DK162400B

DK162400B - Reagens til bestemmelse af et reduceret pyridin-nucleotid eller en analyt, som ved hjaelp af dennes analyt-specifikke dehydrogenase danner reducerede pyridin-nucleotider, samt materiale indeholdende reagenset

Info

Publication number: DK162400B
Application number: DK427080A
Authority: DK
Inventors: Erma C Cameron; Claude R Gunter; Rodric H White-Stevens
Original assignee: Miles Inc
Priority date: 1979-10-10
Filing date: 1980-10-09
Publication date: 1991-10-21
Also published as: ES8106934A1; CA1141637A; FI75432B; IL61147A; IL61147A0; JPS5661652A; AU521507B2; NO156506B; EP0029104B1; AU6311380A; BR8006520A; ATE11569T1; NO803012L; ES495782A0; EP0029104A1; DK162400C; DK427080A; JPH0334920B2; IE50326B1; NO156506C

Description

DK 162400 B

Opfindelsen angår et reagens til bestemmelse af et reduceret pyridin-nucleotid eller en analyt, som ved hjælp af dennes analyt-specifikke dehydrogenase danner reducerede pyridin-nucleotider. Opfindelsen angår også et materiale 5 til bestemmelse af en analyt i en prøve, hvilket materiale indeholder reagenset.

Metoden til anvendelse af en tetrazoliumforbindelse og et elektronbærende mellemprodukt, f.eks. phenazinmetho-sulfat eller diaphorase, til frembringelse af en farvning 10 ved hjælp af reduceret nicotinadenindinucleotid(phosphat) (NAD(P)H) har været kendt i nogen tid, jfr. C.L. Markert og F. Moller, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S., 45, 753 (1959), M.U.

Tsao, Arch. Biochem. Biophys., 90, 234 (1960), M.M. Dewey og J.L. Conklin, Proc. Soc. Exp. Biol, and Med., 105. 492 15 (1960), M.M. Nachlas, S.I. Margulies, J.D. Goldberg og A.M.

Seligman, Anal. Biochem., 1, 317 (1960), A.L. Babson og G. E. Phillips, Clin. Chim. Acta, 12, 210 (1965), og R.J.

Gay, R.B. McComb og G.N. Bowers, Clin. Chem., 14/ 740 (1968).

Ved denne metode optræder der imidlertid ulemper på grund 20 af problemer med lysfølsomheden af phenazinmethosulfat, uopløseligheden af formazan-farvestofproduktet og uopløseligheden og instabiliteten af diaphorasen.

Reaktionen mellem NAD(P)H og kobbersulfat giver en kobber(I)-ion, som derpå kan omdanne et chelatdannelsespro-25 dukt til neocuproin. Dette chelatdannelsesprodukt er farvet, jfr. S. Morgenstern, R. Flor, G. Kessler og B. Klein, Anal. Biochem., 13, 149 (1965).

Reduceret nicotinadenindinucleotid (NADH) reagerer med 2-oxobutyrat og 2,4-dinitro-phenylhydrazin i nærværelse 30 af lactatdehydrogenase under dannelse af 2,4-dinitro-phenyl-hydrazon, jfr. J. King, Practical Clinical Enzymology, D. van Nostrand Co., Ltd., s. 55 (1965) samt P.G. Cabaud og F. Wroblewski, Am. J. Clin. Path., 30, 234 (1958). Dette produkt er farvet. Denne reaktion kræver imidlertid to særskilte 35 trin til farvedannelsen. Endvidere er metodens nøjagtighed ikke sikker, jfr. M.F. Massod, R.J. Franey, M.E. Therrien,

DK 162400 B

2 P.T. Rideout og M.T. Babcock, Am. J. Clin. Path., 42., 623 (1964) .

En påvisning af en frikoblende hydroxylase blev første gang foretaget i 1961 af Kaufman, jfr. S. Kaufman, Biochim.

5 Biophys. Acta, 51, 619 (1961). Den ikke-støkiometriske natur af hydroxylase-reaktionen lod erkende, at der dannedes et eller andet produkt, men ikke noget hydroxyleret substrat.

Siden det nævnte tidspunkt er der fremkommet talrige andre eksempler på denne foreteelse. De fleste frikoblende hydroxy-10 laser er ikke fuldstændigt afkoblede. Der dannes med andre ord noget hydroxyleret produkt og noget hydrogenperoxid. En ringe mængde kan frikobles fuldstændigt ved hjælp af visse pseudosubstrater. Med andre ord: der dannes ikke noget hydroxyleret produkt. Et eksempel på et for 100%'s vedkommende 15 frikoblet system er salicylathydroxylase og benzoat, jfr.

