BRPI1011116B1 - Dispositivo de separação cromatográfica em papel associada à detecção eletroquímica, método de operação e uso do referido dispositivo - Google Patents

Abstract

dispositivo de separação cromatográfica em papel associada a detecção eletroquímica, método de operação e uso do referido dispositivo. a presente invenção refere-se a um dispositivo de separação em papel associada à detecção eletroquímica, o qual é capaz de realizar separação cromatográfica e determinar quantitativamente compostos eletroativos, tais como ácido ascórbico e ácido úrico. além disso, a presente invenção refere-se a um método de utilização e uso do referido dispositivo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "DISPOSITIVO DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA EM PAPEL ASSOCIADA À DETECÇÃO ELETROQUÍMICA, MÉTODO DE OPERAÇÃO E USO DO REFERIDO DISPOSITIVO".

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um dispositivo de separação em papel associada à detecção eletroquímica, o qual é capaz de realizar separação cromatográfica e determinar quantitativamente compostos eletroativos, tais como ácido ascórbico e ácido úrico. Além disso, a presente "invenção ref ere-se—ao método de operação e ao uso do._ referido dispositivo.

Antecedentes da Invenção _ ___ Diversos dispositivos que permitem a realização de análises descomplicadas, rápidas e de baixo custo, tais como papéis indicadores de pH e dipstick test assays (testes de fita), foram introduzidos entre os séculos XI e XVII. A maioria dessas técnicas ainda está em uso devido ao seu desempenho satisfatório na realização de análises descentralizadas.

Recentemente, o papel foi subdividido em canais empregando resinas fotossensiveis, PDMS (polidimetil siloxano) ou mesmo cera, com o objetivo de criar dispositivos microfluidicos para a realização de múltiplos bioensaios. Whitesides, G.M. e colaboradores (Analytical Chemistry, vol. 80, pág. 3699, 2008) descreveram um método capaz de quantificar múltiplos analitos utilizando papel subdividido em câmaras, as quais foram modificadas com reagentes sensíveis à glicose ou à proteína. O resultado colorimétrico das reações era digitalizado com a câmera de um telefone celular e as imagens transmitidas a um laboratório, onde especialistas as comparavam com imagens previamente padronizadas e correlacionadas a uma determinada concentração do analito. O resultado da análise -era, então, -retransmitido e o tratamento_dc__paciente .. iniciado rapidamente. Neste mesmo artigo, foi introduzido o termo "pPADs" para classificar, genericamente,_______aqueles dispositivos analíticos construídos sobre papel, onde a adição de amostras ou padrões é realizada pela ação da força de capilaridade e não através de bombas ou microbombas (pPADs, do inglês Micro fluictic Paper-Based Analytical Devices). Observamos que o dispositivo microfluídico apresentado no referido artigo é construído com fotorresiste e o papel é modificado com reagentes específicos, o que difere da presente invenção, onde não é necessário modificar o papel para que a análise seja seletiva, pois a separação cromatográfica que acontece no papel favorece a seletividade. Além disso, uma análise eletroquímica realizada com o dispositivo aqui revelado permite obter resultados com menor limite de detecção e com maior sensibilidade. Ademais, no caso da presente invenção, a análise dos resultados pode ser feita de forma bastante simplificada por pessoal não especializado. A eletroquimica sempre forneceu técnicas analíticas caracterizadas pela simplicidade instrumental, portabilidade e custo relativamente baixo. Devido a estas características, a integração de técnicas eletroquímicas com a microfluídica em papel é extremamente vantajosa. Em um. «artigo científico publicado por^Henry e colaboradores (Electrochemical Detection for Paper-Based Microfluidics;

Analytical Chemistry, vol. 81, no. 14, 15 de julho, 2 009) , no final de um canal microfluídico feito em papel foi realizada a determinação cronoamperométrica de glicose, lactato e ácido úrico em urina, empregando reações enzimáticas promovidas por enzimas oxidases. O dispositivo t revelado na presente invenção torna-se mais vantajoso em relação àquele descrito no referido artigo ao evitar o uso de biomoléculas (neste caso, enzimas), pois isso permite estender a vida útil do referido dispositivo, uma vez que as enzimas, tal como qualquer biomolécula, podem se degradar facilmente em temperaturas altas ou mesmo quando são expostas durante muito tempo a condições rígidas de estocagem. O artigo científico de Whitesides, G.M. e colaboradores (Lab on a Chip, vol. 10, págs. 477-483, 2010) se refere a um dispositivo de detecção em papel, onde os eletrodos foram impressos com tinta de carbono e prata sobre um substrato de papel ou poliéster e a área eletroativa foi isolada por meio da aplicação de técnicas litográficas empregando fotorresiste ou cera parafínica. O canal de papel no qual a medida foi feita foi adesivado sobre os eletrodos empregando fitas adesivas.de.dupla face.

