JPH0334920B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的には診断用試験法の分野に関す
るものであり、更に詳しくは、乳酸やケトン体の
ような生物学的成分を定性的そして定量的に測定
するために有用な試験法に関し、この試験法では
上記の各成分は過酸化水素のような酸化性物質に
変換されるものである。 テトラゾリウム化合物と電子伝達性の中間体
（例えばフエナジン・メトサルフエート又はダイ
アフオラーゼ）とを用い、これらを環元型のニコ
チン・アデニン・ジヌクレオチド（ホスフエー
ト）［NAD（Ｐ）Ｈ］に変えることからなる技術
はかなり以前から知られている。これに関しては
次の文献を挙げることができる。Markert、C.L.
and Moller、F.、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.45、
753（1959）；Tsao、M.U.、Arch.Biochem.Bio−
phys.、90、234（1960）；Dewey、M.M.and
Conklin.、J.L.、Proc.Soc.Exp.Biol.and Med.
105、492（1960）；Nachlas、M.M.、Margulies、
S.I.、Goldberg、J.D.、and Seligman、A.M.、
Anal.Biochem.１、317（1960）；Babson、A.L.、
and Phillips、G.E.、Clin.Chim.Acta12、210
（1965）；Gay、R.J.、McComb、R.B.、and
Bowers、G.N.、Clin.Chem.14、740（1968）。し
かしながら、この技術はフエナジン・メトサルフ
エートの光感受性、ホルマザン色素生成物の不溶
性及びダイアフオラーゼの不溶性と不安定性の点
に問題がある。 NAD（Ｐ）Ｈは硫酸銅との反応により第一銅イ
オンを生成し、これはキノレート化合物を形成し
てネオクプロインとなる。このキノレート化合物
は着色している。これについては、
Morgenstern、S.、Flor、R.、Kessler、G.、and
Klein、B.、Anal.Biochem13、149（1965）を参
照。 還元型のニコチン・アデニン・ジヌクレオチド
（NADH）は、２−オキソ酪酸及び２，４−ジニ
トロフエニルヒドラジンとは乳酸デヒドロゲナー
ゼの存在下で反応して２，４−ジニトロフエニル
ヒドラジンを生成する。これについては、King、
J.、Practical Clinical Enzymology、D.Van
Nostrand Co.、Ltd.、p.55、（1965）；Cabaud、
P.G.and Wroblewski、F.、Am.J.Clin.Path.30、
234（1958）を参照。この生成物は着色している。
しかし、この反応において発色を行わせるために
は二つの別々に分離された工程を必要とする。更
にこの方法での精度には問題があるとされてい
る。これについては、Massod、M.F.、Franey、
R.J.、Therrien，M.E.、Rideout，P.T.、and
Babcock M.T.、Am.J.Clin.Path.42，623（1964）
を参照。 ヒドロキシラーゼが存在していることを最初に
見出したのはカウフマン（Kaufman）で、1961
年のことであつた。これについては、Kaufman、
S.、Biochim.Bioshys.Acta51、619（1961）を参
照。このヒドロキシラーゼが非化学量論的な反応
を行うということは、水酸基が付与された基質以
外のある種の化合物が生成していることを示して
いる。それ以来、この現象に関する他の例も数多
く観察されている。多くのヒドロキシラーゼは全
く結合していないというわけではない。換言すれ
ば、水酸基が付与された生成物及び過酸化水素を
それぞれ若干は形成する。わずかのものは、ある
種の基質により結合が完全に妨害される。換言す
れば、水酸基のついた化合物は形成されない。
100％結合していない系の例としてはサリチル酸
ヒドロキシラーゼと安息香酸の系がある。これに
ついては、White−Stevens、R.H.and Kamin、
H.、J.Biol.Chem.247、2358（1972）；White−
Stevens、R.H.、Kamin、H.and Gibson、Q.
H.、J.Biol.Chem.247、2371（1972）；White−
Stevens、R.H.、Kamin、H.、and Gibson、Q.
