JP2665249B2 - 検体中のカルボン酸を検出する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は，一般に，検体中に存在するカルボン酸の検
出に関する。さらに詳しくは，宿主の腸内寄生蠕虫によ
って生産された遊離脂肪酸（FFA）代謝産物を検出する
触媒的方法に関する。 背景技術 腸内寄生蠕虫の代謝について研究している研究者は多
い。Soprunov,F.F.らは，Acta Tropica 38:449−460
（1981）において，Ascaris lumbricoidesの代謝最終生
成物の特徴付けを行った。Y.Uenoも，J.Biochem．48
（２）:161−168（1960）において，Ascaris生物の代謝
を研究した。これらの研究は，本発明の発明者らによっ
て実施されたその後の研究と同様に，腸内寄生蠕虫が極
めて異常な代謝経路を用いており，この結果宿主の腸へ
多量の遊離脂肪酸を排出していることを示した。 従って，腸内寄生蠕虫は，それらの宿主とは代謝的に
非常に有意に異なる。寄生蠕虫は非常に嫌気的な環境に
存在し，エネルギー源としては，ほとんど完全に嫌気的
糖分解に頼っている。本発明の発明者らは，寄生生物が
脂質かアミノ酸をエネルギーとして用いているという証
拠は見出していない。すなわち，寄生蠕虫およびそれら
の宿主は，第１図に示されているように，重要な代謝分
岐点に達した後で，糖分解能力において異なっている。
宿主は，ホスホエノールピルビン酸（PEP）を，トリカ
ルボン酸回路および電子伝達鎖を経て，ピルビン酸，二
酸化炭素および水に変換するのに対し，寄生蠕虫は酸素
利用度が限定されているので，これらのうち後者の２つ
の経路を用いることができない。その代わり，寄生蠕虫
は，フマル酸，コハク酸，酢酸，およびプロピオン酸を
含む，多量の遊離脂肪酸を排出する。 これらの代謝産物に加えて，多くの寄生蠕虫は，酢酸
およびプロピオン酸を結合させて,4個,5個，または６個
の炭素原子を有するFFA生成物を形成する。生じた炭素
鎖は，直鎖状または分枝状であり得る。典型的には,n−
酪酸,i−酪酸，吉草酸,2−メチル酪酸，カプロン酸,2−
メチルバレリアン酸,2−メチルカプロン酸，チグリン
酸，および３−メチル酪酸が含まれる。これらの酸のい
くつかは，宿主によって吸収され，かつ代謝される。他
方，尿および便中に排出されるものもある。５個または
６個の炭素原子を有する直鎖状および分枝状の遊離脂肪
酸は，脊椎動物によっては合成されず，寄生蠕虫が体内
に侵入した場合にのみ，血清，尿，唾液，または便の試
料中に見られる。従って，寄生蠕虫の体内侵入と密接な
相関がある，これらの５個または６個の炭素原子を有す
る遊離脂肪酸の排出に基づく診断検査法を開発すること
が非常に望ましい。 しかしながら，現在まで，これらの代謝産物の存在に
基づき，寄生蠕虫の体内侵入を，簡便に現場で検出する
方法は，まだ開発されていない。従って，本発明は，線
虫類（例えば，回虫，鉤虫，および鞭虫）および条虫類
（例えば，サナダムシ）を含む主な腸内寄生蠕虫による
体内侵入を，対応する最終生成物である５個または６個
の炭素原子を有するFFA代謝産物を検出することによっ
て調べる方法を目的とする。この方法はまた，他のカル
ボン酸を検出するのにも有用である。 ある好ましい実施態様では，本発明の方法は,5個また
は６個の炭素原子を有するFFA代謝産物およびコハク酸
に対して特異なものである。該方法は，以下のような多
くの利点を与える；（１）５個または６個の炭素原子を
有するFFA産物およびコハク酸に対して特異的であるこ
と；（２）使用される試薬が物理的および化学的に安定
であること，（３）少量の試料が使用でき，かつ偽陽性
が実質的に排除されるような高い感度および特異性を有
すること；そして（４）約0.05mMと10mMとの間の濃度，
すなわち寄生蠕虫が侵入した哺乳動物の血清，便，尿，
および唾液検体において見られうる感度で,FFAを検出し
得ること。 発明の開示 本発明のある局面は，検体中に存在するカルボン酸を
検出する方法であって，該方法は，以下の工程を包含す
る：（ａ）検体を，カルボン酸と反応性がある金属塩と
接触させて，金属−カルボン酸錯体を形成させること；