Utilizando o referido dispositivo, os autores realizaram a determinação de glicose através _do_ uso da enzima glicose oxidase. Uma quantidade relativamente grande de enzima foi empregada nesta configuração, visto que o canal tinha aproximadamente 25 mm x 4 mm. O biossensor construído através do método apresentado no artigo em referência é de segunda geração e, portanto, emprega o mediador de elétrons hexacianoferrato (II) de potássio. No caso da análise de ácido úrico, o dispositivo descrito no referido artigo deverá ser modificado com a enzima específica, isto é, a uricase. No entanto, se o objetivo for a análise de lactato, o dispositivo deverá conter outra enzima, a saber: lactato oxidase ou lactato desidrogenase. Deste modo, observa-se que o dispositivo somente será seletivo com o emprego das enzimas, o que não ocorre com o uso do dispositivo da presente invenção, uma vez que este não utiliza enzimas, conforme mencionado anteriormente.

Além disso, no artigo de Whitesides em análise é descrito o emprego de poliéster para a construção dos eletrodos impressos. É bastante conhecido o processo de construção de eletrodos impressos sobre poliéster empregando tintas condutoras, sendo um processo barato e bastante simples de ser realizado. Apesar da presente invenção- utilizar ouro na construção de eletrodos,- o uso deste elemento se justifica pela sua biocompatibilidade com as _biomoléculas „de, reconhecimento e pela superior eletroatividade da superfície, uma vez que um eletrodo construído com tinta condutora não é tão bom condutor quanto um eletrodo construído por um filme fino de ouro. Ademais, é importante ressaltar o fato de que os discos compactos (CDs) são construídos por meio de sputtering metálico sobre policarbonato, uma técnica similar àquela empregada na construção de eletrodos de ouro descartáveis. Devido à produção em massa destes CDs, por mais que empreguem ouro ou prata, o custo é bastante acessível e o mesmo se aplica aos eletrodos descartáveis em ouro.

Ainda em referência ao artigo de Whitesides, G.M. e colaboradores, verifica-se que no dispositivo apresentado nesse artigo a matriz é relativamente rígida, pois é construída em uma fina folha de papel ou uma fina película de poliéster. Como o canal de papel é colado com uma fita adesiva dupla-face sobre os eletrodos impressos, dificilmente o referido dispositivo poderá ser reutilizado, pois o papel tende a sofrer um processo de inchaço quando é umedecido, o que irá proporcionar o descolamento da fita adesiva e a formação de’”um canal irregular, causando assim a realização vie poucas™ repetições- de medidas.

Comparativamente, o dispositivo de separação cromatográfica associada à detecção eletroquímica dapresente invenção emprega uma pequena fita de papel pressionada sobre os eletrodos impressos em poliéster em que, · após o uso de uma fita, esta pode ser descartada e uma nova fita pode ser pressionada sobre o mesmo eletrodo de ouro. Logo, a parte mais custosa do dispositivo da presente invenção (eletrodo de ouro) é reutilizada inúmeras vezes, enquanto que a fita de papel é substituída facilmente. O documento de patente europeu EP 1936375 BI se refere a um artigo eletrolítico descartável (por exemplo, uma fita) , o qual detecta de modo direto e não-enzimático a concentração de biomoléculas, tais como ácido úrico e hemoglobina, em uma amostra líquida. A referida fita detecta a concentração de biomoléculas em uma amostra através da captura de sinais gerados por uma corrente redox de um mediador de elétrons redox, na presença de um tensoativo. 0 dito mediador (ferricianeto de potássio) facilita a transferência de elétrons da espécie de interesse para a superfície eletródica e este transferência é monitorada em um potencial elétrico menor do que o potencial da própria oxidação ou redução da espécie química ’ de interesse. '“A" "qubstão é que o eletrodo-'deixa de ser seletivo, pois ele pode- e—com certeza irá permitir_a_ transferência de elétrons de outras espécies químicas para a superfície eletródica ·_ O grande diferencial deste eletrodo descartável é o uso de um tensoativo catiônico (CTAB), o qual melhora a cinética de transferência eletrônica do mediador, tornando o dispositivo mais sensível. O documento em referência também fornece um método para a fabricação da referida fita eletrolítica e um equipamento de detecção contendo a dita fita. A presente invenção permite a realização de uma análise seletiva de ácido úrico mesmo na presença de um composto que interfere muito na análise de ácido úrico em sangue - o ácido ascórbico. O documento de patente europeu em referência não comenta o efeito de interferentes e este é um fator crucial na análise de ácido úrico em sangue, pois os métodos colorimétricos e eletroquímicos são comprovadamente interferidos pela presença de ácido ascórbico. Isso pode ser comprovado pelo fato de que os pacientes são aconselhados a não ingerir alimentos ou medicamentos que contenham ácido ascórbico (vitamina C) antes de realizar amostragens de sangue para análise de ácido úrico. Mesmo assim, a análise ainda pode ser interferida pelo ácido ascórbico residual.

