JPH0870893A - 犬の糖尿病診断法、１，５−アンヒドログルシトールの定量法及びキット - Google Patents
犬の糖尿病診断法、１，５−アンヒドログルシトールの定量法及びキットInfo
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- JPH0870893A JPH0870893A JP23255794A JP23255794A JPH0870893A JP H0870893 A JPH0870893 A JP H0870893A JP 23255794 A JP23255794 A JP 23255794A JP 23255794 A JP23255794 A JP 23255794A JP H0870893 A JPH0870893 A JP H0870893A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】犬の糖尿病を診断すること。
【構成】犬の体液中の１，５−アンヒドログルシトール
量を測定することにより、犬の糖尿病の診断を行なう。
量を測定することにより、犬の糖尿病の診断を行なう。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、犬の糖尿病を診断する
方法に関する。さらに詳しくは、犬の体液中の１，５−
アンヒドログルシトール（以下１，５ＡＧという）濃度
を測定する方法及びこの方法により犬の糖尿病を診断す
る方法及びキットに関する。
方法に関する。さらに詳しくは、犬の体液中の１，５−
アンヒドログルシトール（以下１，５ＡＧという）濃度
を測定する方法及びこの方法により犬の糖尿病を診断す
る方法及びキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】糖尿病の診断法は、ヒトで最もよく研究
されており、血糖及び尿糖の測定成分であるグルコー
ス、赤血球中ヘモグロビンへの糖付加の程度を測定する
糖化ヘモグロビン、血清蛋白質への糖付加の程度を測定
するフルクトサミン、血清中のアルブミンへの糖付加の
程度を測定する糖化アルブミン、血漿または血清中の
１，５ＡＧが用いられている。
されており、血糖及び尿糖の測定成分であるグルコー
ス、赤血球中ヘモグロビンへの糖付加の程度を測定する
糖化ヘモグロビン、血清蛋白質への糖付加の程度を測定
するフルクトサミン、血清中のアルブミンへの糖付加の
程度を測定する糖化アルブミン、血漿または血清中の
１，５ＡＧが用いられている。
【０００３】糖尿病患者の血糖値の新しいマーカーとし
て注目されている１，５ＡＧは、グルコースの１位のＯ
Ｈ基が還元された構造の環状ポリオールであり、健常な
人の血中に存在する糖類の中では、グルコースに次いで
多く存在している。健常人では、１，５ＡＧは腎で効率
よく再吸収され、体内に蓄積される。しかし、糖尿病患
者においては、血糖値の上昇により尿糖が出現するよう
になると、１，５ＡＧはグルコースの再吸収と競合し合
い、尿中へ排泄されるようになると考えられており、
１，５ＡＧの血中濃度は著しく低下する。この低下量が
著しいことから、糖尿病患者のスクリーニングや治療効
果のモニタリングに有用であることが認められている
（帝京医学雑誌16(3) 205 〜213(1993) 、その他多数の
文献有り）。
て注目されている１，５ＡＧは、グルコースの１位のＯ
Ｈ基が還元された構造の環状ポリオールであり、健常な
人の血中に存在する糖類の中では、グルコースに次いで
多く存在している。健常人では、１，５ＡＧは腎で効率
よく再吸収され、体内に蓄積される。しかし、糖尿病患
者においては、血糖値の上昇により尿糖が出現するよう
になると、１，５ＡＧはグルコースの再吸収と競合し合
い、尿中へ排泄されるようになると考えられており、
１，５ＡＧの血中濃度は著しく低下する。この低下量が
著しいことから、糖尿病患者のスクリーニングや治療効
果のモニタリングに有用であることが認められている
（帝京医学雑誌16(3) 205 〜213(1993) 、その他多数の
文献有り）。
【０００４】ペットの糖尿病の診断方法においては、従
来から、血糖値及び尿糖値を用いるヒトでの診断法をそ
のまま準用しており、ペットでの基準値（カットオフ
値）を越える上昇によって判断している。糖化ヘモグロ
ビン、フルクトサミン、糖化アルブミンなどの糖化蛋白
の指標は、いずれもヒトと動物で物質（蛋白質）が異な
るため、測定法の開発や基準値の設定などを新たに再検
討する必要があり、そのままでペットへの準用が困難な
状況にある。
来から、血糖値及び尿糖値を用いるヒトでの診断法をそ
のまま準用しており、ペットでの基準値（カットオフ
値）を越える上昇によって判断している。糖化ヘモグロ
ビン、フルクトサミン、糖化アルブミンなどの糖化蛋白
の指標は、いずれもヒトと動物で物質（蛋白質）が異な
るため、測定法の開発や基準値の設定などを新たに再検
討する必要があり、そのままでペットへの準用が困難な
状況にある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】近年、ぺットフードの
改良および治療薬の進歩にともない、飛躍的にペットの
寿命が延びた。また、最近のペットフードは、優れた品
質であるがため、ペットが摂取しすぎる傾向にあり、運
動不足とあいまって肥満体質となっている。この高齢化