および（ｂ）このような錯体の触媒活性をモニターする
ことによって，形成される金属−カルボン酸錯体の存在
を検出すること。 本発明の他の局面では，上記の方法は，ある腸内寄生
蠕虫代謝産物の存在を検出することによって，腸内寄生
蠕虫の体内侵入を検出するために使用される。検出され
る代謝産物は遊離脂肪酸であり，これらの遊離脂肪酸は
腸内寄生蠕虫によって生産されるが，脊椎動物によって
は生産されない。従って，これらの遊離脂肪酸は，体内
侵入がある場合にのみ，血清，便，尿，および唾液検体
中に見られる。これらの遊離脂肪酸には，コハク酸だけ
でなく,5個または６個の炭素原子を有する分枝状および
非分枝状の酸が含まれる。検体と接触する顕色系は，こ
れらの特定の酸から形成される金属−脂肪酸錯体がその
中で単離され，かつ存在しうる他の脂肪酸とは無関係に
検出されるように選択された有機溶媒を含む。 本発明のさらに他の局面では，固相診断法が提供され
る。該診断法では，（ａ）血清，便，尿，または唾液試
料が塗布されている固体支持体（例えば，フィルターペ
ーパーなど）を用意し，そして（ｂ）該支持体上の検体
を，上記のように金属−カルボン酸錯体が形成されかつ
比色定量的に検出されるように，顕色系と接触させる。
金属塩は，固体支持体上かあるいは顕色系の水相中に存
在する。 本発明のさらに他の局面では，カルボン酸を検出する
のに使用される顕色系が提供される。この系は，以下の
ものを含む：（ａ）カルボン酸と反応性があり，金属−
カルボン酸錯体を形成する金属塩；（ｂ）選択された金
属−カルボン酸錯体が実質的に可溶であり，かつ金属塩
が実質的に不溶である溶媒を含む有機相；（ｃ）色原
体；および（ｄ）金属−カルボン酸錯体の存在下で，該
色原体を有色化合物に酸化し得る酸化剤。該顕色系は，
さらに，金属塩がその上に存在する固体支持体，または
金属塩が実質的に溶解している水相を含んでいてもよ
い。色原体はまた，固体支持体上に存在していてもよ
く，あるいは有機溶媒中に溶解していてもよい。 図面の簡単な説明 第１図は，脊椎動物の糖代謝と，腸内寄生蠕虫の糖代
謝とを比較するヤローチャートである。列挙された寄生
蠕虫代謝産物は，さらに結合して，より長い鎖の遊離脂
肪酸を形成することもある。 本発明を実施するための様式 ここで用いられている「遊離脂肪酸」（FFA）には，
酸または塩の形の，寄生蠕虫の代謝におけるカルボン酸
最終生成物が含まれる。これらの最終生成物の例を表１
に示す。 ある好ましい実施態様では，本発明の方法によって検
出されるこれらのFFAの部分集合には，寄生蠕虫によっ
て生産されるが，脊椎動物によっては生産されず，従っ
て寄生蠕虫が，体内に侵入した場合にのみ検体中に存在
するような酸が含まれる。 本発明の方法によって検出し得る「カルボン酸」に
は，ここで使用される金属塩と金属−酸錯体を形成す
る，すべてのカルボン酸が含まれる。このように形成さ
れた金属−酸錯体は，選択された有機溶媒に実質的に可
溶であり，本発明の方法において触媒活性を有し，そし
て好ましくは固体支持体上で移動し得る。これらのカル
ボン酸はまた，（１）水溶液中に実質的に可溶であり，
（２）立体的な要件が金属−酸錯体形成の際に問題とな
らないような構造を有するのであり，（３）顕色系の他
の成分と実質的に反応性がなく，そして（４）本発明の
方法によって検出されるのに少なくとも充分な時間にわ
たって，化学的および物理的に比較的安定である。 「顕色系」は，カルボン酸が存在する場合に陽性の検
査結果を，そうでなければ陰性の検査結果を与えるよう
に，検体と反応するようなものである。陽性の検査結果
は，典型的には，肉眼で見える色の変化である。 「色原体」は，ある条件下で，有色物質を生成し得る
化合物である。通常，この化合物は還元状態で無色であ
り，適切な酸化剤で酸化すると，酸化状態で発色する。 「実質的に可溶な」金属−カルボン酸錯体は，血清，
便，尿，または唾液検体において典型的に見られる濃度
で，それらがここに示された方法によって検出し得る程
度まで溶媒に可溶であるような酸である。有機溶媒中に
「実質的に不溶な」金属塩は，有機相中で比色定量的に
検出されるのに充分には該有機相中に抽出されない。 「実質的に水と混和しない」有機溶媒は，水層からの