R. H. White-Stevens og H. Kamin, J. Biol. Chem., 247 , 2358 (1972), R.H. White-Stevens, H. Kamin og Q.H. Gibson, J.

Biol. Chem., 247. 2371 (1972), R.H. White-Stevens, H. Kamin og Q.H. Gibson i "Oxidation Reduction Enzymes", A. Akeson 20 og A. Ehrenberg, Eds., s. 453, Pergamon Press, Oxford og

New York (1972) samt R.H. White-Stevens og H. Kamin, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 38, 882 (1970). Yderligere eksempler på fuldstændigt eller delvis frikoblede hydroxylaser er phenylalaninhydroxylase (C.B. Storm og S. Kaufman, Biochem.

25 and Biophys. Res. Comm., 32., 788 (1968) og D.B. Fisher og S. Kaufman, J. Biol. Chem., 248. 4300 (1973), p-hydroxyben-zoathydroxylase (T. Spector og V. Massey, J. Biol. Chem., 247. 4679 (1972), L.G. Howell, T. Spector og V. Massey, J.

Biol. Chem., 247, 4340 (1972), L.G. Howell og V. Massey, 30 Biochem. and Biophys. Res. Comm., 4j0, 887 (1970) og orcinol-hydroxylase (Y. Ohta, I.J. Higgins og D.W. Ribbons, J. Biol. Chem., 250, 3814 (1975)).

Der findes kun én offentliggørelse, ifølge hvilken hydroxylasesystemet bringes i forbindelse med peroxidase.

35 Dette skete med det formål at påvise dannelsen af hydrogenperoxid og ikke til bestemmelse af nogen komponent, der 3

DK 162400 B

tager del i reaktionerne, jfr. C.B. Storm og S. Kaufman, loc.cit. Peroxidase blev anvendt til oxidation af en reduceret cofaktor, der var en del af hydroxylasereaktionen.

Det ændrede forhold for det hydroxylerede produkt lod erken-5 de, at hydrogenperoxid var til stede. Ved denne reaktion dannedes der intet farvet produkt. Formålet med forsøget var at eftervise, at der ved hydroxylasereaktionen dannedes noget Η2θ2· Der er ikke blevet fundet nogen omtale af anvendelsen af frikoblende hydroxylase enten alene eller i kom-10 bination med et peroxidasesystem som bestemmelses- eller påvisningsmetode.

Reagenset ifølge opfindelsen til farvedannelse ud fra et reduceret pyridin-nucleotid er ikke behæftet med de problemer, som generer ved de kendte metoder. EKsempelvis 15 er en af de mest gængse metoder til farvedannelse ud fra NAD(P)H anvendelsen af et tetrazoliumsalt og en intermediær elektronbærer, f.eks. phenazinmethsulfat eller diaphorase. Phenazinmethosulfat er imidlertid meget lysfølsomt, det reducerede farvestofprodukt er uopløseligt, og diaphorase 20 er tungtopløseligt. Dette er altsammen problemer, der løses med reagenset ifølge den foreliggende opfindelse. Reagenset ifølge opfindelsen er desuden særdeles alsidigt. Man har et valg blandt indikatorsystemerne, blandt de frikoblende hy-droxylaser og blandt metoderne til dannelse af et reduceret 25 pyridin-nucleotid. Denne alsidighed omfatter valget af bestemmelsen af en analyt i en prøve samt en bestemmelse af en forudbestemt bestanddel af sammensætningen.

Det samlede reaktionsskema for NAD(P) er som følger: 30 Ligning I: _ , . >. Reduceret

Analyt -> analyt

Reduceret + komponent, der gi- -^Oxideret + NAD(P)H

35 analyt ver respons på analyt analyten [nad(P)] 4

DK 162400 B

Ligning II: + frikobler^ + H +NAD (P) H + 02 -———> NAD(P) + 5 Ligning III; Η2°2 + Indikator (H2) Per?xidase—^ 2 H^0 + (farveløs) (farvet) 10 Opfindelsen angår således et reagens til bestemmelse af et reduceret pyridin-nucleotid eller en analyt, som ved hjælp af dennes analyt-specifikke dehydrogenase danner reducerede pyridin-nucleotider, og dettes reagens er ejendommeligt ved, at det omfatter 15 aj en hydroxylase, som er i stand til at frikobles, og et pseudosubstrat, som er i stand til at frikoble hydroxy-lasen, således at denne kan danne hydrogenperoxid i nærværelse af reducerede pyridin-nucleotider, b) en peroxidativt- aktiv forbindelse, 20 c) en hydrazonindikator, der omfatter en hydrazon og et koblingsmiddel, hvilken indikator på oxideret form ikke kan reduceres af pyridin-nucleotidet, og d) desuden kan indeholde en analyt-specifik dehydrogenase og oxiderende pyridin-nucleotider.