と肥満体質傾向から、ペットにおいても糖尿病の増加が
問題になっている。 ペットの糖尿病の診断方法は、ヒ
トと同様であり、血糖値および尿糖値によって判断して
いる。しかし、ペットの場合、絶食時間の調整、摂餌後
の経時的な採血、および尿採取の困難さなどの問題があ
った。また、治療開始後の治療効果の判断においても、
同様な問題があった。
改良および治療薬の進歩にともない、飛躍的にペットの
寿命が延びた。また、最近のペットフードは、優れた品
質であるがため、ペットが摂取しすぎる傾向にあり、運
動不足とあいまって肥満体質となっている。この高齢化
と肥満体質傾向から、ペットにおいても糖尿病の増加が
問題になっている。 ペットの糖尿病の診断方法は、ヒ
トと同様であり、血糖値および尿糖値によって判断して
いる。しかし、ペットの場合、絶食時間の調整、摂餌後
の経時的な採血、および尿採取の困難さなどの問題があ
った。また、治療開始後の治療効果の判断においても、
同様な問題があった。
【０００６】一方、ヒト以外の動物の体液中の１，５Ａ
Ｇ値については、これまで、ラットやマウスなどの実験
動物（齧歯類）での報告しかない。ラットやマウスにお
いては、ヒトの場合と同様に、糖尿病の発症で体液中の
１，５ＡＧ値が著しく低下すると報告されている。（糖
尿病動物2 271 〜280(1988) ）が、本発明者等の検討に
よれば同じ齧歯類であるウサギにおいては、正常なウサ
ギにおいても、血中に１，５ＡＧがほとんど検出され
ず、更に猫においても、血中に１，５ＡＧが殆ど検出さ
れない。このように、動物の種差により、１，５ＡＧの
存在量に差がある。
Ｇ値については、これまで、ラットやマウスなどの実験
動物（齧歯類）での報告しかない。ラットやマウスにお
いては、ヒトの場合と同様に、糖尿病の発症で体液中の
１，５ＡＧ値が著しく低下すると報告されている。（糖
尿病動物2 271 〜280(1988) ）が、本発明者等の検討に
よれば同じ齧歯類であるウサギにおいては、正常なウサ
ギにおいても、血中に１，５ＡＧがほとんど検出され
ず、更に猫においても、血中に１，５ＡＧが殆ど検出さ
れない。このように、動物の種差により、１，５ＡＧの
存在量に差がある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、犬の糖尿
病の診断法について鋭意研究を重ねた結果、犬において
は、正常な犬の体液中に１，５ＡＧが比較的多く存在
し、犬の場合も糖尿病の発症により体液中の１，５ＡＧ
値が低下し、糖尿病の診断に利用できることを見いだ
し、本発明を完成した。
病の診断法について鋭意研究を重ねた結果、犬において
は、正常な犬の体液中に１，５ＡＧが比較的多く存在
し、犬の場合も糖尿病の発症により体液中の１，５ＡＧ
値が低下し、糖尿病の診断に利用できることを見いだ
し、本発明を完成した。
【０００８】即ち、本発明は、（１）犬の体液中の１，
５ＡＧ量を測定することを特徴とする犬の糖尿病の診断
法、（２）犬の体液中の１，５ＡＧ量を、１，５ＡＧ酸
化酵素を用いて測定する上記（１）記載の診断法、
（３）１，５ＡＧ酸化酵素がピラノースオキシダーゼ又
はＬ−ソルボースオキシダーゼである上記（２）記載の
診断法、（４）体液が全血、血漿又は血清である上記
（１）、（２）又は（３）記載の診断法、（５）犬の体
液中の１，５ＡＧ量の測定値が３ｍｇ／ｌ以下である場
合を糖尿病と診断する上記（４）記載の診断法、（６）
犬の体液中の１，５ＡＧ量を１，５ＡＧ酸化酵素を用い
て測定することを特徴とする１，５ＡＧの定量法、
（７）１，５ＡＧ酸化酵素がピラノースオキシダーゼ又
はＬ−ソルボースオキシダーゼである上記（６）記載の
定量法、（８）体液が全血、血漿又は血清である上記
（６）又は（７）記載の定量法、（９）糖類除去剤、
１，５ＡＧ酸化酵素及び１，５ＡＧ酸化酵素による酸化
反応で生じる電子受容体の還元体の検出試薬からなる、
犬の体液中の１，５ＡＧ量測定用キット、に関する。
５ＡＧ量を測定することを特徴とする犬の糖尿病の診断
法、（２）犬の体液中の１，５ＡＧ量を、１，５ＡＧ酸
化酵素を用いて測定する上記（１）記載の診断法、
（３）１，５ＡＧ酸化酵素がピラノースオキシダーゼ又
はＬ−ソルボースオキシダーゼである上記（２）記載の
診断法、（４）体液が全血、血漿又は血清である上記
（１）、（２）又は（３）記載の診断法、（５）犬の体
液中の１，５ＡＧ量の測定値が３ｍｇ／ｌ以下である場
合を糖尿病と診断する上記（４）記載の診断法、（６）
犬の体液中の１，５ＡＧ量を１，５ＡＧ酸化酵素を用い
て測定することを特徴とする１，５ＡＧの定量法、
（７）１，５ＡＧ酸化酵素がピラノースオキシダーゼ又
はＬ−ソルボースオキシダーゼである上記（６）記載の
定量法、（８）体液が全血、血漿又は血清である上記
（６）又は（７）記載の定量法、（９）糖類除去剤、
１，５ＡＧ酸化酵素及び１，５ＡＧ酸化酵素による酸化
反応で生じる電子受容体の還元体の検出試薬からなる、
犬の体液中の１，５ＡＧ量測定用キット、に関する。
【０００９】犬の体液としては、１，５ＡＧを用いる糖
尿病の診断に適切なものであればいずれでもよく、全
血、血漿、血清、髄液、尿などが利用できる。１，５Ａ
Ｇの定量法としては、臨床的に糖尿病の診断ができる精
度のものであればいずれでもよく、これまでガスクロマ
トグラフィー法（Clinical Chemistry28 1283-1286(198