相分離が充分であり，従って金属−カルボン酸錯体を水
層から有機相へ抽出することが可能であるようなもので
ある。 「触媒活性がある」金属塩および金属−カルボン酸錯
体は，酸化剤の存在下で，色原体を酸化し得る。例え
ば，本発明のある好ましい実施態様では，金属塩および
それらから形成された錯体は，クメンヒドロペルオキシ
ドの存在下で，グアヤクの酸化を触媒する。典型的に
は，触媒活性のある金属−カルボン酸錯体は，触媒活性
のある金属塩から形成される。 本発明の方法においては，分析すべき検体を，まず試
料中に存在するカルボン酸との反応性を有する金属塩と
接触させて，比色反応を触媒する金属−カルボン酸錯体
を形成させる。従って，これらの錯体は，それらの触媒
活性をモニターすることによって検出される。ある好ま
しい実施態様では，これらの錯体は，酸化剤による色原
体の有色状態への酸化を触媒するそれらの活性によって
検出される。 金属塩は，好ましくは，鉄塩，銀塩，および銅塩から
なる群から選択される，触媒活性のある化合物である。
ここで使用するのに特に好ましい金属塩は，鉄，銀，お
よび銅の塩化物，硫酸塩，および硝酸塩である。ただ
し，これらの金属の有機塩（例えば，酢酸塩，プロピオ
ン酸塩）も同様に使用し得る。後者の場合，有機塩は明
らかに，検出されるカルボン酸のいずれからも形成され
るべきではないし，それらは他のどんな様式でも検出を
妨害すべきではない。これらの有機塩は，顕色系の成分
のいずれとも反応性を有すべきではないし，それらは立
体的な問題，溶解性または安定性に関する問題も示すべ
きではない。 金属塩は，最初から顕色系に存在する。ある実施態様
では，顕色系は金属塩が実質的に溶解している水相を含
む。他の実施態様では，顕色系は，金属塩がその上に存
在する固体支持体を含む。前者の場合，溶液中に存在す
る金属塩の好ましい濃度は，約0.5〜約50mMの範囲であ
る。特に好ましい濃度は，約1.0〜約10mMである。後者
の場合，すなわち固体支持体が金属塩で前処理される場
合，検体中に含まれる水は，適切な水相を形成するのに
充分である。 溶媒は，ある種の金属−カルボン酸錯体を選択的に溶
解するが，他のものは溶解しないように選ばれる。一般
的に，適切な溶媒には，以下のような有機溶媒が含まれ
る：（１）選択されたカルボン酸から形成される金属−
カルボン酸錯体が実質的に可溶である；（２）金属塩が
実質的に不溶である；（３）水と混和しない；そして
（４）存在する他の試薬（色原体および酸化剤を含む）
を実質的に溶解し得る。 腸内寄生蠕虫によって典型的に生成された遊離脂肪酸
を表１に示す。顕色系で使用するために選択された溶媒
を変更することによって，遊離脂肪酸の全く別のグルー
プを検出し得る。表１から明らかなように，生成される
FFAのある種のポターンは，種々の腸内寄生蠕虫による
体内侵入に対応し得る。従って，ここに述べられた方法
は，これらの寄生蠕虫を区別するのに使用してもよい。 本発明のある好ましい実施態様では，吉草酸，カプロ
ン酸，チグリン酸,2−メチル酪酸，および３−メチル酪
酸を含む,5個または６個の炭素原子を有する遊離脂肪酸
寄生蠕虫代謝産物が検出される。コハク酸も同様に検出
される。この好ましい応用に対して適切な溶媒には，ト
ルエン，ハロゲン化炭化水素（例えば,1,1,1−トリクロ
ロエタン），ベンジルアルコール，イソプロピルベンジ
ルアルコール，ジクロロメタン，酢酸エチル，酢酸オク
チル，クメン，安息香酸ベンジル，約６〜約11個の炭素
原子を有するアルコール（例えば，ヘキサノール），お
よびこれらの混合物が含まれる。12個またはそれ以上の
炭素原子を有するアルコールは，典型的には，室温で固
体であり，従って本発明の方法における使用からは除外
される。 診断方法はまた，検体と，色原体および該色原体を酸
化し得る酸化剤とを接触させることを包含する。ある好
ましい実施態様では，色原体および酸化剤は，共に顕色
溶液の有機相中に存在する。 溶媒中に存在する金属−カルボン酸錯体は，酸化剤に
よる色原体の酸化を触媒する。色原体は，酸化されると
肉眼でもはっきりとした色の変化が見えるように選択さ
れる。適切な色原体は，グアヤク,4−クロロ−１−ナフ
トール,o−フェニレンジアミン，テトラメチルベンジジ
ン，ロイコマラカイトグリーン,2,2−アジノビス（３−