H.in“Oxidation Reduction Enzymes”、
Akeson、A.and Ehrenberg、A.、eds.、p.453、
Pergamon Press、Oxford and New York
（1972）；White−Stevens、R.H.and Kamin、H.
Biochem.and Biophys.Res.Comm.38、882
（1970）を参照。完全に又は部分的に結合してい
ないヒドロキシラーゼの他の例としてはフエニル
アラニン・ヒドロキシラーゼの系を挙げることが
できる。これについては、Storm、C.B.、and
Kaufman、S.、Biochem and Biophys.Res.
Comm.32、788（1968）；Fisher、D.B.and
Kaufman、S.、J.Biol.Chem.248、4300（1973）；
ｐ−hydroxybenzoate hydroxylase、Spector、
T.and Massay、V.、J.Biol.Chem.247、4679
（1972）；Howell、L.G.、Spector、T.、and
Massay、V.、J.Biol.Chem.、247、4340（1972）；
Howell、L.G.and Massey、V.、Biochem.and
Biophys.Res.Comm.40、887（1970）；and
orcinol hydroxylase、Ohta、Y.、Higgins、I.
J.、and Ribbons、D.W.、J.Biol.Chem250、
3814（1975）を参照。 上記のヒドロキシラーゼ系がベルオキシターゼ
と関連していることを述べている報告はわずか一
つしかない。しかしこの例は、この反応に関与す
る成分のいずれかの分析を目的として行つたもの
ではなく、過酸化水素が生成していることを検出
するために行つたものである。これについては前
出のStorm、C.B.、and Kaufman、S.を参照。
この文献では還元型の共同因子を酸化するために
ペルオキシダーゼが用いられており、これはヒド
ロキシラーゼ反応の一部を形成している。水酸基
が付与された化合物の生成の割合が変動すること
から過酸化水素が存在していたことが認められ
た。この反応では着色化合物は生成していない。
この実験の目的はヒドロキシラーゼ反応により
H₂O₂が若干発生していることを証明することに
あつた。従つて分析法又は検出法として、ヒドロ
キシラーゼを用いることを、単独又はペルオキシ
ダーゼ系と結びつけてであつても開示している文
献は見られない。 本発明の還元型のピリジン・ヌクレオチドから
発色を行わせるための組成物は、前述の先行技術
の持つ問題点を避けることができる。例えば
NAD（Ｐ）Ｈから発色を行わせるための最も一般
的な方法は、テトラゾリウム塩と、例えばフエナ
ジン・モノサルフエート又はジアフオラーゼのよ
うな中間体電子伝達体を用いるものである。しか
しフエナジン・モノサルフエートは高い光感受性
を持ち、還元型の色素化合物は不溶性であり、そ
してダイアフオラーゼは難溶性である。これらの
全ての問題点を本発明により乗り越えることがで
きた。更に本発明の組成物の用途は多数存在す
る。そして指示薬系、ヒドロキシラーゼ、そして
還元型のピリジン・ヌクレオチドを生成するため
の方法のそれぞれについて、各種の選択を行うこ
とができる。更にこの多様の用途の中には検体
（試料）中の分析対象物質のみならず、試料中の
既知成分のいかなるものについての分析も含まれ
る。 NAD（Ｐ）に関する全体の反応式を次に示す。 式 分析対象物質→還元型の分析対象物質 還元型の分析対象物質＋NAD(P)Ｈ デヒドロゲナーゼ ――――――――→ 酸化型の分析 対象物質＋NAD(P)Ｈ 式 ヒドロキシラーゼの基質(H⁺)＋NAD(P)Ｈ ＋O₂ヒドロキシラーゼ ――――――――→ NAD(P)⁺＋H₂O₂ 式 H₂O₂＋ 還元型 指示薬 （無色）ペルオキシダーゼ 又はペルオキシダーゼ 様活性物質 ――――――――――→ 2H₂O＋酸化型指示薬（着色） 前述の各利点は、本発明の試料中の分析対象物