2),Scand, J. Clin Lab. Invest. 42 445-448(1982),Di
abetes36 709-715(1987)、液体クロマトグラフィー法
(J. Biochem. 90 157-62(1981),Biomed. Chromatogr. 6
63-66(1992), Biomed. Chromatogr. 7 41-44(1993),B
r.J. Biomed. Sci.51 18-23(1994),Anal. Chim. Acta 2
71 47-51(1993) 、ガスクロマトグラフィー・マススペ
クトロメトリィー法（J. Biochem. 102 1599-1607 (198
7)）、液体クロマトグラフィー法・マススペクトロメト
リィー法（J. Chrom.613 9-14(1993), Clinical Chemis
try 40 260-264(1994)、酵素法（ClinicalChemistry 35
2039-2043 (1989) などの報告があり、いずれの方法に
よっても行なうことができるが、酵素法による定量法が
精度の点及び簡便さの点から最も好ましい。
尿病の診断に適切なものであればいずれでもよく、全
血、血漿、血清、髄液、尿などが利用できる。１，５Ａ
Ｇの定量法としては、臨床的に糖尿病の診断ができる精
度のものであればいずれでもよく、これまでガスクロマ
トグラフィー法（Clinical Chemistry28 1283-1286(198
2),Scand, J. Clin Lab. Invest. 42 445-448(1982),Di
abetes36 709-715(1987)、液体クロマトグラフィー法
(J. Biochem. 90 157-62(1981),Biomed. Chromatogr. 6
63-66(1992), Biomed. Chromatogr. 7 41-44(1993),B
r.J. Biomed. Sci.51 18-23(1994),Anal. Chim. Acta 2
71 47-51(1993) 、ガスクロマトグラフィー・マススペ
クトロメトリィー法（J. Biochem. 102 1599-1607 (198
7)）、液体クロマトグラフィー法・マススペクトロメト
リィー法（J. Chrom.613 9-14(1993), Clinical Chemis
try 40 260-264(1994)、酵素法（ClinicalChemistry 35
2039-2043 (1989) などの報告があり、いずれの方法に
よっても行なうことができるが、酵素法による定量法が
精度の点及び簡便さの点から最も好ましい。
【００１０】以下に、酵素法を例に挙げて１，５ＡＧの
定量法について詳細に説明する。酵素法は特に限定され
ず、公知の酵素法を採用できる。使用する酵素として
は、１，５ＡＧ酸化酵素が好ましいがこれに限定されな
い。１，５ＡＧ酸化酵素としては、ピラノースオキシダ
ーゼ（ＥＣ 1.1.3.10)やＬ−ソルボースオキシダーゼ
（ＥＣ 1.1.3.11)等が挙げられるがこれらに限定されな
い。
定量法について詳細に説明する。酵素法は特に限定され
ず、公知の酵素法を採用できる。使用する酵素として
は、１，５ＡＧ酸化酵素が好ましいがこれに限定されな
い。１，５ＡＧ酸化酵素としては、ピラノースオキシダ
ーゼ（ＥＣ 1.1.3.10)やＬ−ソルボースオキシダーゼ
（ＥＣ 1.1.3.11)等が挙げられるがこれらに限定されな
い。
【００１２】犬の体液は、必要により蛋白質を除去した
後、グルコース等の糖類を除去又は消去（以下単に「除
去」という）する。蛋白質を除去する方法としては、公
知の方法が採用でき、例えば、塩基性陰イオン交換樹脂
を充填したカラムに体液を通す方法、体液に蛋白質不溶
化剤を添加して蛋白質を油状沈殿物として沈降させて除
去する方法、蛋白質沈殿剤及び蛋白質変性剤を体液に添
加して蛋白質を水不溶化物として析出させ、この析出物
を塩基性陰イオン交換樹脂で除去する方法等が採用でき
る。
後、グルコース等の糖類を除去又は消去（以下単に「除
去」という）する。蛋白質を除去する方法としては、公
知の方法が採用でき、例えば、塩基性陰イオン交換樹脂
を充填したカラムに体液を通す方法、体液に蛋白質不溶
化剤を添加して蛋白質を油状沈殿物として沈降させて除
去する方法、蛋白質沈殿剤及び蛋白質変性剤を体液に添
加して蛋白質を水不溶化物として析出させ、この析出物
を塩基性陰イオン交換樹脂で除去する方法等が採用でき
る。
【００１３】グルコース等の糖類を除去する方法として
は、公知の方法が採用でき、例えば、体液を強塩基性陰
イオン交換樹脂で処理する方法、ホウ酸自体で又はホウ
酸を結合させた樹脂で体液を処理する方法、グルコース
をグルコキナーゼあるいはヘキソキナーゼ等の酵素を用
いてグルコース６りん酸に変える方法等が挙げられ、い
ずれの方法も採用できる。
は、公知の方法が採用でき、例えば、体液を強塩基性陰
イオン交換樹脂で処理する方法、ホウ酸自体で又はホウ
酸を結合させた樹脂で体液を処理する方法、グルコース
をグルコキナーゼあるいはヘキソキナーゼ等の酵素を用
いてグルコース６りん酸に変える方法等が挙げられ、い
ずれの方法も採用できる。
【００１４】糖類を除去した後に、体液中の１，５ＡＧ
量を測定する。即ち、糖類を除去した体液をピラノース
オキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ等の酵素と
接触させ、酸素等の電子受容体の存在下、好ましくは１
〜５０℃、より好ましくは４〜４０℃で反応させる。反
応時間は好ましくは３０秒〜３時間、より好ましくは１
分〜１時間である。次いで、生成する過酸化水素量等の
電子受容体の還元体量を測定し、別に作成した検量線か
ら１，５ＡＧ量を求める。酵素は溶液反応の場合は通常
０．５〜５００Ｕ／ｍＬ好ましくは１〜１００Ｕ／ｍＬ
使用する。又、酵素を固定して用いる場合、酵素の固定
化量が２〜５００ｍｇ／ｇの酵素固定化樹脂を、０．１
〜２０００μｌ用いるのが好ましい。
量を測定する。即ち、糖類を除去した体液をピラノース
オキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ等の酵素と
接触させ、酸素等の電子受容体の存在下、好ましくは１
〜５０℃、より好ましくは４〜４０℃で反応させる。反
応時間は好ましくは３０秒〜３時間、より好ましくは１
分〜１時間である。次いで、生成する過酸化水素量等の
電子受容体の還元体量を測定し、別に作成した検量線か
ら１，５ＡＧ量を求める。酵素は溶液反応の場合は通常
０．５〜５００Ｕ／ｍＬ好ましくは１〜１００Ｕ／ｍＬ
使用する。又、酵素を固定して用いる場合、酵素の固定
化量が２〜５００ｍｇ／ｇの酵素固定化樹脂を、０．１
〜２０００μｌ用いるのが好ましい。
【００１５】電子受容体としては、１，５ＡＧの脱水素
による酸化反応に関与するものであれば、特に制限な
く、例えば、酸素、フエナジンメトサルフエート、ジク
ロルフエノールインドフエノール、フエリシアン化カリ
ウム、フエリシアン化ナトリウムなどのフエリシアン化
化合物、チトクロムＣ、ＮＡＤ+ 、ＮＡＤＰ+ 、ＦＭＮ
などの補酵素などがあげられる。
による酸化反応に関与するものであれば、特に制限な
く、例えば、酸素、フエナジンメトサルフエート、ジク
ロルフエノールインドフエノール、フエリシアン化カリ
ウム、フエリシアン化ナトリウムなどのフエリシアン化
化合物、チトクロムＣ、ＮＡＤ+ 、ＮＡＤＰ+ 、ＦＭＮ
などの補酵素などがあげられる。
【００１６】電子受容体の還元体量の測定法について具
体例を示すと次のとおりである。例えば、電子受容体の
還元体が過酸化水素の場合、過酸化水素を検出する方法
としては、高感度に検出できる方法であればいずれであ
っても良く、数多くの方法が利用できる。これらのうち
で最も一般的に用いられている方法は、ホースラディッ
シュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を触媒酵素として、各
種のＨＲＰ基質を過酸化水素で酸化するものであり、酸
化反応の結果生成した色素、ケイ光物質や化学発火をそ
れぞれ吸光度測定、ケイ光測定及び発光測定すればよ
い。
体例を示すと次のとおりである。例えば、電子受容体の
還元体が過酸化水素の場合、過酸化水素を検出する方法
としては、高感度に検出できる方法であればいずれであ
っても良く、数多くの方法が利用できる。これらのうち
で最も一般的に用いられている方法は、ホースラディッ
シュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を触媒酵素として、各
種のＨＲＰ基質を過酸化水素で酸化するものであり、酸
化反応の結果生成した色素、ケイ光物質や化学発火をそ
れぞれ吸光度測定、ケイ光測定及び発光測定すればよ
い。
【００１７】色素を生成するＨＲＰの基質としては２，
２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン
（ＯＰＤ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、３，
３′，５，５′ーテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′
−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウ
ム塩（ＤＡ−６４）、４−アミノアンチピリンとフェノ
ール類、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイ
ジンあるいはＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−トルイジン等の組合せによるい
わゆるトリンダー系発色剤などがある。ケイ光物質を生
成するＨＲＰの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル
酢酸、３−（ｐ−ヒドロキシフエニル）プロピオン酸
（ＨＰＰＡ）などがある。また、化学発光するＨＲＰの
基質としては、ルミノール、イソルミノールなどが知ら
れている。
２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン
（ＯＰＤ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、３，
３′，５，５′ーテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′
−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウ
ム塩（ＤＡ−６４）、４−アミノアンチピリンとフェノ
ール類、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイ
ジンあるいはＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−トルイジン等の組合せによるい
わゆるトリンダー系発色剤などがある。ケイ光物質を生
成するＨＲＰの基質としては、ｐ−ヒドロキシフェニル
酢酸、３−（ｐ−ヒドロキシフエニル）プロピオン酸
（ＨＰＰＡ）などがある。また、化学発光するＨＲＰの
基質としては、ルミノール、イソルミノールなどが知ら
れている。
【００１８】ＨＲＰなしに化学発光で検出する方法もい
くつか知られている。たとえば、フェリシアンイオン存
在下に過酸化水素でルミノールを発光させる方法、金属
イオン存在下に過酸化水素でルシゲニンを発光させる方
法、ビス（２，４，６−トリクロルフェニル）オギザレ
ートの様なアリルシュウ酸エステル類の化合物をケイ光
物質存在下に過酸化水素と反応させ、シュウ酸エステル
の分解エネルギーでケイ光物質を励起させ発光させる方
法などが知られている。さらに過酸化水素を直接検出す
る方法として、過酸化水素電極を用いてもよい。このよ
うにして、犬の体液中の１，５ＡＧ量を測定することが
できる。
くつか知られている。たとえば、フェリシアンイオン存
在下に過酸化水素でルミノールを発光させる方法、金属
イオン存在下に過酸化水素でルシゲニンを発光させる方
法、ビス（２，４，６−トリクロルフェニル）オギザレ
ートの様なアリルシュウ酸エステル類の化合物をケイ光
物質存在下に過酸化水素と反応させ、シュウ酸エステル
の分解エネルギーでケイ光物質を励起させ発光させる方
法などが知られている。さらに過酸化水素を直接検出す
る方法として、過酸化水素電極を用いてもよい。このよ
うにして、犬の体液中の１，５ＡＧ量を測定することが
できる。
【００１９】正常な犬の場合、その体液中に１，５ＡＧ
が比較的多く存在するが、糖尿病の発症により、犬の体
液中の１，５ＡＧ量は低下する。従って、犬の体液中の
１，５ＡＧ値を上記の方法等により求めることにより犬
の糖尿病の診断を行なうことができる。例えば、後記実
施例に示したように、正常犬の血清中の１，５ＡＧ値は
４ｍｇ／ｌ以上であり、一方、糖尿病犬の血清中の１，
５ＡＧ値は３ｍｇ／ｌ以下であるので、測定した犬の血
清中の１，５ＡＧ値を求め、得られた値と上記の値を比
較することにより、犬の糖尿病の診断を行なうことがで
きる。
が比較的多く存在するが、糖尿病の発症により、犬の体
液中の１，５ＡＧ量は低下する。従って、犬の体液中の
１，５ＡＧ値を上記の方法等により求めることにより犬
の糖尿病の診断を行なうことができる。例えば、後記実
施例に示したように、正常犬の血清中の１，５ＡＧ値は
４ｍｇ／ｌ以上であり、一方、糖尿病犬の血清中の１，
５ＡＧ値は３ｍｇ／ｌ以下であるので、測定した犬の血
清中の１，５ＡＧ値を求め、得られた値と上記の値を比
較することにより、犬の糖尿病の診断を行なうことがで
きる。
【００２０】なお、正常犬と糖尿病犬の各種体液中の
１，５ＡＧ値は、正常とわかっている複数の犬と糖尿病
とわかっている複数の犬のそれぞれについて体液を採取
し、それらの体液中の１，５ＡＧ値を測定することによ
り知ることができるので、これらの値からカットオフ値
を設定し、診断対象犬の体液の１，５ＡＧ値がカットオ
フ値以上か以下かにより、犬の糖尿病の診断を行なう。
１，５ＡＧ値は、正常とわかっている複数の犬と糖尿病
とわかっている複数の犬のそれぞれについて体液を採取
し、それらの体液中の１，５ＡＧ値を測定することによ
り知ることができるので、これらの値からカットオフ値
を設定し、診断対象犬の体液の１，５ＡＧ値がカットオ
フ値以上か以下かにより、犬の糖尿病の診断を行なう。
【００２１】本発明のキットにおいて、１，５ＡＧ酸化
酵素と検出試薬は全てを混合して単一の試薬としてもよ
く、相互に干渉する成分が存在する場合には、各成分を
適宜な組合せとなるように分割してもよく、又、各成分
全てを別々としてもよい。本発明のキットは、上記組合
せの他、蛋白質を除去するための蛋白質不溶化剤又は蛋
白質沈殿剤と蛋白質変性剤やイオン交換樹脂あるいは
１，５ＡＧの一定量を含有する標準試薬などを添付して
もよい。
酵素と検出試薬は全てを混合して単一の試薬としてもよ
く、相互に干渉する成分が存在する場合には、各成分を
適宜な組合せとなるように分割してもよく、又、各成分
全てを別々としてもよい。本発明のキットは、上記組合
せの他、蛋白質を除去するための蛋白質不溶化剤又は蛋
白質沈殿剤と蛋白質変性剤やイオン交換樹脂あるいは
１，５ＡＧの一定量を含有する標準試薬などを添付して
もよい。
【００２２】本発明によれば、犬の糖尿病の診断を正確
に且つ簡便に行なうことができる。
に且つ簡便に行なうことができる。
【００２３】
【実施例】実施例によって本発明を具体的に説明する
が、本発明がこれら実施例のみによって限定されるもの
ではない。
が、本発明がこれら実施例のみによって限定されるもの
ではない。
【００２４】実施例１（犬の体液の１，５ＡＧ値の測
定） 正常犬および糖尿病犬の前腕ぎょう側皮静脈から採血
し、ヘパリン添加採血管と添加剤無しのプレーンの採血
管に分注後、それぞれの採血管を遠心分離して血漿と血
清を得た。血清中の１，５ＡＧ値の測定は、東ソー