メトラキシジフェニルアミン）,o−ジアニシジン,5−ア
ミノサリチル酸，およびこれらの混合物からなる群から
選択される。特に好ましい色原体はグアヤクであり，こ
れは還元状態では無色であり，酸化状態では濃い青色で
ある。必要に応じて，色原体は，使用に先立って，例え
ば溶媒抽出によって精製されてもよい。 溶媒中に存在する色原体の好ましい濃度は，選択され
た溶媒系によって様々である。典型的には，色原体の濃
度は，約0.01重量％〜約2.0重量％の範囲である。ヘキ
サノール系については，この範囲内の比較的低い濃度が
適切であるが，他方トリクロロエタン系またはトルエン
／ヘキサン混合物については，比較的高い濃度が好まし
い。 適切な酸化剤には，過酸化水素または有機ヒドロペル
オキシド（例えば，クメンヒドロペルオキシド,t−ブチ
ルヒドロペルオキシド，ジイソプロピルベンゼンヒドロ
ペルオキシド,2,5−ジメチルヘキサンヒドロペルオキシ
ド），およびこれらの混合物が含まれる。有機ヒドロペ
ノオキシドが好ましく，特に好ましい酸化剤は，クメン
ヒドロペルオキシドである。 また，酸化剤の濃度も，選択された特定の溶媒系によ
って様々である。典型的には，酸化剤の濃度は，約0.02
重量％〜約1.0重量％の範囲である。この範囲内の比較
的低い濃度はヘキサノール系またはトルエン／ヘキサノ
ール混合物に対応しており，比較的高い濃度は純粋なト
ルエンまたはトリクロロエタン系に対応している。 カルボン酸について分析される検体は，固体支持体上
に用意され，必要に応じて，顕色に先立って酸化され
る。次いで，この検体は，完全な顕色が可能になるの
に，すなわち金属−カルボン酸錯体の存在による色変化
の観察が可能になるのに充分な時間にわたって，顕色系
と接触させられる。一般に，有色生成物は，約１分以内
に見られる。ただし，より低いカルボン酸濃度を確実に
検出するために，より長いインキュペーション時間が時
々用いられる。インキュベーション時間は，好ましくは
約１分より短いが，所望であれば低濃度のカルボン酸を
確実に検出するために,15分またはそれ以上延長されて
もよい。より短い顕色時間が好ましい。 顕色系のpHは様々でよいが，非常に低いpHも非常に高
いpHも望ましくない。ここに述べられた方法は，約４〜
約11のpH範囲内で効果的であり，好ましいpHは約７であ
る。必要に応じて，顕色系は，適切な緩衝剤を用いて，
特定のpH（例えば,pH7）に調節してもよい。 本発明の方法の感度は，寄生蠕虫の体内侵入を検出す
るのに必要な最低の感度よりも，実質的に高い。実施例
で例示するように,0.05mM程度の遊離脂肪酸の濃度は，
この方法で検出され得るが,1〜10mM程度の濃度を検出す
る能力は，体内侵入を検出するのに充分であり得る。 金属塩，色原体，および酸化剤は，すべて固体支持体
上に存在していてもよい。それに代わる実施態様では，
これらの試薬の１つまたはそれ以上が溶液中に存在して
いてもよく，金属塩は水溶液中に，色原体または酸化剤
あるいはその両方は有機溶媒中に存在していてもよい。 本発明の第２の局面では，固相診断法が提供される。
該診断法では，（ａ）血清，便，尿，または唾液試料が
塗布されているかまたはスポットされている固体支持体
（例えば，フィルターペーパーなど）を用意し，そして
（ｂ）該支持体上の検体を，上記のように金属−カルボ
ン酸錯体が形成されかつ比色定量的に検出されるよう
に，顕色系と接触させる。この診断法を実施するのに必
要な試薬は上記のとおりである。すなわち，以下のもの
を含む顕色系である：カルボン酸と反応性がある金属塩
（この塩は固体支持体上かあるいは水相中に存在し得
る）；色原体；酸化剤；および選択された金属−カルボ
ン酸錯体が実質的に可溶であり，かつ金属塩が実質的に
不溶である有機溶媒。色原体および酸化剤の一方または
両方は固体支持体上にまたは有機溶媒中に存在していて
もよい。 本発明の他の局面では，カルボン酸（例えば，腸内寄
生蠕虫の体内侵入により生産された遊離脂肪酸代謝産
物）を検出するのに有用な顕色系が提供される。該顕色
系は，金属−カルボン酸錯体を形成するためにカルボン
酸と反応性のある金属塩；選択された金属−脂肪酸錯体
が実質的に可溶であり，かつ金属塩が実質的に不溶であ
