JP5336402B2 - サンプル採取量の補正方法とそれを用いた測定方法 - Google Patents
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- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Description
特開平3−214056号公報(特許文献2)には、内部標準物質を含むサンプル希釈液を収容したサンプル希釈容器と、サンプル及び前記サンプル希釈液から調整したサンプル希釈液の所定量を吸引して反応容器に分注する手段と、サンプル希釈液自体と希釈されたサンプル希釈混合液の内部標準物質の光学的測定結果から誘導されるサンプルの希釈倍率を算出して、原サンプル中の光学的測定分析成分濃度を算出する手段を備えてなる自動分析装置が開示されている。
(1)サンプルと試薬を混合して、サンプル中の被検物質を電気化学的に定量する測定方法において、サンプルの採取量の誤差を、該試薬中に被検物質との電気化学反応に関与しない電子メディエータ1を含有させ、該電子メディエータ1の電気的応答量を用いて補正することを特徴とする電気化学的測定方法。
(3)試薬中の被検物質との電気化学反応に関与しない電子メディエータ1の電気的応答量の測定方法が、微分パルスボルタンメトリー法(DPV法)、矩形波ボルタンメトリー法またはノーマルパルスボルタンメトリー法であることを特徴とする前記(1)または(2)に記載の電気化学的測定方法。
(4)サンプル中の被検物質を電気化学的に測定後、サンプルの採取量の誤差補正のために電子メディエータ1の電気応答量を測定することを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
(5)サンプル中の被検物質を電子メディエータ2と被検物質の酸化還元酵素を用いて測定することを特徴とする前記(1)〜(4)のいずれか一項に記載の電気化学測定方法。
(6)予め、サンプルの採取量と電子メディエータ1の電気応答量の関係式を求めておき、測定した電子メディエータ1の電気応答量を該関係式に代入し、サンプルの採取量を算出することを特徴とする前記(1)〜(5)のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
(8)電子メディエータ2がフェノチアジン類化合物であることを特徴とする前記(5)〜(7)のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
(9)電子メディエータ1がフェナジニウム類化合物であることを特徴とする前記(1)〜(8)のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
(10)サンプルの採取量が30μL以下であることを特徴とする前記(1)〜(9)のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
(11)試薬にサンプル中の被検物質の電気化学的測定を妨害する成分を除去または妨害しない成分に変換する物質を含有することを特徴とする前記(1)〜(10)のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
(13)サンプル中の被検物質を電気化学的に測定後、30秒以内にサンプルの採取量の誤差補正のための電子メディエータ1の電気応答量の測定をすることを特徴とする前記(1)〜(12)のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
中でも特に好ましくは、血液中の1,5−アンヒドログルシトールである。
例えば、血液中の1,5−アンヒドログルシトールを、1,5−アンヒドログルシトールを酸化する酵素を用いて測定する場合、血液中のグルコースが干渉する時には、予めグルコースを1,5−アンヒドログルシトールを酸化する酵素と反応しない物質に変換する物質も該試薬として使用することができる。該物質としては、例えば、グルコースオキシダーゼやヘキソキナーゼなどの酵素とその基質類が挙げられる。
1.サンプル中の被検物質との電気化学測定に用いる電子メディエータ2や試薬に含有される各成分と相互作用しない物質。
2.電子メディエータ2の共存下では試薬に含有されている酵素の反応生成物と相互作用しない物質。
3.電子メディエータ2を用いた電気化学的測定と相互作用しない物質、または、電気化学的に可逆な変化のみを示す物質。
4.酸化還元電位が、電子メディエータ2を酸化的に測定する場合はより還元側にあり、電子メディエータ2を還元的に測定する場合はより酸化側にある物質。特に電子メディエータ2の酸化還元電位と0.2V以上乖離していることが望ましい。
電子メディエータ1は上記の条件を満たせば特に限定されない。