（株）社製の１，５ＡＧ専用測定機「ＨＬＣ−７２７Ａ
Ｇ」で測定した。
定） 正常犬および糖尿病犬の前腕ぎょう側皮静脈から採血
し、ヘパリン添加採血管と添加剤無しのプレーンの採血
管に分注後、それぞれの採血管を遠心分離して血漿と血
清を得た。血清中の１，５ＡＧ値の測定は、東ソー
（株）社製の１，５ＡＧ専用測定機「ＨＬＣ−７２７Ａ
Ｇ」で測定した。
【００２５】この装置による１，５ＡＧ測定の原理は、
フローインジェクション分析法の技術を応用し，１，５
ＡＧの酸化に樹脂に固定化したピラノースオキシダーゼ
（以下ＰＲＯＤと略す）を用い、１，５ＡＧの２位の水
酸基の酸化反応により発生した過酸化水素を、樹脂に固
定化したペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略す）を用い
て比色法で検出するものである。ＰＲＯＤはグルコース
とも反応するため、あらかじめ検体をクリーンアップカ
ラム「ＴＳＫｇｅｌ １，５ＡＧ パック」に通してグ
ルコースなどの測定を妨害する成分を吸着除去し、吸着
されずに通過してきた１，５ＡＧをＰＲＯＤ固定化樹脂
とＨＲＰ固定化樹脂を充填した酵素リアクター「１，５
ＡＧ リアクタ」に通すことにより連続的に測定できる
ようにしたものである。
フローインジェクション分析法の技術を応用し，１，５
ＡＧの酸化に樹脂に固定化したピラノースオキシダーゼ
（以下ＰＲＯＤと略す）を用い、１，５ＡＧの２位の水
酸基の酸化反応により発生した過酸化水素を、樹脂に固
定化したペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略す）を用い
て比色法で検出するものである。ＰＲＯＤはグルコース
とも反応するため、あらかじめ検体をクリーンアップカ
ラム「ＴＳＫｇｅｌ １，５ＡＧ パック」に通してグ
ルコースなどの測定を妨害する成分を吸着除去し、吸着
されずに通過してきた１，５ＡＧをＰＲＯＤ固定化樹脂
とＨＲＰ固定化樹脂を充填した酵素リアクター「１，５
ＡＧ リアクタ」に通すことにより連続的に測定できる
ようにしたものである。
【００２６】以下に具体的に説明する。５ｍｍｏｌ／ｌ
濃度のホウ酸からなる溶離液を、クリーンアップカラム
に流速１ｍｌ／分で通液した。クリーンアップカラム
（ＡＧ−トヨパール樹脂のホウ酸形を内経６ｍｍ長さ６
０ｍｍのポリアセタール製カラムに充填したもの）の上
流に設置されたサンプルインジェクターより犬の血清検
体１μｌを注入し、タンパク質やグルコースなどの夾雑
物質を吸着除去し、吸着されずに通過して来た１，５Ａ
Ｇを含む流出液に、７．５μｍｏｌ／ＬのＤＡ−６４と
０．０４ｗ／ｖ％のトリトンＸ−１００を含むトリス緩
衝液（ｐＨ７．５）からなる１ｍｌ／分の流速の発色液
を混合した。
濃度のホウ酸からなる溶離液を、クリーンアップカラム
に流速１ｍｌ／分で通液した。クリーンアップカラム
（ＡＧ−トヨパール樹脂のホウ酸形を内経６ｍｍ長さ６
０ｍｍのポリアセタール製カラムに充填したもの）の上
流に設置されたサンプルインジェクターより犬の血清検
体１μｌを注入し、タンパク質やグルコースなどの夾雑
物質を吸着除去し、吸着されずに通過して来た１，５Ａ
Ｇを含む流出液に、７．５μｍｏｌ／ＬのＤＡ−６４と
０．０４ｗ／ｖ％のトリトンＸ−１００を含むトリス緩
衝液（ｐＨ７．５）からなる１ｍｌ／分の流速の発色液
を混合した。
【００２７】この混合液を酵素リアクター〔ＰＲＯＤ固
定化樹脂を上流に、ＨＲＰ固定化樹脂を下流に充填した
ミニカラム。ＰＲＯＤの固定化量１８０ｍｇ／ｇのＰＲ
ＯＤ固定化樹脂をポリアセタール製カラムの上流部（内
径３ｍｍ、長さ３５ｍｍ）に充填し、フィルターをセッ
トして固定し、さらにＨＲＰの固定化量１５．８ｍｇ／
ｍｌのＨＲＰ固定化樹脂を同カラムの下流（内径２．５
ｍｍ、長さ２０ｍｍ）に充填し調製）に２５℃で通液
し、１，５ＡＧ濃度に依存した発色を得、この発色の強
さを検出器で検出した。あらかじめ、１，５ＡＧの標準
液を測定して作成した検量線を、マイクロコンピュータ
にメモリーしておき、犬血清検体に由来する１，５ＡＧ
のピーク面積から自動的に計算し、１，５ＡＧ濃度を表
示した。また、血糖値は、血漿を用い、（株）日立製作
所製の汎用型の生化学用自動分析装置「７１５０」で測
定した。これらの結果を、表１に示した。
定化樹脂を上流に、ＨＲＰ固定化樹脂を下流に充填した
ミニカラム。ＰＲＯＤの固定化量１８０ｍｇ／ｇのＰＲ
ＯＤ固定化樹脂をポリアセタール製カラムの上流部（内
径３ｍｍ、長さ３５ｍｍ）に充填し、フィルターをセッ
トして固定し、さらにＨＲＰの固定化量１５．８ｍｇ／
ｍｌのＨＲＰ固定化樹脂を同カラムの下流（内径２．５
ｍｍ、長さ２０ｍｍ）に充填し調製）に２５℃で通液
し、１，５ＡＧ濃度に依存した発色を得、この発色の強
さを検出器で検出した。あらかじめ、１，５ＡＧの標準
液を測定して作成した検量線を、マイクロコンピュータ
にメモリーしておき、犬血清検体に由来する１，５ＡＧ
のピーク面積から自動的に計算し、１，５ＡＧ濃度を表
示した。また、血糖値は、血漿を用い、（株）日立製作
所製の汎用型の生化学用自動分析装置「７１５０」で測
定した。これらの結果を、表１に示した。
【００２８】
【表１】
【００２９】実施例２（犬の糖尿病の診断） 実施例１で得られた正常犬５０匹と糖尿病犬５匹の血糖
値と１，５ＡＧ値の測定結果を比較した。正常犬での血
糖値は、雄で７５〜１１０ｍｇ／ｄｌ、雌が７５〜１０