る溶媒を含む有機相；色原体；および該色原体を酸化し
得る酸化剤を含む。該顕色系はさらに，金属塩がその上
に存在する固体支持体，あるいは金属塩が実質的に溶解
する水相を含んでいてもよい。色原体および酸化剤の一
方または両方は，固体支持体上に存在するか，あるいは
有機溶媒中に存在してもよい。ある好ましい実施態様で
は，金属塩は銅塩であり，色原体はグアヤクであり，酸
化剤はクメンヒドロペルオキシドである。 本発明は，その特定の実施態様に関連して記述されて
いるが，上の記述および以下の実施例は，本発明を例示
するためのものであり，本発明の範囲を限定するもので
はない。本発明の範囲は，添付の請求の範囲によって定
義される。ここでは明白には示されていないが，本発明
が属する当該技術分野の当業者には明白な他の局面，利
点，および変形例もまた同様に，本発明の範囲内にある
と考えられる。 実験：ここで用いられるすべての化学物質は,Sigma Che
mical Co.,Aldrich.Chemical Co,.J.T.Baker Co.,Malli
nckrodt and Lancaster Synthesis,Ltd.から市販されて
いるものである。 実施例１ 遊離脂肪酸の検出用溶媒の有用性 （１）水混和性，（２）グアヤク溶解度および（３）
発色に関して，様々な溶媒をそれらの有用性についてテ
ストした。水0.5mlを各溶媒0.5mlと混合し，そして，相
分離が起こるか否かに注目することによって，水混和性
を評価した。相分離が観察された場合には，表２に
「−」が示され，そうでない場合には，「＋」が示され
ている。 顕色剤を下記のように調製した。エタノール中の0.37
5重量％グアヤク溶液0.200mlを，清浄な各試験管に添加
し，エタノールを蒸発させた。表２に示されているよう
な所定の溶媒4mlを添加し，グアヤクを可能な程度まで
溶解させた。各溶媒中のグアヤクの溶解度を視覚的に観
察し，これを表２に示す。本質的に，沈澱していたグア
ヤクのすべてを溶解する溶媒は，はっきりした黄褐色を
生じた（＋＋＋）。中程度の量のグアヤクを溶解した溶
媒は中程度の黄色を生じた（＋＋）。少量のみのグアヤ
クを溶解した溶媒は薄い黄色を生じた（＋）。グアヤク
を実質的にまったく溶解しない溶媒に無色のままであっ
た（−）。 次に,80％のクメンヒドロペルオキシド48μを，各
管に添加し（水だけのサンプルが入っているものを除
く），テストのための完全な顕色剤（溶媒，色原体，酸
化剤）を作成した。クメンヒドロペルオキシドは本質的
には水に不溶であるので，その代わりとして過酸化水素
が，水だけのサンプル中酸化剤として使用された。しか
しながらグアヤクは，十分な発色を生じるには水への溶
解性が不十分であった。 マイクロタイタープレートウェルへ，テストサンプル
50μ,1mMの硫酸銅30μおよび顕色剤100μを添加
して，発色評価テストを実施した。脂肪酸テストサンプ
ルは，蒸溜水中100mMであり，これを希水酸化ナトリウ
ム溶液で最終的にpH7.0に調整した。色の強度を下記の
ように評価した。０＝青色がまったく認められない;1＝
青色がほとんど認められない;2＝はっきりと，かつ確か
にわずかな青色が認められる;3〜９＝中程度の変色；お
よび10＝最大限の色が生じる。結果を表２に挙げる。 実施例２ FFA−銅塩の溶媒抽出 実施例１の最初のスクリーニングに基づいて，その後
のテストに４つの溶媒系を選択した：トルエン,1,1,1−
トリクロロエタン（“TCE"）,n−ヘキサノールおよび9
0:10v/vトルエン／ヘキサノール溶媒混合物。これらの
溶媒について，様々の鎖長のFFAから形成された銅イオ
ン−脂肪酸錯体を選択的に抽出するそれらの能力につい
てのテストを行なった。100μの硫酸銅溶液（800mM）
および100μの脂肪酸溶液（100mM,水酸化ナトリウム
でpH7に調整された），あるいは100μの塩化ナトリウ
ム（100mM）を清浄な試験管に添加した。溶媒500μを
添加し，試薬混合物を30秒間ボルテックスで攪拌した。
相を分離させ,100μの有機相を，ヘキサノール中にク
メンヒドロペルオキシド１重量％およびグアヤク0.55重
量％を含有する。顕色剤100μに添加した。発色を，
実施例１のようにモニターした。結果を表３に示す。 ヘキサノールは１〜12の間の鎖長の，テストされたFF