0 documento de patente norte-americano US '6,258,230 BI revela uma - fita eletrolítica—·descartável não-enzimát ica—· para a detecção de ácido úrico, a qual detecta diretamente a__ooncent ração de ácido úri ço__em uma amostra líquida sob uma baixa voltagem operacional inferior a 4 00 mV e um pH de 7 a 10. Quando a fita eletrolítica é aplicada para detectar a concentração de ácido úrico no corpo humano, ela evita sinais de interferência causados por outros componentes do sangue. Além disso, a dita fita não sofrerá interferência do ácido ascórbico, a não ser que a concentração desse ácido aumente para um valor 15 vezes maior que a sua concentração normal no sangue. Não apenas o soro, mas também o sangue total pode ser tomado como uma amostra para a detecção da concentração de ácido úrico no mesmo. A fita eletrolítica para a detecção de ácido úrico é modificada por um mediador de elétrons redox solúvel em água. A fita eletrolítica é fácil de transportar e pode ser facilmente produzida, particularmente através de produção em massa. Ao analisarmos o referido documento, foi possível observar que este apresenta o mesmo princípio de funcionamento do documento europeu EP 1936375 BI mencionado anteriormente, pois em ambos o eletrodo descartável utiliza um mediador de elétrons solúvel em água imobilizado sobre a superfície de um eletrodo impresso. A diferença entre as duas tecnologias consiste apenas na sol'ução empregada para a imobilizaçâo do mediador sobre a superf ície—eletródica. No documento—US— . 6,258,230 BI não são empregados tensoativos na solução de imobilizaçâo, mas somente, .álcool,água, ferricianeto de potássio e metil celulose. Apesar dos inventores do documento norte-americano em análise assumirem que o ácido ascórbico não se oxida em potenciais inferiores a 400 mV, não há nenhum experimento que leve a esta conclusão. Outro fator que deve ser mencionado é o pH, cuja faixa de trabalho é estabelecida no referido documento como estando entre 7 e 10. Sabe-se que nestas condições o ácido ascórbico tem baixa estabilidade e se degrada mais rapidamente. Contudo, estas são condições de contorno, as quais não resolvem completamente os problemas de interferência gerados pela presença de compostos eletroativos presentes no sangue, tal como o ácido ascórbico. Outro diferencial deste documento é a construção de um segundo sensor que emprega o mesmo mediador (ferricianeto de potássio), o tensoativo TRITON e água no desenvolvimento de um dispositivo sensor para hemoglobina.

Em resumo, não há evidências experimentais plausíveis para que o sensor revelado no documento US 6,258,230 Bl não seja tão interferido pela presença de ácido ascórbico quanto o sensor ensinado no documento europeu EP 1936375 Bl. Deste modo, as vantagens da presente invenção em relação ao ' documento norte-americano residem-no fato de que- a mesma promove a separação de compostos, tais como ácido ascórbico e ácido úrico, antes_de realizar a_artálise. Adicionalmente, é possível realizar a análise de dois compostos simultaneamente tal como, por exemplo, quantificar ácido úrico e também ácido ascórbico. O documento de patente brasileiro PI 0101870-1 ensina um sensor químico potenciométrico, o qual foi desenvolvido para a detecção de ácido úrico. O referido sensor está baseado na modificação da superfície de um eletrodo de grafite/epóxi com uma membrana de polietileno coacetato de vinila (40% m/m) dopada com 5% de íons ferro (III) . O desenvolvimento do potencial é devido à redução dos íons ferro (III) para ferro (II) pelo íon urato, alterando assim a densidade de carga sobre a superfície do eletrodo, gerando uma variação de potencial. O sensor revelado no referido documento não é seletivo para a determinação de ácido ascórbico e ácido úrico. Alterando-se o pH do meio de reação é possível realizar a análise de ácido ascórbico em meio ácido sem a interferência de ouro. Após uma etapa de pré-tratamento da amostra, a qual dura 20 minutos, é possível realizar a análise de ácido úrico sem a interferência do ácido ascórbico removido do meio reacional por decomposição. Já o' dispositivo da presenteinvenção realiza a análi-se simultânea—de -ácido úrico--·e ácido . ascórbico em mistura e o faz em uma única medida, dado que a„técnica: permite^que as duas ,_s_ub_stâncias se ή am_seqreqadas e então detectadas eletroquimicamente. Além disso, para a utilização do sensor descrito no documento PI 0101870-1, é necessário providenciar um eletrodo auxiliar e também um eletrodo de referência. Adicionalmente, a montagem de todo o sistema eletroquímico e a realização da medida exige que pessoas treinadas sejam as executoras da análise. Em contrapartida, a análise proposta pela presente invenção emprega uma célula eletroquímica integrada que dispõe dos três eletrodos necessários à medida, tornando o seu emprego mais simples e descomplicado. Outra característica relevante do dispositivo descrito no documento PI 0101870-1 é que a técnica utilizada nesta análise é potenciométrica.