25 Opfindelsen angår også et materiale til bestemmelse af en analyt i en prøve, og dette materiale er ejendommeligt ved, at det omfatter en bærer inkorporeret med et reagens ifølge opfindelsen.

For tydeligheds skyld anvendes der her bestemte ud-30 tryk, men disse vedrører kun anskueliggørelsen af de valgte udførelsesformer.

Opfindelsen angår et reagens, der enten i opløsning eller i et materiale danner en synlig farve ud fra reducerede pyridin-nucleotider. De komponenter, der giver respons på 35 analytterne, indeholder et pyridin-nucleotid, der som reaktion på nærværelsen af en analyt lader sig reducere (ligning 5

DK 162400 B

I). Pyridin-nucleotidet er enten fra begyndelsen af til stede i dets reducerede form eller reduceres gennem virkningen af mindst én med analyten reaktionsdygtig bestanddel, f.eks. et enzym, der kræver pyridin-nucleotidet som cofaktor, 5 og dets substrat. Hvis det reducerede pyridin-nucleotid er den form, der er tale om, forløber reaktionen ifølge ligning I. Det reducerede pyridin-nucleotid bringes derpå ved indvirkning af en afkobler, f.esk. en frikoblende hydroxylase, og et pseudosubstrat derfor (ligning II), til at danne et 10 oxiderende stof, f.eks. Η2θ2. I nærværelse af et peroxidativt aktivt stof, f.eks. en peroxidase, bevirker det således dannede peroxid, at indikatoren danner en farve (ligning III). Alle til denne reaktion nødvendige stoffer med undtagelse af analyten er forenelige i opløsning eller på en 15 bærer, i hvilket tilfælde de danner en teststrimmel.

Ønskede enzymatiske reaktionsbestanddele, der formår at danne et reduceret pyridin-nucleotid eller kan kobles med et andet enzymatisk system under dannelse af det reducerede pyridin-nucleotid, kan anvendes som reaktionsdygtige be-20 standdele i de komponenter, der giver respons på analyten.

Enten substratet for disse enzymer eller enzymerne selv kan derfor påvises eller bestemmes med analyten af dette system.

I en første udførelsesform kan den reaktionsdygtige eller interreaktive bestanddel af den komponent, der giver 25 respons på analyten, være et analyt-specifikt enzym, når analyten er substratet for dette enzym, og det er et analyt-specifikt substrat, når analyten er et for dette substrat specifikt enzym. I en foretrukken udførelsesform er enzymet en dehydrogenase. Eksempler på egnede substrat-enzym-par er 30 lactat-lactatdehydrogenase, β-hydroxybutyrat-/3-hydroxybuty-ratdehydrogenase, a-hydroxybutyrat-a-hydroxybutyratdehydro-genase, alkohol (f.eks. ethanol)-alkoholdehydrogenase, steroid (f.eks. cholesterol)-steroiddehydrogenase og glucose-glucosedehydrogenase.

35 I en anden foretrukken udførelsesform er substrat- enzym-parret 6-hydroxy-nicotinat-p-hydroxybenzoat-hydroxy- 6

DK 162400 B

lase.

I en anden udførelsesform er mindst én reaktionsdygtig eller interreaktiv bestanddel af den komponent, der giver respons på analyten, et analyt-specifikt enzym og et enzym, 5 der med produktet fra den til reduktionen af pyridin-nucleo-tidet førende reaktion af det analyt-specifikke enzym er reaktionsdygtigt med analyten. I et eksempel på denne udførelsesform er det analyt-specifikke enzym en lipase, og det enzym, der er reaktionsdygtigt med produktet fra reaktionen 10 af denne lipase med analyten under reduktion af pyridin-nucleotidet, er glyceroldehydrogenase. I et yderligere eksempel på denne udførelsesform er det analyt-specifikke enzym hexokinase, og det enzym, der er reaktionsdygtigt med produktet fra reaktionen af denne hexokinase med analyten un-15 der reduktion af pyridin-nucleotidet, er glucose-6-phosphat-dehydrogenase.