Aのすべてを抽出した。トルエンおよびTCEは,5〜16個の
炭素原子の鎖長を有するFFAでのみ強い色を生じた。ト
ルエン／ヘキサノール混合物は,5〜16の鎖長を有するFF
Aのすべてを抽出した。従って，表３のデータは，溶媒
を変えることによって,FFAを選択的に抽出することがで
きることを示す。 実施例３ 他の金属イオンの性能 クメンヒドロペルオキシドによってグアヤクの酸化を
触媒する能力について，様々な金属イオンをテストし
た。0.001Mおよび1.0Mの濃度の水溶液中の金属塩が提供
された。これらの溶液を，水酸化ナトリウムでpH7.0に
調整した100mM酪酸20μと，ヘキサノール中のグアヤ
ク0.5重量％およびクメンヒドロペルオキシド５重量％
を含む，顕色剤100μとともに混合し，色の形成を上
記の実施例のようにモニターした。結果を表４に示す。 ここからわかるように，銀，銅および鉄の塩のみが，
テストされた濃度で適切な触媒であることがわかった。 次に，これらの塩の基質特異性を，酪酸およびコハク
酸溶液で評価した。金属塩溶液（0.001MのCuSO₄または
1.0MのAgNO₃）20μおよび100mM酪酸またはコハク酸
（水酸化ナトリウムでpH7に調整した）100μを，清浄
な試験管に添加した。ヘキサノール中のグアヤク0.5重
量％およびクメンヒドロペルオキシド１重量％を含む，
顕色剤100μを添加し,5分間インキュベートした後
に，色の形成をモニターした。 表５に要約した結果は，金属塩の選択が，鑑別診断に
おいて，すなわち様々な遊離脂肪酸と金属塩（ここで
は,AgNO₃）との反応の時に，種々の色強度が生じる場合
に有用であり得ることを示す。 実施例４ 成分濃度： 色原体，酸化剤および金属塩 色原体および酸化剤についての適切な濃度範囲が，次
の２つの時間間隔について決定された。すなわち（１）
２分間のインキュベーション時間および（２）10分間の
インキュベーション時間，これらのテストの各々におけ
る色原体は，グアヤクであり，その濃度を表6a〜6hに示
されているように,0.001重量％〜2.0重量％まで変化さ
せた。酸化剤は，クメンヒドロペルオキシドであり，同
様にその濃度は，示された様々な濃度であった。下記の
プロトコルに従って最適な濃度範囲を評価した。水酸化
ナトリウムでpH7.0に調整した,2.0mMのｎ−カプロン酸
（またはブランクの場合は，水）100μ,1.0mMの硫酸
銅60μおよび示された濃度のグアヤクおよびクメンヒ
ドロペルオキシドを含む顕色剤100μを，清浄な試験
管に添加し,10秒間ボルテックスにより攪拌した。上記
実施例のように色の変化をモニターした。結果を表6a〜
6hにまとめた。 ついで，最適な金属イオン濃度を決定するために，類
似のテストを実施した。水酸化ナトリウムでpH7.0に調
整し,2.0mMのｎ−カプロン酸（またはブランクの場合
は，水）100μ，表7a〜7dに示された様々な濃度の硫
酸銅60μ，およびグアヤクとクメンヒドロペルオキシ
ドを含む顕色剤200μを清浄な試験管に添加した。混
合物を10秒間ボルテックスにより攪拌した。２分および
15分のインキュベーション時間の後，上記実施例のよう
に色の変化をモニターした。結果を表7a〜7dにまとめ
た。 予期されたように，各時間間隔における成分の濃度の
許容範囲は，溶媒の選択と共に変わった。種々の成分の
最適濃度が下記のように決定された：（１）FFAが無い
場合,2分のインキュベーション時間で２以下の色強度が
必要であった；および（２）FFAがある場合,10分のイン
キュベーション時間後，少なくとも５の色強度が必要で
あった。これらの基準に基づいて，種々の成分について
の最適濃度範囲は下記のとおりである。 しかしながら，これらの濃度範囲は，必ずしもすべて
のタイプの試料に適切なわけではない。種々の要因，例
えば試料への吸着は，一定の成分の最終濃度に影響を与
えることがある。このようにして，上に概要を示した手
順に従って，各試料のタイプについて範囲が再び定義さ
れるべきである。 実施例５ pHの影響 この方法におけるpHの影響を下記のように評価した。
50mMのｎ−カプロン酸（示されたpHで）100μ，およ
び1mMの硫酸銅60μを清浄な試験管に添加した。グア