質を測定するための組成物により得られる。 本発明の組成物は、検体中の分析対象物質測定
用組成物であつて、 (1) 分析対象物質の存在に応答して還元されうる
ピリジン・ヌクレオチド、並びに該分析対象物
質に作用して該ピリジン・ヌクレオチドを還元
することのできる酸素、又は分析対象物質特異
性酵素及び該酵素と分析対象物質との反応生成
物に作用して該ピリジン・ヌクレオチドを還元
することのできる酵素； (2) 上記ピリジン・ヌクレオチドの還元体の存在
下で過酸化水素を発生するヒドロキシラーゼ及
び該ヒドロキシラーゼの基質； (3) ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ活性
物質 並びに (4) ヒドラゾン類とカツプラーが結合したヒドラ
ゾン指示薬であつて、酸化された形態にあると
き上記ピリジン・ヌクレオチドによつて還元さ
れないもの； からなることを特徴とする組成物。 本発明の好ましい実施の態様を以下に述べる。
これらの記述に際しては、説明を理解しやすくす
るために特定の例について説明を行うが、それら
の例は単に例示の目的で選ばれたものであり、本
発明の範囲を限定する意図によるものではない。 本発明は、還元型のピリジン・ヌクレオチドに
より視覚で捕えられる色を溶液もしくは試験用具
の形で生成される手段を提供するものである。 分析対象物質に応答して還元されうるピリジ
ン・ヌクレオチドは、ニコチン・アデニン・ジヌ
クレオチド（NAD）またはニコチン・アデニ
ン・ジヌクレオチド・ホスフエート（NADP）
であり得る。 還元型の分析対象物に作用してピリジン・ヌク
レオチドを還元することのできる酵素は、各種の
デヒドロゲナーゼである。該酵素は、分析対象物
質に特異性をもつ酵素を作用させて得られる反応
生成物にピリジン・ヌクレオチドを補酵素とする
デヒドロゲナーゼを用いることもできる（式）。 次に還元されたピリジン・ヌクレオチドにヒド
ロキシラーゼとその基質を作用させてH₂O₂のよ
うな酸化性物質を生成させる（式）。ここに生
成した過酸化水素はペルオキシダーゼ又はペルオ
キシダーゼ様活性物質の存在下で、指示薬に作用
させて色を生成させる（式）。 分析対象物質以外の上記の反応に必要な全ての
物質は相溶性を持ち溶液とすることができ、或は
支持体に含有させて試験用具の形にすることがで
きる。 式 分析対象物質は、還元型のピリジン・ヌクレオ
チドを生成させることのできる酵素の基質となり
うるものであれば、上記の形の分析対象物質とし
て分析することができる。 該分析対象物質（基質）に作用して該ピリジ
ン・ヌクレオチドを還元することのできる酵素の
例としては、デヒドロゲナーゼである。該基質と
該酵素の組合せの例としては、乳酸と乳酸デヒド
ロゲナーゼ、β−ヒドロキシ酪酸とβ−ヒドロキ
シ酪酸デヒドロゲナーゼ、α−ヒドロキシ酪酸と
α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、アルコー
ル（例、エタノール）とアルコール・デヒドロゲ
ナーゼ、ステロイド（例、コレステロール）とス
テロイド・デヒドロゲナーゼ、そしてグルコース
とグルコース・デヒドロゲナーゼを挙げることが
できる。 他の態様としては、分析対象物質に対して特異
性を持つ酵素、そしてその分析対象物質に対して
特異性を持つ酵素と分析対象物質との反応生成物
に作用してピリジン・ヌクレオチドを還元するこ
とのできる酵素を挙げることができる。この態様
の一例としては、分析対象物質に対して特異性を
持つ酵素がリパーゼで、分析対象物質とリパーゼ
との反応生成物に作用してピリジン・ヌクレオチ
ドを還元することのできる酵素がグリセリン・デ
ヒドロゲナーゼである組合せを挙げることができ
る。他の例としては、分析対象物質に対して特異