７ｍｇ／ｄｌと言われており、今回測定した正常犬の血
糖値は、雄（No１〜25) 、雌（No 26 〜50) とも正常範
囲にあった。また、糖尿病犬の血糖値は１９６〜７５０
ｍｇ／ｄｌと、明らかに糖尿病型であった。一方、正常
犬の１，５ＡＧ値は、平均値および範囲とも糖尿病犬よ
り高値であり、完全に分離していた（表２）。したがっ
て、犬の糖尿病の診断に有用であることが判る。
値と１，５ＡＧ値の測定結果を比較した。正常犬での血
糖値は、雄で７５〜１１０ｍｇ／ｄｌ、雌が７５〜１０
７ｍｇ／ｄｌと言われており、今回測定した正常犬の血
糖値は、雄（No１〜25) 、雌（No 26 〜50) とも正常範
囲にあった。また、糖尿病犬の血糖値は１９６〜７５０
ｍｇ／ｄｌと、明らかに糖尿病型であった。一方、正常
犬の１，５ＡＧ値は、平均値および範囲とも糖尿病犬よ
り高値であり、完全に分離していた（表２）。したがっ
て、犬の糖尿病の診断に有用であることが判る。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、簡便な方法で精度よく
犬の糖尿病の診断を行なうことができる。
犬の糖尿病の診断を行なうことができる。
Claims (9)
- 【請求項１】犬の体液中の１，５−アンヒドログルシト
ール量を測定することを特徴とする犬の糖尿病の診断
法。 - 【請求項２】犬の体液中の１，５−アンヒドログルシト
ール量を、１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素を
用いて測定する、請求項１記載の診断法。 - 【請求項３】１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素
がピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダ
ーゼである請求項２記載の診断法。 - 【請求項４】体液が全血、血漿又は血清である請求項
１、２又は３記載の診断法。 - 【請求項５】犬の体液中の１，５−アンヒドログルシト
ール量の測定値が３ｍｇ／ｌ以下である場合を糖尿病と
診断する請求項４記載の診断法。 - 【請求項６】犬の体液中の１，５−アンヒドログルシー
ト量を１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素を用い
て測定することを特徴とする１，５−アンヒドログルシ
トールの定量法。 - 【請求項７】１，５−アンヒドログルシトール酸化酵素
がピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキシダ
ーゼである請求項６記載の定量法。 - 【請求項８】体液が全血、血漿又は血清である請求項６
又は７記載の定量法。 - 【請求項９】糖類除去剤、１，５−アンヒドログルシト
ール酸化酵素及び１，５−アンヒドログルシトール酸化
酵素による酸化反応で生じる電子受容体の還元体の検出
試薬からなる、犬の体液中の１，５−アンヒドログルシ
トール量測定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23255794A JPH0870893A (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | 犬の糖尿病診断法、１，５−アンヒドログルシトールの定量法及びキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23255794A JPH0870893A (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | 犬の糖尿病診断法、１，５−アンヒドログルシトールの定量法及びキット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0870893A true JPH0870893A (ja) | 1996-03-19 |
Family
ID=16941199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23255794A Pending JPH0870893A (ja) | 1994-09-02 | 1994-09-02 | 犬の糖尿病診断法、１，５−アンヒドログルシトールの定量法及びキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0870893A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008072702A1 (ja) | 2006-12-14 | 2008-06-19 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | 全血中の１，５－アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット |
| JP2009530626A (ja) * | 2006-03-24 | 2009-08-27 | メタノミクス ゲーエムベーハー | 糖尿病の診断手段および診断方法 |
| WO2010010881A1 (ja) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | 日本化薬株式会社 | 溶血させた全血を用いる血中成分の測定方法及びそのキット |