Desta forma, o sinal analítico é proporcional ao logaritmo da concentração da espécie química de interesse. O dispositivo eletroquímico para a análise em papel da presente invenção é amperométrico, em que o sinal analítico é diretamente proporcional à concentração do analito, o que torna o dispositivo amperométrico muito mais sensível que qualquer dispositivo de análise potenciométrica. O documento.de patente norte-americano US 2008/0142362 Al..descreve'"'“uma formulação reagente em filme usa da no----- preparo de uma fita eletrolítica não-enzimática de sangue.... total para detecção de ácido úrico, a qual compreende um mediador de elétrons, um veículo de polímero solúvel em água e um solvente orgânico volátil. Além disso, o documento em questão se refere a sistemas biossensores de sangue total. Conforme mencionado anteriormente em relação ao documento EP 1936375 Bl, neste caso também existe a desvantagem do eletrodo não ser seletivo, permitindo assim a transferência de elétrons de outras espécies químicas para a superfície eletródica. Já a presente invenção permite a realização de uma análise seletiva de ácido úrico mesmo na presença de um composto que interfere muito na análise de ácido úrico em sangue (ácido ascórbico). O documento norte-americano em referência também não comenta o efeito de interferentes na análise de ácido úrico em sangue, o que é de extrema importância, uma vez que os métodos coloriraétricos e eletroquímicos são comprovadamente interferidos pela presença de ácido ascórbico.

Geralmente, compostos presentes em misturas de diferentes tipos de amostra podem ser separados por HPLC, (Cromatografia Líquida de Alta Pressão, do inglês High Pressure Liquid Chromatography) e detectados por meio de diferentes técnicas, tais como detecção colorimétrica, eletroquímica, etc. Esta é a tecnologia...mais aplicada para - - a„análise de -compostos de interesse clínico.,____.tais como .___ ácido ascórbico e ácido úrico, em mistura.

Outras técnicas podem ser utilizadas para a separação de misturas, no entanto, a mais empregada atualmente em laboratórios analíticos é a cromatografia. Esta técnica é muito eficiente para a separação e detecção dos mais diversos tipos de compostos. A cromatografia acoplada à detecção eletroquímica é empregada para a detecção de compostos eletroativos, todavia, utiliza uma instrumentação cara e um grande volume de reagentes.

Fitas de papel ou mesmo canais criados sobre papel podem funcionar como colunas cromatográficas que podem ser acopladas a eletrodos impressos ou eletrodos de filmes metálicos. Em geral, canais construídos em papel são plataformas versáteis e de baixo custo adequadas ao desenvolvimento de dispositivos analíticos do tipo point- of-care (ponto de cuidado) ou para o desenvolvimento de sensores para o monitoramento ambiental ou controle de qualidade em indústrias.

Em vista do acima exposto, seria útil se a técnica dispusesse de um dispositivo analítico quantitativo capaz de combinar cromatografia em papel com detecção eletroquímica, visando um método alternativo para a determinação---de compostos----onde--·· o baixo--custo--e- a---- simplicidade são essenciais. . ____ ______________ Sumário da Invenção A presente invenção foi desenvolvida com o objetivo de construir um dispositivo capaz de realizar a separação cromatográfica e a determinação quantitativa de compostos eletroativos, tais como ácido ascórbico e ácido úrico, através do uso de separação cromatográf ica em papel associada à detecção eletroquímica, em que o referido dispositivo é simples, seletivo, descartável e de baixo custo, sendo capaz de resolver problemas analíticos que geralmente requerem instrumentação sofisticada.

Além disso, o objetivo da presente invenção não é apenas apresentar um dispositivo para detectar compostos eletroativos em papel, mas também que seja capaz de separar os componentes de uma amostra utilizando cromatografia em papel e detectá-los à medida que alcançam o detector.

Um outro objetivo da presente invenção é apresentar um método de operação do dispositivo acima mencionado e seu respectivo uso.