性を持つ酵素がヘキソキナーゼで、分析対象物質
とヘキソキナーゼとの反応生成物に作用してピリ
ジン・ヌクレオチドを還元することのできる酵素
がグルコース−６−ホスフエート・デヒドロゲナ
ーゼである組合せを挙げることができる。 ヒドロキシラーゼとその基質の好ましい組合せ
としては、サルチル酸ヒドロキシラーゼと安息香
酸塩、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ
と６−ヒドロキシニコチン酸塩を挙げることがで
きる。 デヒドロゲナーゼ又はその基質の試験用の上記
の組合せ例における反応順序を次に示す。 【表】 【表】 グリセリン
(反応生成物)
HO−CH_２
｜
C＝O＋NADH
｜
HO−CH_２
ジヒドロキシアセトン
【表】 ｜ 酸化型の
｜ 指示薬
2H_２O (着色)
これらの２つの反についての研究から、、ヒド
ロキシラーゼの反応（）の各成分は、ペルオキ
シダーゼの反応（）を進行させるが、その逆は
成立しないことが明らかになつた。サリチル酸ヒ
ドロキシラーゼの反応に加えられたNADHは、
酸化型のｏ−トリジン指示薬（着色）が形成する
とすぐにそれを還元する。即ち脱色させるように
働く還元剤として作用する。従つて、ペルオキシ
ダーゼにより酸化された場合に、NADHによる
還元作用を受けないペルオキシダーゼの反応のた
めの還元型指示薬系について研究を行つた。その
結果、NADHによる還元作用に感受性を持たな
い可逆性のない指示薬をいくつか見出した。 使用した指示薬の例としては、下記のように不
可逆的に結合した指示薬を挙げることができる。 本発明で用いるのに好適なこのようなヒドラゾ
ン／カツプラーからなる酸化還元指示薬の他の例
としては、特に米国特許第4119405号に記載され
たものを挙げることができる。カツプラーは単一
のものを用いることも、又は組合わせて用いるこ
ともできる。 本発明の組成物は、分析対象物質の測定用の溶
液として用いることができる。この溶液を調製す
るために用いられる溶媒の例としては、水、生理
食塩水又は他の適当な溶媒を挙げることができ
る。分析対象物質を検出するために用いられる上
記の組成物は、尿、脳せき髄液、細胞培養液の上
澄み液、血清、血漿又は全血液のような検体試料
に添加する方法で用いることが好ましい。 上記の組成物を溶液の形で用いる場合には、ピ
リジン・ヌクレオチドは約0.1ｍＭ（ミリモル）か
ら約10ｍＭの範囲内の濃度で用いるのが好まし
い。更に好ましい範囲は約１ｍＭから約10ｍＭで
ある。デヒドロゲナーゼの濃度は、約0.0003ミル
グラム／ミリリツトル（mg／ml）から約0.1mg／
mlの範囲内であることが好ましい。分析対象物質
特異性酵素がリパーゼである場合には、その濃度
は0.0001mg／mlから約0.1mg／mlの範囲内である
ことが好ましい。分析対象物質特異性酵素がヘキ
ソキナーゼである場合には、その濃度は約0.0005
mg／mlから約0.2mg／mlの範囲内であることが好
ましい。ヒドロキシラーゼは約0.001mg／mlから
0.01mg／mlの範囲内の濃度で存在し、そしてその
基質は約0.5ｍＭから約30ｍＭの範囲内の濃度で
存在する。ペルオキシダーゼは、その濃度は約
0.001mg／mlから約0.1mg／mlの範囲内にあること
が好ましい。指示薬は約10^-5モル（Ｍ）から約
10^-3Mの範囲内の濃度で用いることが好ましい。
本明細書に記載した例中の酵素及び他の試薬は、
例えば米国、インジアナ州、エルクハートのマイ
ルス・ラボラトリーズ・インコーポレーテツドの
開発製品部門（Research Products Division、
Miles Laboratories、lnc.、Elkhart、Indiana、
USA）で入手することができる。ヒドロキシラ
ーゼの調製は文献記載の方法に従い行つた。 本発明の試験用組成物は、試験用具に組み入れ
た形でも用いることができる。この支持体への組