| WO2010067769A1 (ja) * | 2008-12-08 | 2010-06-17 | 日本化薬株式会社 | １，５－アンヒドログルシトールの電気化学的測定用バイオセンサ、それを用いた測定方法および測定用キット |
| US8753832B2 (en) | 2005-06-13 | 2014-06-17 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Method of assaying 1,5 anhydroglucitol by using whole blood and measurement kit |
-
1994
- 1994-09-02 JP JP23255794A patent/JPH0870893A/ja active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8753832B2 (en) | 2005-06-13 | 2014-06-17 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Method of assaying 1,5 anhydroglucitol by using whole blood and measurement kit |
| JP2009530626A (ja) * | 2006-03-24 | 2009-08-27 | メタノミクス ゲーエムベーハー | 糖尿病の診断手段および診断方法 |
| JPWO2008072702A1 (ja) * | 2006-12-14 | 2010-04-02 | 日本化薬株式会社 | 全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット |
| WO2008072702A1 (ja) | 2006-12-14 | 2008-06-19 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | 全血中の１，５－アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット |
| JP5166284B2 (ja) * | 2006-12-14 | 2013-03-21 | 日本化薬株式会社 | 全血中の１，５−アンヒドログルシトールの測定方法、それに用いるセンサーチップ及び測定キット |
| US8465940B2 (en) * | 2006-12-14 | 2013-06-18 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Method for electrochemically measuring 1,5-anhydroglucitol in whole blood |
| KR101470661B1 (ko) * | 2006-12-14 | 2014-12-09 | 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤 | 전혈 중의 1, 5-안하이드로글루시톨의 측정 방법과 그 방법에서 사용하는 센서 칩 및 측정 키트 |
| WO2010010881A1 (ja) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | 日本化薬株式会社 | 溶血させた全血を用いる血中成分の測定方法及びそのキット |
| US8883439B2 (en) | 2008-07-23 | 2014-11-11 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Blood component measurement method utilizing hemolyzed whole blood, and kit for the method |
| JP5646323B2 (ja) * | 2008-07-23 | 2014-12-24 | 日本化薬株式会社 | 溶血させた全血を用いる血中成分の測定方法及びそのキット |
| WO2010067769A1 (ja) * | 2008-12-08 | 2010-06-17 | 日本化薬株式会社 | １，５－アンヒドログルシトールの電気化学的測定用バイオセンサ、それを用いた測定方法および測定用キット |
| JP5234675B2 (ja) * | 2008-12-08 | 2013-07-10 | 日本化薬株式会社 | １，５−アンヒドログルシトールの電気化学的測定用バイオセンサ、それを用いた測定方法および測定用キット |
| US8658012B2 (en) | 2008-12-08 | 2014-02-25 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Biosensor for electrochemical measurement of 1,5-anhydroglucitol, and measuring method and measuring kit using the same |
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