ヤク，クメンヒドロペルオキシドおよび溶媒を，表９に
示された濃度で含む顕色剤100μを添加した。試薬混
合物を10秒間ボルテックスで攪拌し，上記実施例のよう
に色の形成をモニターした。結果を表９に要約する。 上記結果から，この方法は，血清，尿，便または唾液
サンプルを用いて，予期された4.5〜7.4の生理学的pH範
囲を含むかなり広いpH領域にわたって，効果的であるこ
とが結論として述べられる。非常に低いpH（１〜３）あ
るいは非常に高いpH（1/2 11）でのみ，試薬の性能の悪
化が見られた。従って系の緩衝化が望ましいかもしれな
いが，それはこの方法における上記pH感受性によって拘
束されるものではない。 実施例６ カプロン酸に対する感受性 カプロン酸は，Ascaris体内侵入において診断上の重
要性を有することが証明されたFFAの１つであるので，
感受性予備テストために選ばれた。Monteoliva,Mら，Re
v.Iberica Parasit.41巻（３）,333〜340頁（1981年）:
Soprunovら，前出。水酸化ナトリウムでpH7.0に調整さ
れた,0.05mM〜100mMの様々な濃度のカプロン酸（また
は，ブランクの場合には水）を,1mMの硫酸銅60μ，お
よび示された様々な溶媒中のグアヤク0.5重量（％）お
よびクメンヒドロペルオキシド1.0重量％を含む顕色剤1
00μと混合した。試薬混合物を５秒間ボルテックスに
より攪拌し,2分後および10分後に色の形成をモニターし
た。様々な溶媒系において検出しうるカプロン酸塩の最
小濃度を表10に示す。 上記データにより,5および６個の炭素原子を有するFF
A（これは，ヒトにおけるAscaris体内侵入の診断を可能
にする）の尿中の各濃度が，このテストによって容易に
検出されることが示される。例えば,SoprunovaらのAnge
w.Parasitol.14巻,11〜17頁（1973年）およびKharnakov
およびSoprunova,Med.Parazitol.Parazit.Bolezni45巻,
450〜452頁（1976年）を参照されたい。 実施例７ 基質特異性のさらなる研究 この実施例においては，様々な遊離脂肪酸についての
この方法の特異性を評価した。表11aおよび11bに示され
た濃度におけるサンプル溶液50μ,1mMの硫酸銅20μ
，硫酸銅20μ，および示された濃度のグアヤクおよ
びクメンヒドロペルオキシドを含む顕色剤100μをマ
イクロタイタープレートウェルに添加した。ある実験に
おいては，プレートを２分間攪拌し（表11a），そして
第２の実験においては,15分間攪拌した（表11b）。色の
形成を上記実施例において行なったようにモニターし
た。結果を表11aおよび11bに示す。 これらの結果により証明されるように，他の遊離脂肪
酸または代謝産物とは無関係に，選択された遊離脂肪酸
（溶液状であり得る）の濃度を決定するように，溶媒を
選択することが明らかに可能である。 実施例８ イヌの糞の遊離脂肪酸についてのテスト この実施例においては,2−メチル吉草酸を加えたイヌ
の糞を，下記のように分析した。濾紙に,20mMの硫酸銅2
0μをスポットし，乾燥した。蒸溜水（“DW"）あるい
は40mMの２−メチル吉草酸（“2MV"）を用いて,1:1の重
量比で処理された，ほぼ30μの糞を，乾燥濾紙上にス
ポットし10分間放置した。次に，溶媒（90/10v/vトルエ
ン：ヘキサノール）30μを，糞をスポットしたのと反
対側の面の該サンプルの中央部にスポットをすることに
よって，サンプルを溶離した。90/10v/vトルエン／ヘキ
サノール混合物に，グアヤク２重量％およびクメンヒド
ロペルオキシド１％を含む顕色剤（約300μ）を添加
し,5分間インキュベートした後に，色の形成をモニター
した。結果を表12に示す。ここでわかるように，この方
法は，「偽陽性」の発生を最小限にし，遊離脂肪酸を検
出するのに非常に効果的である。 実施例９ 唾液の遊離脂肪酸についてのテスト ２−メチル吉草酸を加えた唾液，上記実施例の方法に
実質的に従って分析した。濾紙に20mM硫酸銅20μをス
ポットし，乾燥した。蒸留水あるいは20mMの２−メチル
吉草酸が1:1の重量比で添加された,30μの唾液を加え