I den omvendte form for denne udførelsesform er den reaktionsdygtige eller interreaktive bestanddel et analyt-specifikt substrat og et enzym, som er reaktionsdygtigt med 20 produktet fra den til reduktionen af pyridin-nucleotidet førende reaktion af det analyt-specifikke substrat med analyten, dvs. af det substat-specifikke enzym og substratet er konjugat-par, hvorfor de hver især betegnes som analyten. Eksempelvis er det analyt-specifikke substrat et triglycerid, 25 idet analyten nu er lipase, og det enzym, der er reaktionsdygtigt med produktet fra den til reduktionen af pyridin-nucleotidet førende reaktion af triglyceridet med analyten, er glyceroldehydrogenase.

I et yderligere eksempel er det med analyten reage-30 rende substrat glucose, og enzymet, som er reaktionsdygtigt med produktet af den til reduktion af pyridin-nucleotidet førende reduktion af glucose med analyten er glucose-6-phos-phatdehydrogenase.

Reaktionsrækkefølgen for disse eksempler ved en test 35 for en dehydrogenase eller dens substrat fremgår af den følgende oversigt:

7 DK 162400 B

O

Almen form: 1.

Substrat Substrat-specifikt g (reduceret form) + NAD(P) enzym (f.eks. egnet Oxideret

dehydrogenase)_ substrat + NAD(P)H

hvor analyten er enten substratet eller det substrat-specifikke enzym, og den interreaktive bestanddel af den analyt-responsive komponent er konjugatet af enzym-substrat-parret.

10

Specifikke eksempler; a.

OH T . . O

, Lactat- „

CH3-CH-COOH + NAD dehydrogenase ^ CH^-C-COOH + NADH

Mælkesyre Pyruvat b.

β-hydroxybutyrat- ^

CH„-CH-CH„-COOH + NAD dehydrogenase \ CH„-C-CH„COOH + NADH

2q 3 2 -j z β-Hydroxysmørsyre Aceteddikesyre c.

α-hydroxybutyrat- ^

CH„-CH„-CH-COOH + NAD dehydrogenase \ CH--CH--C-COOH + NADH

25 3 2 --7* i 2 a -Hydroxy smør syre (X-Oxobutyrat d.

O

Alkohol „ CH_-CHn-OH + NAD dehydrogenase \ CH--CH + NADH 30 3 2 ---^ 3

Ethanol Acetaldehyd e.

Egnet

^ Steroid + NAD(P) dehydrogenase s, oxideret steroid + NAD(P)H

s DK 162400 B

O

f.

Cholesterol-

Cholesterol + NAD(P) dehydrogenase ^ Cholestenon + NAD(P)H

5 g.

Glucose-

Glucose + NAD(P) dehydrogenase ^ Glucono-&-1acton + NAD(P)H

2.

10 Analyt + analyt-specifikt enzym -^ Produkt

Produkt + interreaktivt enzym + NAD(P) —^ NAD(P)H + andre reaktionsprodukter, hvor den interreaktive bestanddel (enzymer) omfatter det analyt-spe-cifikke enzym og et enzym, der er interreaktivt med produktet fra 15 reaktionen mellem det analyt-specifikke enzym og det andet enzym til reduktion af pyridin-nucleotidet.

a.

O

1 " 20 R -C-0-CH. . , .

2 Lipase(r) O (analyt-speci- O HO-CH2

CH-O-i-R2 + 3H,0 flkt -* 3Rn-C-OH + CH-OH

0 2 I

3 " HO-CH„ R -C-0-CH2 2 25 Triglycerid Glycerol (analyt) (produkt) 12 3 I det foregående betyder R , R og R uafhængigt af hinanden n 12 3 en fedtsyre, og R betyder vilkårligt R , R eller R .

30 HO-CH- _ . _ . , HO-CH

1 2 Glycerol-dehydrogenase i 2 I . „„„ (interreaktivt enzym) \ J, ' „ .

CH-OH + NAD -—-> C=0 + NADH

I I

HO-CH2 HO-CH2

Glycerol Dihydroxyacetone (produkt) 35 9

DK 162400 B

b.

Hexokinase

Glucose ♦ ATP (aiialyt-speclfikt ensy.) > Glucose_6_phDsphat + mp (analyt) (produkt) 5 Glucose-6-phosphat dehydrogenase * ,

Glucose-6-phosphat + NADP (-n-terreak^-i.vt. enzym) -phosphat + NAD(P)h (produkt)

Ligningerne II οα III: 10 Den frikoblende hydroxylasereaktion, der finder sted som følge af tilstedeværelsen af det reducerede pyridin-nucleotid, forløber som følger:

Frikobler (f.eks. frikoblende hydroxylase NAD (P)H + O °q Pseudosubstr^-tJ-^ NAD(P) + H?0 Reduceret K 2 A indikator s' (farveløs) ; »eroxidase Ψ Nv 2H_0 \ Oxideret 2 λ indikator (farvet)