Breve Descrição das Figuras A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais - -bem entendidas- mediante referência às figuras—em anexe e à — seguinte descrição: ___ - --- _ - A Figura 1 em anexo apresenta uma vista esquemática do dispositivo de separação cromatográfica em papel associada à detecção eletroquímica da presente invenção. - A Figura 2 em anexo apresenta uma vista da célula eletroquímica construída em papel (área branca em torno dos eletrodos) utilizada no dispositivo da presente invenção, onde a área eletroativa dos eletrodos é delimitada pelas trilhas de parafina impressas em papel (em preto). A Figura 3 em anexo apresenta o desempenho do dispositivo da presente invenção na separação e detecção de ácido úrico (UA) e ácido ascórbico (AA) . As seguintes amostras foram utilizadas: (A) eluente (0,10 mol.L'1 de tampão acetato, pH 4,5); (B) 0,10 mmol.L'1 de UA preparado em tampão acetato; (C) 0,10 mmol.L-1 de AA preparado em 0,1 mol.L-1 de tampão acetato; e D: 0,10 mmol.L-1 de AA e UA diluídos em tampão acetato. - A Figura 4 em anexo apresenta o efeito do pH do eluente na eficiência de separação de misturas contendo ácido ascórbico e ácido úrico, sob as seguintes condições experimentais: 0,4 mmol.L-1 de ácido ascórbico e ácido úrico, sendo que 2 pL da mistura foi adicionado ao papel; potencial aplicado de 0,4 V vs. Au; e eluente utilizado: C,1C mol.L-1 de tampão acetato de sódio.- - - - _ - A Figura 5. apresenta a influência -da -concentração da fase móvel nas correntes de pico obtidas para o ácido ascórbico e .o ácido úrico, _èm_que a_ resposta relativa é, baseada na altura dos picos cronoamperográficos de AA e UA, sob as seguintes condições experimentais: 0,05 mol/L; 0,10 mol/L; 0,20 mol/L; 0,30 mol/L de tampão acetato em pH 4,5. - A Figura 6 apresenta cronoamperografias do ácido ascórbico e do ácido úrico em misturas contendo diferentes concentrações de ambos compostos na faixa de concentração de 0,05 a 0,4 mmol.L-1. A referida Figura 6 apresenta ainda os gráficos de Ai (altura do pico) versus a concentração de AA e UA.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção trata de um dispositivo de separação em papel associada à detecção eletroquímica, o qual é capaz de realizar separação cromatográfica e determinar quantitativamente compostos eletroativos, tais como ácido ascórbico e ácido úrico.

Adicionalmente, o dispositivo da presente invenção pode ser adaptado para a separação e detecção de outras espécies eletroativas, no entanto, será necessário ajustar as condições da fase móvel; selecionar o ' melhor tipo de papei ou mesmo modificar a. fibra- de- celulose,- de- forma - a - estabelecer as condições adequadas à separação dos analitos de interesse. Por exemplo, jexistem alguns _me_t_abó_lit_os. _ eletroativos clinicamente relevantes, tais como as· catecolaminas, purinas e pirimidinas, que podem ser separados e determinados empregando o dispositivo proposto na presente invenção para a detecção precoce de câncer.

Ademais, alguns xenobióticos que são eletroativos e amplamente empregados na agricultura, tais como thiran, linuron e metil-carbamatos, também poderão ser separados, identificados e quantificados empregando o dispositivo da presente invenção. 0 dispositivo revelado na presente invenção compreende os seguintes elementos principais, conforme mostrado na Figura 1 em anexo: - fita de papel cromatográfico; - microcélula eletroquímica em ouro; - solução eletrolítica (eluente); - equipamento medidor de corrente; e - opcionalmente, um conector DIN (conector padronizado pelo Deutsches Institut für Normung - DIN, o instituto de padrões da Alemanha)-. - - ' A referida_ microcélula. .eletroquímica - em - ouro - compreende, por sua vez, os seguintes elementos principais: - eletrodo de trabalho (WE) ; ■■ - __ _ ~ - - - - eletrodo de referência (RE); - eletrodo auxiliar (CE); e - material isolante. A seguir, é descrita uma modalidade preferencial de manufatura da microcélula eletroquímica em ouro utilizada no dispositivo da presente invenção.

Uma máscara de sombra foi construída em cobre por processos de fotolitografia e corrosão. Esta máscara física foi posicionada sobre papel cromatográfico 1 Chr da Whatman. Em seguida, um filme de ouro foi depositado sobre o sistema por electron-beam (técnica de deposição metálica a vácuo) a uma pressão base de 2,1x10-6 mBar, empregando um alvo de ouro importado com 99,9999% de pureza. O equipamento foi ajustado para a deposição de 200 nm de ouro sobre o substrato. Para criar canais no papel para orientar o fluxo da solução e para isolar a região eletroativa dos três eletrodos de ouro, na face anterior do papel, duas linhas foram construídas de duas formas diferentes: (i) por meio da técnica de serigrafia (silkscreen) utilizando o fotorresiste Futurrex ou; (ii) imprimindo linhas com cera utilizando a impressora Phaser 8560 DN da Xerox. O material" isolante utilizado fo\ uma fita_ adesiva, não ccndutora de- = corrente. Qualquer polímero não condutor poderia ser utilizado como material isolante, tal como,= por exemplo,_ _ resinas alquídicas. z A serigrafia foi realizada em telas de seda com canais de diferentes espessuras e comprimentos que, posteriormente, foram serigrafados com o fotorresiste Futurrex sobre o verso do papel contendo os eletrodos de filme metálico. A construção dos canais utilizando cera (solid ink) foi realizada da seguinte maneira: antes de depositar os eletrodos metálicos, linhas de cera em papel cromatográfico foram impressas na impressora Phaser 8560DN, Xerox. Em seguida, as folhas de papel foram aquecidas em chapa de aquecimento à temperatura nominal de 70°C. Com este procedimento, a cera se fundiu e penetrou no papel, construindo assim os canais em toda a espessura do papel.