た。サンプルを10分間放置しておき，その後，溶媒（90
/10v/vトルエン−ヘキサノール）30μを，サンプルを
スポットしたのと同じ側の該サンプルの中央部にスポッ
トすることによって，サンプルを溶離した。顕色剤（90
/10v/vトルエン−ヘキサノール中に，グアヤク２重量％
およびクメンヒドロペルオキシド１重量％を含む）を添
加し,5分間のインキュベートした後に，色の形成を観察
した。結果を表13に示す。上記実施例のようにこの方法
は，陽性のテスト結果を与えることがわかった。 実施例10 他のカルボン酸の検出 種々のカルボン酸（表14参照）の100mM水溶液を，水
酸化ナトリウムでpH7に調整した。濾紙に,5,10,20およ
び50mMの硫酸銅水溶液20μをスポットし，乾燥した。
各酸溶液20μを，一連の硫酸銅のスポットに添加し，
湿っている間に90/10v/vトルエン／ヘキサノールで溶離
した。酸／銅錯体の移動を，顕色剤（90/10v/vトルエン
／ヘキサノール中に，グアヤク２重量％およびクメンヒ
ドロペルオキシド１重量％を含む）で検出した。 揮発性脂肪酸の検出のために典型的に使用される硫酸
銅の比較的低い濃度下において，テスト系は２−メチル
吉草酸に最も感受性が高かった。他の酸については，様
々な程度の感受性が観察された。これらのデータは，上
記示されたデータと共に，このテストが，揮発性脂肪酸
以外の特定のカルボン酸を検出するために使用されうる
ことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 米国特許4615982（ＵＳ，Ａ) 欧州公開121317（ＥＰ，Ａ１)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．試料中のカルボン酸の検出法であって： （ａ）試料と，カルボン酸と反応して金属−カルボン酸
   錯体を形成し得る金属塩とを接触させる工程；および （ｂ）このような錯体の触媒活性をモニターすることに
   よって，形成される金属−カルボン酸錯体の存在を検出
   する工程， を包含する，方法。 ２．前記金属塩が，鉄，銀および銅塩でなる群から選択
   される，請求項１に記載の方法。 ３．検出される前記金属−カルボン酸錯体が，腸内寄生
   蠕虫体内侵入を示す遊離脂肪酸により形成される金属−
   脂肪酸錯体である，請求項２に記載の方法。 ４．試料中の遊離脂肪酸を検出する方法であって： （ａ）血清，便，尿または唾液試料が付与された固体支
   持体を準備する工程； （ｂ）該試料が付与された固体支持体と顕色系とを接触
   させる工程；および （ｃ）色形成をモニターすることにより，遊離脂肪酸の
   存在または非存在を検出する工程， を包含し，該顕色系が， （ｉ）カルボン酸と反応して金属−カルボン酸錯体を形
   成し得る金属塩； （ii）選択された金属−カルボン酸錯体が実質的に可溶
   であり，かつ該金属塩が実質的に不溶である溶媒を含む
   有機相； （iii）色原体；および （iv）金属−カルボン酸錯体の存在下に，色原体を有色
   化合物に酸化しうる酸化剤， を含有する，方法。 ５．前記金属塩が，鉄，銀および銅塩からなる群から選
   択される，請求項４に記載の方法。 ６．前記金属塩が銅塩であり，前記色原体がグアヤクで
   あり，そして，前記酸化剤がクメンヒドロペルオキシド
   である，請求項４に記載の方法。 ７．カルボン酸を検出するために用いられる顕色系であ
   って，該顕色系は，次の（ａ）〜（ｄ）を含有する： （ａ）カルボン酸と反応し，金属−カルボン酸錯体を形
   成し得る金属塩； （ｂ）該形成された金属−カルボン酸錯体が実質的に可
   溶であり，かつ該金属塩が実質的に不溶である溶媒を含
   む有機相； （ｃ）色原体；および （ｄ）金属−カルボン酸錯体の存在下に，色原体を有色
   化合物に酸化しうる酸化剤。 ８．前記金属塩が，鉄，銀および銅塩からなる群から選
   択される，請求項７に記載の顕色系。 ９．前記カルボン酸が，腸内寄生蠕虫体内侵入を示す遊
   離脂肪酸である，請求項７に記載の顕色系。 １０．前記金属塩が銅塩であり，前記色原体がグアヤク
   であり，そして前記酸化剤がクメンヒドロペルオキシド
   である，請求項７に記載の顕色系。