成物の組み入れの方法としては、含浸法を挙げる
ことができ、更に他の方法としては上記の試験用
組成物を支持体の上に印刷するか、又は吹きつけ
る方法等の適当な方法を挙げることができる。 支持体（キヤリアー）の用語は、試験試料の生
理的液体又は他の種の液体に不溶性で、これらの
液体に接触したときに、その構造をそのまま維持
することのできる支持体を意味している。使用可
能な支持体の適当な例としては、紙、セルロー
ス、木製品、合成樹脂性の布地、ガラス繊維、織
布、不織布、ポリプロピレンのような各種の有機
重合体、又は当該技術分野で膜形成材料として良
く知られている他の種の有機物質を挙げることが
できる。あるいは、支持体は従来の支持体用物質
を含有する板状物を圧縮又は成形した形をとつて
いてもよい。使用し易くするために、支持体に
は、例えばポリスチレン製の不溶性保持体又は取
つ手を取り付けるのが適当である。 上記の試験用具は、本発明の組成物を支持体に
組み入れる方法により調製される。組成物が液体
の形である場合には、乾燥して用いる。本発明に
係る試験用具は一回含浸法により調製するのが好
ましい。この含浸法用の溶液に用いられる試薬の
濃度範囲は、約0.1ｍＭから飽和溶液までである。
ピリジン・ヌクレオチドについて最も一般的に用
いられる濃度は約50ｍＭである。含浸法用の溶液
中のペルオキシダーゼの濃度は約0.015mg／mlか
ら約２mg／mlである。この含浸法用の溶液を調製
するために用いられる溶媒の例としては、水、生
理食塩水、有機溶媒又はこれらの混合溶媒を挙げ
ることができる。 本発明に係る試験用具は、検体（試験試料）中
に瞬間的に浸す方法又は検体を支持体の構造内に
導入する等の他の方法で用いて、分析対象物質が
存在する場合に検出可能な色変化を生成させるよ
うにすることが有利である。支持体の収容可能体
積が限られているため、吸収され、かつ組み入れ
られている組成物が接触する検体の量が限定され
る。過剰の検体は支持体を洗浄するか又は吸い取
ることにより、検体量を支持体構造の内に実際に
入り込む量とすることができる。検体が血漿、血
清又は他の種の体液である場合には、上記の試験
用具は同様の方法で使用することができる。 試験用具は含浸等処理済の支持体構造物の形態
で、実際に使用する前に相当期間にわたつて貯蔵
することがあり、この理由から選択した試薬が空
気中で容易に自動酸化することがないことが望ま
しい。試験用具は光に当てないように保護してお
くことが望ましく、ある場合には試験用具を、使
用直前に１個又は数個を取り出す時にのみ開封さ
れるような防湿性包装を用いて密封することが望
ましい。 検体中に存在する分析対象物質との反応により
生成する色の反射率を読み取るためには市販され
ている分光光度計、例えばベツクマンDK−２分
光光度計（カルホルニア州、フレールトン
（Fullerton）のベツクマン・インスツルメント社
製）又はSCF−１分光光度計（イスラエル・エレ
クトロオプチカル・インダストリー社製、米国内
ではニユーヨーク州、ロングアイランド、プレイ
ンウエル（Plainwell）のブルーマー
（Broomer）・リサーチ・コーポレーシヨン社が
販売）等を用いることができる。 本発明の好ましい実施態様を実施例２および３
に示す。 実施例 １ 本実施例は各々異なつた指示薬を含有する４種
の組成物を用いて実施した試験について述べるも
のである。この４つの異なつた指示薬は(1)ｏ−ト
リジン、(2)MBTH＋Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、
(3)MBTH＋クロモトロピン酸、そして(4)MBTH
＋プリマキンである。 各組成物は溶液の形で次の濃度の各物質を含有
するように調製した（但しｏ−トリジンの試験は
別である）。0.31Mのクエン酸（PH7.59）、0.03M
の安息香酸ナトリウム、１ｍＭのEDTA、
147μMのNADH、0.005mg／mlの西洋わさびペル