サンプル中の被検物質をまず電気化学的に測定し、引き続きサンプル採取量の誤差を補正するための電気化学的測定法を行っても、測定の順序がその逆であってもよい。好ましくは、サンプル中の被検物質を電子メディエータ2を用いて電気化学的に測定し、引き続きサンプルの採取量の誤差を補正するために電子メディエータ1を用いて電気化学的に測定する方法である。特に被検物質を酸化還元酵素を用いて測定する場合は、該酵素との反応時間を正確にする必要があるので、電子メディエータ2の測定をまず最初に行う。
被検物質の真の濃度は、試薬が固体の場合、
被検物質濃度=電子メディエータ2の電気応答量から求めた被検物質の濃度×(意図したサンプル採取量/電子メディエータ1から求めた実際のサンプル採取量)で求めることができる。
試薬が液体の場合、
被検物質濃度=電子メディエータ2の電気応答量から求めた被検物質の濃度×[{意図したサンプル採取量/(意図したサンプル採取量+試薬液量)}/{電子メディエータ1から求めた実際のサンプル採取量/(電子メディエータ1から求めた実際のサンプル採取量+試薬液量)}]で求めることができる。
実際のサンプルの測定は、前記試薬が正確に20mL入った容器を用意し、この容器に排水処理場から抜き取った排水を簡易ピペットで約20μL入れ、この混合液をDPV測定し、次いで公知(市販)の過酸化水素電極でこの混合液中の過酸化水素濃度を測定する。DPV測定値から上記関係式を用いて被検液の正確な採取量を求め、以下の式で被検液中の過酸化水素濃度を求めることができる。
被検液中の過酸化水素濃度=過酸化水素電極の定量値×[{20μL/(20mL+20μL)}/{DPVで求めた採取量(μL)/(20mL+DPVで求めた採取量(μL))}]
[1]試薬
1N水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH7.7に調整した後の組成が、17.6mMのMgCl2、17.6mMのKCl、175.7mMのホスホエノールピルビン酸(PEP)、17.6mMのATP、123U/mLのピルビン酸キナーゼ(PK)、75U/mLのグルコキナーゼ、200U/mLのアスコルビン酸酸化酵素、100mMの塩化ナトリウム、0.1%のNaN3、0.1mMのEDTA(エチレンジアミン4酢酸)及び0.06%のBSA(牛血清アルブミン)となるように10.0mMのHEPES緩衝液に各成分を加え、グルコース変換試薬とした。電子メディエータ1として1mMのフェノサフラニンを加えた。
ポリエチレンテレフタレートの基盤に作用極とリード部、対極とリード部をカーボンインク((株)アサヒ化学研究所製、製品名カーボンペーストTU15ST)で、参照極とリード部を銀塩化銀インク(アチソン(株)製、製品ElectrodagPE−409)で、厚さ10μmでスクリーン印刷し、150℃で40分焼入れし、次いで電極部と、測定装置との接続部とをのぞく部分にレジストインク((株)アサヒ化学研究所製、製品名CR18G−KF)を厚さ20μmでスクリーン印刷し、130℃で15分焼入れして図2に示す電極を作成した。
次に、120μMのチオニンアセテート(電子メディエータ2;シグマ―アルドリッチ(株)製)、3U/mLの1,5−AG脱水素酵素(国際公開第2008/072702号パンフレット記載)の組成となるように各成分を精製水に溶解して電極用溶液を調製し、この電極の作用極に2μLを塗布して、50℃で5分乾燥してセンサチップを作製した。
サンプルは、被検物質1,5−アンヒドログルシトール20μg/mLを含むセラサブを使用した。セラサブは、CSTテクノロジーズ社(米国)から販売されている擬似血清である。
(1)サンプル採取量とフェノサフラニンの電気応答量の関係式の作成
センサチップをポテンショスタットPS−08に接続し、センサチップの検出部に試薬10μLと10、15、20、30μLの量の各サンプルを混合した液から10μLを載せ、センサチップの参照極を基準に作用極に0Vを印加し5秒後の電流値を計測した。センサチップをポテンショスタットHZ−3000に接続し、DPV測定を行い、フェノサフラニンのピーク電流値を計測した。DPV測定のパラメーターは、初期電位−1V、最終電位0V、スキャン速度10mV/秒、パルス周期200mV/秒、パルス幅50m秒、パルス高さ50mV、サンプル間隔16.7秒に設定した。電気応答量は、DPV測定のピーク電流値として求めた。求めたピーク電流値(X)とサンプル量(Y)の関係式は、図1に示したようにY=−0.0467X+59.884であった。
(2)採取量未知の検体の測定
