、ｏ−スルホ安息香酸サイクリックが１００ｎｍｏｌである。
遺伝子改変１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ、チオニン酢酸塩及びｏ−スルホ安息香酸サイクリックを含む試薬層を有する１，５−ＡＧ測定用バイオセンサ
１．バイオセンサの作製
１，５−ＡＧ測定用酵素として実施例１と同様なシュードモナス エスピー由来の１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ、フェノチアジン類としてチオニン酢酸塩、安定化剤としてｏ−スルホ安息香酸サイクリックを用いて電極試薬溶液を調製した。センサチップ１枚当たりの各使用量は、１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼが６．５２ｍＵ、チオニン酢酸塩が０．２４ｎｍｏｌ、ｏ−スルホ安息香酸サイクリックが１００ｎｍｏｌである。
調製した電極試薬溶液を、作用極としてカーボン、対極としてカーボン、参照極として銀／塩化銀をスクリーン印刷した電極上に塗布し、５０℃のインキュベータ内で５分間乾燥させた。続いて、酸性高分子としてナフィオン（登録商標）をセンサチップ１枚当たり０．２ｍｇとなるように試薬層上に塗布・乾燥して積層し、１，５−ＡＧ測定用バイオセンサを得た。
２．バイオセンサによる全血検体中の１，５−ＡＧ測定
このバイオセンサを（株）東方技研製ＧＰＩＢ ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ マルチポテンショスタット ＭＯＤＥＬ ＰＳ−０８に端子部で接続した。
検体としてヒトの全血を用い、前記のグルコース変換試薬と１：２の比で混合した後、試薬層を配した電極上に点着して測定を行った。測定は−０．１Ｖ電圧を１０秒印加後、０Ｖ電圧を１００秒印加して行い、電圧印加開始から５秒後の電流値を測定した。
このバイオセンサを（株）東方技研製ＧＰＩＢ ＲＳ２３２Ｃ付き８ＣＨ マルチポテンショスタット ＭＯＤＥＬ ＰＳ−０８に端子部で接続した。
検体としてヒトの全血を用い、前記のグルコース変換試薬と１：２の比で混合した後、試薬層を配した電極上に点着して測定を行った。測定は−０．１Ｖ電圧を１０秒印加後、０Ｖ電圧を１００秒印加して行い、電圧印加開始から５秒後の電流値を測定した。
ＳｅｒａＳｕｂ（登録商標；ＣＳＴテクノロジー製）に１，５−ＡＧ標準品を添加して調製した標準液を測定し、得られた電流値を用いて標準検量線を作成した。これを用いて、検体の電流値を１，５−ＡＧ濃度に換算した。
同じヒト全血検体を血漿分離して得られる血漿の１，５−ＡＧ濃度を、ラナＲ１，５ＡＧオートリキッド（日本化薬（株）製）を用いて求め、本電気化学測定で求めた濃度との相関を図７に示す。
図７から明らかなように、相関の傾きは１．０４、相関の切片は−０．０５、相関係数はＲ２＝０．９９４６となり、両測定値は非常に良好な相関が得られた。
実施例３
遺伝子改変１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ、チオニン酢酸塩及び各種安定化剤を含む試薬層を有する１，５−ＡＧ測定用バイオセンサ
実施例１と同様の１，５−ＡＧ測定用酵素、チオニン酢酸塩を用い、安定化剤として以下の表１に示す物質を用い、一部では酸性高分子化合物としてナフィオン（登録商標）を用いて実施例１と同様にバイオセンサを作製し、１，５−ＡＧ ５０μｇ／ｍＬ液を用いて実施例１と同様な方法で試験をして３０日間保存後の変動率を表１に示す。
遺伝子改変１，５−ＡＧデヒドロゲナーゼ、チオニン酢酸塩及び各種安定化剤を含む試薬層を有する１，５−ＡＧ測定用バイオセンサ
実施例１と同様の１，５−ＡＧ測定用酵素、チオニン酢酸塩を用い、安定化剤として以下の表１に示す物質を用い、一部では酸性高分子化合物としてナフィオン（登録商標）を用いて実施例１と同様にバイオセンサを作製し、１，５−ＡＧ ５０μｇ／ｍＬ液を用いて実施例１と同様な方法で試験をして３０日間保存後の変動率を表１に示す。
表中、２種類の安定化剤及び／又は酸性高分子を使用した試験は＋記号を用いて示した。
表１の結果から明らかなように、各種安定化剤を用いることにより、バイオセンサの保存安定性が優れたものになることが分かる。
本発明によれば、保存中の温度等の環境因子変化によるバイオセンサの劣化を防止し、１，５−ＡＧ測定値の変動を抑え、１，５−ＡＧを低値まで正確に測定でき保存安定性の向上したバイオセンサを作製することが可能となり、長期保存後も作製初期と同じ正確な１，５−ＡＧの測定値を得ることができる。また、全血測定においてヘマトクリット等の影響を受けずに広い範囲の検体の１，５−ＡＧの正確な測定を可能とするバイオセンサを提供することができる。
１ 絶縁性基盤
２ 作用極
２ａ 作用極の端子部
３ 対極
３ａ 作用極の端子部
４ 参照極
４ａ 作用極の端子部
５ 絶縁層
６ 試薬層
７ 検体検出部位
８ 端子部
９ スペーサー
１０ カバー
２ 作用極
２ａ 作用極の端子部
３ 対極
３ａ 作用極の端子部
４ 参照極
４ａ 作用極の端子部
５ 絶縁層
６ 試薬層
７ 検体検出部位
８ 端子部
９ スペーサー
１０ カバー
Claims (9)
- １，５−アンヒドログルシトールを電気化学的に測定するための電極系と該電極系上に形成された試薬層を有するバイオセンサであって、該試薬層が、
（１）１，５−アンヒドログルシトール測定用酵素、
（２）フェノチアジン類、及び
（３）塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、ｏ−スルホ安息香酸サイクリック、アルギニン又はその塩、グルタミン酸又はその塩、及びリシン又はその塩からなる化合物群から選ばれる一種又は二種以上の安定化剤
を含有するバイオセンサ。 - １，５−アンヒドログルシトール測定用酵素が１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼ又は１，５−アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼである請求項１に記載のバイオセンサ。
- フェノチアジン類がチオニンである請求項１又は２に記載のバイオセンサ。
- 安定化剤がｏ−スルホ安息香酸サイクリックである請求項１から３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
- 更に、酸性官能基を有しフッ素原子で置換されていてもよい炭化水素化合物である酸性高分子化合物を含有する請求項１から４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
- 酸性高分子化合物がパーフルオロスルホン酸樹脂である請求項５に記載のバイオセンサ。
- １，５−アンヒドログルシトール測定用酵素として、シュードモナス エスピー由来の１，５−アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼを用いる請求項１から６のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
- 請求項１から７のいずれか一項に記載のバイオセンサを用いる検体中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定方法。
- 請求項１から７のいずれか一項に記載のバイオセンサを含む検体中の１，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定用キット。
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