オキシダーゼ、そして100μMのMBTHとその
各々のカツプラー。ｏ−トリジンの試験について
は127.5μMのｏ−トリジンを用い、クエン酸緩衝
液の代わりに0.02Mのりん酸カリウム（PH7.6）
を用いた。他の全ての含有物質はMBTH＋カツ
プラーを含有する三つの組成物の場合と同一であ
つた。反応はサリチル酸ヒドロキシラーゼを
1.17μｇ／mlの濃度になるように導入することに
より開始させた。これらの反応は実験室の室温で
行ない、発色の進行の速度はギルホード
（Gilford）2000分光光度計で計測した。各指示薬
について色の変化が読みとれる波長を各物質につ
いての最適位置とした。 上記の反応についての測定結果は次の通りであ
る。 【表】 上記の結果は、指示薬としてMBTH＋プリマ
キンを用いた組成物はNADHの作用により発色
するが、一方ｏ−トリジンを用いた組成物は発色
しないことを示すものである。 実施例 ２ 乳酸分析 糖尿病患者は乳酸のアシドーシス（酸性血症）
が進行するという強い危険性を持つている。この
状況は血糖低下剤のフエンホルミンの投与により
更に悪い方向に向かう。 従つて乳酸試験を行なう必要性がある。 本実施例では乳酸を、次に記載する組成を持つ
組成物を用いた溶液及び試験用具内で本発明に従
い発色するように変換した。 【表】 ピロリドン
【表】 ベンゼン 溶媒 溶媒
溶液系では全試薬を同一のセルに入れ、下記の
濃度の乳酸水溶液を加えることにより生成する反
応の進行状態を、分光光度計を用いて510ナノメ
ーター（ｎｍ）における吸光度の増加を測定する
ことにより追跡した。 試験用具の調製に際してはイートン・ダイクマ
ン（Eaton−Dikeman）205ロ紙（Eaton−
Dikeman、Mount Holly Springs、PA.17065、
USA）を複数枚数用意し、各々を上記の含浸溶
液を含浸飽和させた。含浸後、各々のロ紙を標準
型の実験室用乾燥器内で60℃にて乾燥した。次
に、含浸用溶液を乾燥残渣の形で含有している上
記のロ紙を切断し、2.5ミリメーター（mm）×2.5
mmの正方形の形にした。このロ紙片を両面接着テ
ープで裏打ちし、これをプラスチツク性の保持部
材上に固定した。発色を行なうために、下記の濃
度の乳酸水溶液をピペツトで取り、これを試験用
具上に付けた。発色の進行は目視により追跡する
か、又は反射型分光光度計を用いて行なつた。 溶液及び試験用具のいずれによつても、血液中
の生理学的濃度範囲、即ち0.6−６ｍＭ、の範囲
で含まれる乳酸の分析が可能であつた。溶液系で
は、濃度は発色の速度により他の濃度から判別し
た。発色の進行は１分間当りの光学密度の変化
（ΔOD／分）の形で記載する。乳酸の存在量が多
ければ多いほど、発色の進行は早くなつた。試験
用具を用いての試験の場合には、１分後に測定し
た反射率（％）により濃度を判別した。乳酸
（塩）が多ければ多いほど、１分後に現われる色
は多くなつた。 前記の条件の溶液及び試験用具を用いての試験
で得られた乳酸に対する応答結果を次に示す。 溶 液乳酸濃度 発色速度（510nｍでのΔOD／分） 7.75ｍＭ 0.576 2.58ｍＭ 0.395 0.65ｍＭ 0.148 ０ 0.116 試験用具乳酸濃度 １分後の520nｍでの反射率（％） 77.5ｍＭ 19.2％ 7.75ｍＭ 29.1％ 0.775ｍＭ 40.2％ ０ 54.9％ 溶液及び試験用具を用いて行なつた試験により
得られた結果は、いずれも本発明の組成物は前記
のいずれの配合状態にある乳酸についても、その
定量的な検出用として有効であることを示してい
る。 実施例 ３ ケトン体の分析 β−ヒドロキシ酪酸は尿中に見出される全ケト
ン体（全ケトン化合物）の約80％を占めている。
現在実施可能な方法による尿中のケトン体の検出
方法で検出できるのはアセト酢酸のみであり、こ
のアセト酢酸は全ケトン体の約20％を占めるにす
ぎない。従つてβ−ヒドロキシ酪酸用の試験法