センサチップをポテンショスタットPS−08に接続し、センサチップの検出部に前処理試薬10μLと凡そ20μLのサンプルを混合した液から10μLを載せ、センサチップの参照極を基準に作用極に0Vを印加し5秒後の電流値を計測した。引き続いて、速やかに(5秒間の定電位測定終了後30秒以内)センサチップをポテンショスタットHZ−3000に接続し、DPV測定を行い、フェノサフラニンのピーク電流値を計測した。DPV測定のパラメーターは、初期電位−1V、最終電位0V、スキャン速度10mV/秒、パルス周期200mV/秒、パルス幅50m秒、パルス高さ50mV、サンプル間隔16.7秒に設定した。結果を表1に示す。
[1]試薬
前記実施例1に同じ。
[2]センサチップ
前記実施例1に同じ。
[3]サンプル
前記実施例1に同じ。
センサチップをポテンショスタットPS−08に接続し、センサチップの検出部に10μLの試薬と凡そ20μLのサンプルを混合した液(実施例1と同じ)から10μLを載せ、センサチップの参照極を基準に作用極に0Vを印加し5秒後の電流値を計測した。結果を表1に示す。
*Aから求めた濃度Bは、電流値から濃度を求める検量式から算出した
**DPVで補正したサンプル採取量は、前記実施例1の[5]の(1)の式より求めた
***DPVで補正した濃度=(B)×[{20/(20+10)}/{(Y/(Y+10)}]
また、実施例における測定値は、最小が20.6μg/mL、最大が23.9μg/mLで特異性103.0%〜119.5%に対し、比較例では最小15.7μg/mL、最大25.9μg/mLで特異性78.5%〜129.5%であり、格段に正確に測定ができたことは明らかである。
2:作用極
3:対極
4:参照極
5:絶縁層
6:試薬層
7:検体検出部位
8:端子部
Claims (13)
- サンプルと試薬を混合して、サンプル中の被検物質を電気化学的に定量する測定方法において、サンプルの採取量の誤差を、該試薬中に被検物質との電気化学反応に関与しない電子メディエータ1を含有させ、該電子メディエータの電気的応答量を用いて補正することを特徴とする電気化学的測定方法。
- サンプル中の被検物質の電気化学的測定方法が、定電位電流測定法または定電位電荷量測定法であることを特徴とする請求項1記載の電気化学的測定方法。
- 試薬中の被検物質の電気化学反応に関与しない電子メディエータ1の電気的応答量の測定方法が、微分パルスボルタンメトリー法、矩形波ボルタンメトリー法またはノーマルパルスボルタンメトリー法であることを特徴とする請求項1または2に記載の電気化学的測定方法。
- サンプル中の被検物質を電気化学的に測定後、サンプルの採取量の誤差補正のために電子メディエータ1の電気応答量を測定することを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
- サンプル中の被検物質を電子メディエータ1と異なる電子メディエータ2と、被検物質の酸化還元酵素を用いて測定することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の電気化学測定方法。
- 予め、サンプルの採取量と電子メディエータ1の電気応答量の関係式を求めておき、サンプルを測定して得られた電子メディエータ1の電気応答量を該関係式に代入し、サンプルの採取量を算出してサンプルの採取量を補正することを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
- 電子メディエータ1の式量電位と電子メディエータ2の式量電位が0.2V以上乖離していることを特徴とする請求項5または6に記載の電気化学的測定方法。
- 電子メディエータ2がフェノチアジン類化合物であることを特徴とする請求項5〜7のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
- 電子メディエータ1がフェナジニウム類化合物であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
- サンプルの採取量が30μL以下であることを特徴とする請求項1〜9のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
- 試薬にサンプル中の被検物質の電気化学的測定を妨害する成分を除去または妨害しない成分に変換する物質を含有することを特徴とする請求項1〜10のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
- 被検物質が1,5−アンヒドログルシトールであることを特徴とする請求項1〜11のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
- サンプル中の被検物質を電気化学的に測定後、30秒以内にサンプルの採取量の誤差補正のための電子メディエータ1の電気応答量の測定をすることを特徴とする請求項1〜12のいずれか一項に記載の電気化学的測定方法。
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