Houve uma expansão de aproximadamente 0,5 mm da linha impressa da cera quando este procedimento foi realizado. A máscara física foi construída de forma a gerar eletrodos com o seguinte formato: os eletrodos auxiliar e referência tinham formato retangular com uma área de 3,00 mm2 e o eletrodo de trabalho apresentou uma área de 2,50 mm2 para canais de 5 mm. Os eletrodos auxiliar e de referência foram construídos .ccm Largura -de 1,0-mm e· o - eletrodo de trabalho com largura de 0,5 mm. Desta forma, quanto mais largo o canal. construído - com as -trilhasmaior ,t a área dos eletrodçs. A Figura 2 em anexo mostra a célula eletroquímica construída em papel (área branca em torno dos eletrodos), onde a área eletroativa dos eletrodos é delimitada pelas trilhas de parafina impressas em papel (em preto). A presente invenção também trata de um método de operação do dispositivo conforme descrito anteriormente. A seguir, será descrita uma modalidade preferencial do método de operação do dispositivo da presente invenção, a qual não deve ser considerada como limitativa da mesma.

Uma fita de papel de aproximadamente 60 x 6 mm, preferivelmente papel cromatográfico Whatman grau 1 Chr com espessura de 0,18 mm, é pressionada na interface ativa de uma microcélula eletroquímica em ouro, preferivelmente uma microcélula conforme aqui descrita anteriormente.

Em seguida, uma amostra contendo uma mistura de compostos eletroativos é dispensada sobre a referida fita de papel e uma extremidade da mesma é imersa ou dispensada em uma solução eletrolítica (eluente) adequada.

Como as medidas eletroquímicas só podem ser iniciadas na presença de uma solução eletrolítica e esta -condição-só -é atingida no momento em que a fase móvel atinge os eletrodos (RE, CE,.WE), é necessário que_ a_ interface,seja transparente para que o operador possa iniciar manualmente o registro do sinal.

As referidas medidas eletroquímicas são realizadas em um potenciostato (por exemplo, Autolab PGSTÁT10) interfaciado a um computador (o software utilizado pode ser o GPES 4.9, da Eco Chemie BV, Holanda) . No entanto, este aparato pode ser facilmente substituído por um amperímetro portátil. O cabo original que permite a conexão dos eletrodos de referência, auxiliar e de trabalho (RE, CE, WE) foi substituído por um cabo adaptado compreendendo um conector DIN que se liga ao potenciostato e por um slot que permite a conexão com o eletrodo descartável.

Deste modo, após aguardar o registro dos cronoamperogramas, o operador pode visualizar o resultado obtido em um registrador (por exemplo, um computador) e comparar as magnitudes de corrente obtidas com aquelas obtidas para soluções padronizadas, fornecendo um resultado analítico.

Testes experimentais foram realizados utilizando o dispositivo de separação cromatográfica em papel associada à detecção eletroquímica d_a presente invenção, bem como o método de operação do referido dispositivo, conforme será descrito a seguir. . . . _ _ . .

Inicialmente, soluções estoque de ácido ascórbico (AA) e ácido úrico (UA) a 1,0 mmol.L-1 foram preparadas em ácido acético e acetato de sódio, respectivamente. Em seguida, misturas com concentrações conhecidas de AA e UA foram preparadas em tampão acetato. 2,0 pL destas soluções foram dispensados sobre o papel cromatográfico para a realização da separação e detecção eletroquímica. A separação foi realizada através de uma coluna de papel e a detecção eletroquímica iniciada quando a solução eletrolítica (fase móvel) atingiu a região eletroativa da microcélula eletroquímica. É importante ressaltar que as oxidações do ácido úrico e do ácido ascórbico ocorrem na mesma faixa de potencial.

Por este motivo, a determinação de um dos compostos é sempre interferida pela presença do outro. Na maior parte das vezes, é necessário que o paciente se abstenha de alimentos ou mesmo de suplementos alimentares que contenham ácido ascórbico (vitamina C) por algumas horas ou dias quando for se submeter à quantificação de ácido úrico.

No dispositivo da presente invenção, o potencial aplicado de + 0,4 V vs. Au foi escolhido após a realização de um estudo voltamétrico no _qual foi verificado- os-picos- = de oxidação de AA e UA sobre a microcélula eletroquímica de ouro em condições hidrostáticas. Ambos _ qs_ çompostos. _ apresentaram mais de 90% da corrente de pico anódica no- potencial de + 0,4 V vs. Au.