は、ケトン体の試験法として有用である。 β−ヒドロキシ酪酸は本発明に従うことにより
溶液中又は試験用具上で発色する。溶液及び試験
用具（実施例２の方法により調製）で用いた試薬
は実施例２の乳酸分析法で用いたものと同一であ
る。但し下記の変更を加えてある。 【表】 ロリドン
溶液系では全試薬を同一のセルに入れ、下記の
濃度のβ−ヒドロキシ酪酸水溶液を加えることに
より生成する反応の進行状態を、分光光度計を用
いて510nｍにおける吸光度の増加を測定するこ
とにより追跡した。試験用具は実施例２に記載の
方法に従い調製した（但し、上記の変更を加え
た）。上記のβ−ヒドロキシ酪酸水溶液を試験用
具上に付け、発色の進行を目視により、又は反射
型分光光度計を用いて追跡した。 溶液及び試験用具のいずれによつても、尿中に
含まれる濃度範囲の濃度のβ−ヒドロキシ酪酸の
分析が可能であつた。溶液系では、濃度は発色の
速度により他の濃度から判別した。試験用具を用
いての試験の場合には、１分後に測定した反射率
（％）により濃度を判別した。 前記の条件の溶液及び試験用具を用いての試験
で得られたβ−ヒドロキシ酪酸に対する応答結果
を次に示す。 溶 液β−ヒドロキシ酪酸濃度 発色速度 （510nｍでのΔOD／分） 2.5mM 0.152 5.0 0.187 10.0 0.201 30.0 0.229 試験用具β−ヒドロキシ酪酸濃度 １分後の520nｍ での反射率（％） ０ 50.8％ 2.5ｍＭ 34.6％ 10.0 25.6％ 30.0 20.9％ 本実験により得られた結果は、本発明の組成物
はβ−ヒドロキシ酪酸の定量的な検出の目的には
溶液系及び試験用具を用いた場合でも有効である
ことを示している。 本明細書において本発明の具体的な例を記載し
たが、本発明の範囲を離れることなく多様に変形
を行なうことができるのは勿論である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 検体中の分析対象物質測定用組成物であつ
   て、 (1) 分折対象物質の存在に応答して還元されうる
   ピリジン・ヌクレオチド、並びに該分析対象物
   質に作用して該ピリジン・ヌクレオチドを還元
   することのできる酵素、又は分析対象物質特異
   性酵素及び該酵素と分析対象物質との反応生成
   物に作用して該ピリジン・ヌクレオチドを還元
   することのできる酵素； (2) 上記ピリジン・ヌクレオチドの還元体の存在
   下で過酸化水素を発生するヒドロキシラーゼ及
   び該ヒドロキシラーゼの基質； (3) ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様活
   性物質； 並びに (4) ヒドラゾン類とカツプラーが結合したヒドラ
   ゾン指示薬であつて、酸化された形態にあると
   き上記ピリジン・ヌクレオチドによつて還元さ
   れないもの； からなることを特徴とする組成物。 ２ 該ピリジン・ヌクレオチドが、ニコチン・ア
   デニン・ジヌクレオチドである特許請求の範囲第
   １項記載の組成物。 ３ 該ピリジン・ヌクレオチドが、ニコチン・ア
   デニン・ジヌクレオチド・ホスフエートである特
   許請求の範囲第１項記載の組成物。 ４ 分析対象物質に作用してピリジン・ヌクレオ
   チドを還元することのできる酵素が、デヒドロゲ
   ナーゼである特許請求の範囲第１項記載の組成
   物。 ５ 該酵素が、乳酸デヒドロゲナーゼである特許
   請求の範囲第４項記載の組成物。 ６ 該酵素が、β−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナ
   ーゼである特許請求の範囲第４項記載の組成物。 ７ 該酵素が、α−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナ
   ーゼである特許請求の範囲第４項記載の組成物。 ８ 該酵素が、アルコール・デヒドロゲナーゼで