Em linhas gerais, o método de operação do dispositivo da presente invenção funciona da seguinte maneira: à medida que o eluente avança por ação de capilaridade, ele encontra e dissolve a amostra contendo a mistura de AA e UA, os quais são transportados através do papel junto com o eluente, de acordo com a sua solubilidade e sua adsorção nas fibras polares de celulose. O pH do eluente foi ajustado para 4,5, isto é, está entre os valores de pKa do ácido ascórbico (pKa=4,l) e do ácido úrico (pKa=5,4) .

Consequentemente, o ácido ascórbico ficou ionizado e muito mais solúvel na fase móvel do que o ácido úrico. Além disso, a geometria molecular e a presença de menos ligações polares no íon ascorbato o caracteriza como menos polar que o urato. Então, a retenção do ácido úrico nas fibras de celulose é mais intensa, como pode ser observado na Figura 3 em anexo. O tipo de papel, a sua espessura e o comprimento da coluna influenciam sensivelmente a eficiência da separação. 0 comprimento da coluna foi estabelecido como a distância'.' entre o ponto de injeção da amostra_ e a região_do -papel -que- ·- se localiza sobre a área eletroativa da célula eletroquímica de ouro. Três diferentes comprimentos _ de_ __ coluna foram testados: 5, 10 e 20 mm. Na coluna mais curta, os picos de AA e UA ficaram sobrepostos e na coluna mais longa, o pico de ácido úrico apresentou uma cauda muito longa. Na coluna de 10 mm, o ácido ascórbico e o ácido úrico foram completamente separados, como mostra o gráfico D da Figura 3 em anexo.

Na Figura 4 em anexo, as cronoamperografias da separação das misturas de AA e UA são apresentadas para diferentes pH. À medida que o pH aumenta, a altura do pico de ácido ascórbico diminui. Em pH 3,4, a solubilidade do ácido úrico na fase móvel se torna crítica, ficando completamente retido na fase estacionária. Em pH 4,5, o ácido úrico está em sua forma molecular, mas em pH 5,9 está ionizado. A força iônica da fase móvel apresentou um efeito significante na altura dos picos do AA e UA. Na Figura 5 em anexo, pode-se observar que a altura de pico do ácido ascórbico aumenta em valores de força iônica de 0,05 até 0,20 mol.L-1 e decresce para valores maiores de força iônica. Por sua vez, a altura de pico para o UA diminui quando a força iônica varia de 0,05 a 0,10, mas se mantém constante para valores de força _ iônica . superiores. -A - repetição das medidas de ambos analitos aumenta significativamente quando a concentração do eluente, no _ sistema é de 0,10 mol.L-1.

Uma separação típica de ácido ascórbico e ácido úrico por cromatografia líquida de alta eficiência exige um tempo de pelo menos cinco minutos por corrida, enquanto que 16 minutos são necessários para realizar a separação dos mesmos analitos empregando um dispositivo de separação em papel. Por definição, o tempo de retenção é o tempo necessário para que um analito atinja o detector a partir do momento em que foi injetado na coluna de separação.

Consequentemente, na Figura 3 em anexo, os tempos de retenção das espécies químicas devem ser determinados da seguinte forma: o tempo registrado na cronoamperografia adicionado do tempo necessário para que o solvente percorra a coluna e atinja o detector eletroquímico (2,5 ±0,1 min, para uma coluna de 10 mm com 7 mm de largura) . Em geral, o tempo de análise empregando o dispositivo proposto na presente invenção é mais longo do que o tempo necessário para a realização de uma determinação por HPLC. Contudo, o dispositivo de separação cromatográfica em papel da presente invenção não requer instrumentação sofisticada, é portátil, fácil de operar e apresenta' baixo custo por análise. Além disso, diferentes, .configurações ' podem " ser" propostas para o referido dispositivo de separação cromatográf ica em papel, o que _ pode, «pr.ovavelmenfee7 - -diminuir o tempo gasto por corrida cromatográfica. A principal vantagem dos dispositivos denominados pPADs reside no fato de apresentarem o mais baixo custo dentre os dispositivos descartáveis de análise. A inclusão de eletrodos de ouro nestes dispositivos aumenta em cinco vezes o custo do dispositivo se a produção em larga escala for considerada para a estimativa. Entretanto, o emprego do dispositivo de separação cromatográfica em papel com detecção eletroquímica da presente invenção diminui o custo de uma análise em mais de vinte vezes se comparado a uma análise por HPLC.

Curvas de calibração foram calculadas para cada composto de forma a determinar a uniformidade da resposta analítica em relação a uma faixa de concentrações (Figura 6). Tanto a altura do pico, quanto a área sobre o pico de AA e UA podem ser empregadas para construir a curva analítica, pois para ambos são obtidas sensibilidades semelhantes. A altura de pico foi escolhida devido à facilidade em se obter a medida. Os ácidos úrico e ascórbico apresentaram limites de detecção semelhantes (em torno de 0,02 mmol.L-1), então quantidade tão baixas quanto 40 pmols de AA e UA podem ser precisamente, determinadas. Ό- - limite de detecção foi determinado usando a equação 3o/slope, onde o é o desvio padrão. A sensibilidade^ Ç152 nA „ _ L.mmol-1 para AA e 64 nA L.mmol-1 para UA) e a faixa linear foram superiors para AA, como mostrado na Figura 6 em anexo.

Os níveis normais de ácido úrico no plasma sanguíneo estão na faixa de 0,1 â 0,4 mmol.L-1, enquanto que os níveis normais de vitamina C estão na faixa de 0,05 a 0,1 mmol.L-1. Com base nas regiões de linearidade obtidas com o dispositivo proposto na presente invenção na separação e deteção de AA e UA, o referido dispositivo pode ser empregado na determinação destes analitos no plasma.

Adicionalmente, a presente invenção trata do uso de um dispositivo conforme descrito anteriormente para realizar a separação cromatográfica de compostos eletroativos e determinar quantitativamente os referidos compostos. É importante ressaltar que o dispositivo e o método aqui apresentados não se limitam a aplicações relacionadas ao diagnóstico clínico, mas podem ser adaptados a aplicações forenses, industriais ou mesmo de cunho ambiental.

Assim, embora tenham sido mostradas apenas algumas modalidades da presente invenção, será entendido que várias.' omissões, substituições e alterações no dispositivo- -e - - método conforme aqui apresentado podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espírito _e . éscòpo da presente invenção. É expressamente previsto que todas as combinações de elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma modalidade descrita por outros são também totalmente pretendidas e contempladas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (21)

1. Dispositivo de separação cromatográfica em papel associada à detecção eletroquímica caracterizado pelo fato de compreender os seguintes elementos: - fita de papel cromatográfico; - microcélula eletroquímica em ouro; - solução eletrolítica (eluente); e - equipamento medidor de corrente.

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida -fita de papel....... cromatográf ico possui dimensões de 60 __ x 6 = mm,. , sendo. ---preferivelmente feita de papel cromatográfico Whatman grau 1 Chr com espessura de 0,18 mm. __,

3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida microcélula eletroquímica em ouro compreende os seguintes elementos: - eletrodo de trabalho (WE); - eletrodo de referência (RE); - eletrodo auxiliar (CE); e - material isolante.

4. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os referidos eletrodos auxiliar (CE) e de referência (RE) têm preferivelmente formato retangular com uma área de 3,00 mm2 e largura de 1,0 mm e o referido eletrodo de trabalho (WE) possui uma área de 2,50 mm2 e largura de 0,5 mm.

5. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o equipamento medidor de corrente é um potenciostato.

6. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que um conector DIN está ligado ao potenciostato.

7. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o equipamento medidor de corrente é um amperímetro portátil. ------

8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a separação é realizada, através de uma coluna cromatográfica em papel.

9. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução eletrolítica representa a fase móvel da separação cromatográfica.

10. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção eletroquímica é realizada em um potenciostato interfaciado a um computador.

11. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção eletroquímica é realizada em um amperímetro portátil interfaciado a um computador.

12. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção elet roquimica é iniciada apenas quando a solução eletrolítica atinge uma região eletroativa da microcélula eletroquímica em ouro.

13. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o limite de detecção do referido dispositivo é de 0,02 mmol.L-1.

14. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tempo de........análise dc referido dispositivo é de 16 minutos. , ~ ’

15. Método de operação do dispositivo conforme definido nas reivindicações de 1 a 14 caracterizado -pelo fato de _ compreender ãs seguintes etapas: pressionar a fita de papel cromatográfico sobre uma interface ativa da microcélula eletroquímica em ouro; - dispensar uma amostra contendo uma mistura de compostos eletroativos sobre a fita de papel cromatográfico; - dispensar ou imergir uma extremidade da fita de papel cromatográfico na solução eletrolítica (eluente); - aguardar o registro dos cronoamperogramas; - visualizar o resultado obtido em um registrador; - comparar as magnitudes de corrente obtidas com aquelas obtidas para soluções padronizadas; e - fornecer um resultado analítico.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a referida amostra é dispensada preferivelmente em uma quantidade de 2,0 pL.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o registrador é um computador.

18. Uso do dispositivo conforme definido nas reivindicações de 1 a 14 caracterizado pelo fato de ser para realizar a separação cromatográfica .de , compostos-eletroativos e determinar quantitativamente os referidos, . . - compostos.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo ,feto de- 'que cs referidos compostos eletroativos são selecionados do grupo compreendido por ácido ascórbico, ácido úrico, catecolaminas, purinas, pirimidinas thiran, linuron e metil-carbamatos.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os referidos compostos eletroativos são preferencialmente ácido ascórbico e ácido úrico.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ser em diagnóstico clínico, aplicações forenses, industriais ou de cunho ambiental.