   ある特許請求の範囲第４項記載の組成物。 ９ 該酵素が、ステロイド・デヒドロゲナーゼで
   ある特許請求の範囲第４項記載の組成物。 １０ 該酵素が、コレステロール・デヒドロゲナ
   ーゼである特許請求の範囲第９項記載の組成物。 １１ 該酵素が、グルコース・デヒドロゲナーゼ
   である特許請求の範囲第４項記載の組成物。 １２ 分析対象物質特異性酵素と分析対象物質と
   の反応生成物に作用してピリジン・ヌクレオチド
   を還元することのできる酵素が、デヒドロゲナー
   ゼである特許請求の範囲第１項記載の組成物。 １３ 該分析対象物質特異性酵素が、リパーゼで
   あり、該リパーゼと分析対象物質との反応生成物
   に作用する酵素が、グリセリン・デヒドロゲナー
   ゼである特許請求の範囲第１２項記載の組成物。 １４ 該分析対象物質特異性酵素が、ヘキソキナ
   ーゼであり、該ヘキソキナーゼと分析対象物質と
   の反応生成物に作用する酵素が、グルコース−６
   −ホスフエート・デヒドロゲナーゼである特許請
   求の範囲第１２項記載の組成物。 １５ 該分析対象物質が、分析対象物質と反応し
   てピリジン・ヌクレオチドを還元することのでき
   る酵素の基質である特許請求の範囲第１項記載の
   組成物。 １６ 該基質が、還元型の基質である特許請求の
   範囲第１５項記載の組成物。 １７ 該基質が、乳酸である特許請求の範囲第１
   ６項記載の組成物。 １８ 該基質が、β−ヒドロキシ酪酸である特許
   請求の範囲第１６項記載の組成物。 １９ 該基質が、α−ヒドロキシ酪酸である特許
   請求の範囲第１６項記載の組成物。 ２０ 該基質が、エタノールである特許請求の範
   囲第１６項記載の組成物。 ２１ 該基質が、ステロイドである特許請求の範
   囲第１６項記載の組成物。 ２２ 該基質が、コレステロールである特許請求
   の範囲第２１項記載の組成物。 ２３ 該基質が、グルコースである特許請求の範
   囲第１６項記載の組成物。 ２４ 分析対象物質が、分析対象物質特異性酵素
   の基質であり、該基質と分析対象物質特異性酵素
   との反応生成物に作用してピリジン・ヌクレオチ
   ドを還元することのできる酵素が、デヒドロゲナ
   ーゼである特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ２５ 該基質が、トリグリセリドであり、該トリ
   グリセリドとリパーゼとの反応生成物に作用する
   酵素が、グリセリン・デヒドロゲナーゼである特
   許請求の範囲第２４項記載の組成物。 ２６ 該基質が、グルコースであり、該グルコー
   スとヘキソキナーゼとの反応生成物に作用する酵
   素が、グルコース−６−ホスフエート・デヒドロ
   ゲナーゼである特許請求の範囲第２４項記載の組
   成物。 ２４ 該ヒドロキシラーゼが、サルチル酸ヒドロ
   キシラーゼであり、該ヒドロキシラーゼの基質
   が、安息香酸塩である特許請求の範囲第１項記載
   の組成物。 ２８ 該ヒドロキシラーゼが、ｐ−ヒドロキシ安
   息香酸ヒドロキシラーゼであり、該ヒドロキシラ
   ーゼの基質が、６−ヒドロキシニコチン酸塩であ
   る特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ２９ 該ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ
   様活性を有する物質が、ペルオキシダーゼである
   特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３０ 該ヒドラゾン類が、３−メチル−２−ベン
   ゾチアゾリノン・ヒドラゾンである特許請求の範
   囲第１項記載の組成物。 ３１ 該カツプラーが、プリマキンである特許請
   求の範囲第１項記載の組成物。