Undersøgelser af disse to reaktioner har vist, at komponenter fra frikoblings-hydroxylase-reaktionen (II) 25 interfererer med peroxidase-reaktionen (III), men at det omvendte ikke er tilfældet. Det til salicylathydroxylase-reaktionen tilførte NADH er virksomt som reduktionsmiddel og reducerer og bleger herved den oxiderede o-tolidin-indikator (farvet) lige så hurtigt, som den dannes. En under-30 søgelse er blevet udført med hensyn til reducerede indikatorsystemer til peroxidase-reaktionen, der, når de oxideres med peroxidase, ikke er tilgængelige for reduktion med NADH.

Der er blevet konstateret flere irreversible indikatorer, der er ufølsomme over for reduktion med NADH, jfr. det føl-35 gende eksempel 1.

Den følgende koblede irreversible indikator anvendes f.eks. til farvedannelse: 10

DK 162400 B

ch3

\h (CH2)3 - NH2 + H-N

5 CO "-”3 CHs/o CH3 MBTH Primaquin (3-Methy1-2-benzothiazolon- · (8-/4-Amino-1-methyl- hydrazon) butylamino7“6-methoxy- 10 guinolin) ch5

Ch - cch2)3 - NH2 15 Π'? ύΟ

CHjO T

20 CH3%^S

o

Også andre hydrazon-koblingsmiddel-redoxindikatorer 25 egner sig til opfindelsens formål og er f.eks. beskrevet i US-patentskrift nr. 4.119.405. Der kan vælges et enkelt koblingsmiddel, eller der kan anvendes flere sådanne i kombination.

Til bestemmelse af analyten kan reagenset anvendes 30 som opløsning. Som opløsningsmidler til fremstilling af opløsningerne egner sig vand, fysiologiske opløsninger eller andre opløsningsmidler, hvis egnethed er kendt. Reagenset anvendes fortrinsvis til påvisning af analyten, idet det sættes til en prøve, f.eks. urin, cerebrospinalvæske, det 35 ovenstående serum fra vævskulturer, plasma eller helblod.

11

DK 162400 B

Når reagenset anvendes i form af en opløsning, anvendes pyridin-nucleotidet fortrinsvis i koncentrationer fra ca. 0,1 mM til ca. 10 mM. Det foretrukne område er fra ca.

1 mM til ca. 10 mM. Når en dehydrogenase er del af den kom-5 ponent, der giver respons på analyten, andrager dens koncentration fortrinsvis fra ca. 0,0003 mg/ml til ca.

0,1 mg/ml. Når lipase er en del af den komponent, der giver respons på analyten, andrager koncentrationen deraf fortrinsvis fra ca. 0,0001 til ca. 0,1 mg/ml. Når hexokinase er en 10 del af den komponent, der giver respons på analyten, andrager dens koncentration fortrinsvis fra ca. 0,0005 til ca.

0,2 mg/ml. Den frikoblende hydroxylase er til stede i koncentrationer fra ca. 0,001 til ca. 0,01 mg/ml, og dens pseu-dosubstrat foreligger i koncentrationer fra ca. 0,5 til ca.

15 30 mM. Når peroxidase er til stede, andrager koncentrationen deraf fortrinsvis fra ca. 0,001 til ca. 0,1 mg/ml. Indikatoren anvendes fortrinsvis i koncentrationer fra ca. 10”5 til ca. 10-3M. Hydroxylaserne fremstilles på den i litteraturen beskrevne måde.

20 Opfindelsen omfatter endvidere testmaterialer, der indeholder reagenset ifølge opfindelsen. Foruden ved imprægnering kan påføringen af reagenset på bæreren også ske efter andre, egnede metoder, f.eks. ved påtrykning eller påsprøjt-ning af reagenset på bæreren.

25 Betegnelsen "bærer" skal dække grundmaterialer, der er uopløselige i den fysiologiske eller anden væske, der skal testes, og som bevarer deres strukturelle egenart ved indvirkning af denne væske. Eksempler på egnede bærermaterialer er papir, cellulose, træ, kunstharpiksflor, glasfibre, 30 fiberflor og væv, forskellige organiske polymerisater, f.eks. polypropylen, og andre organiske materialer, der er fagmanden bekendte som filmdannere. Som alternativ kan bæreren have form af en presset eller formet tablet, der indeholder gængst bærermateriale. Til bekvem håndtering kan bæreren på passende 35 måde være befæstiget til et uopløseligt underlag eller håndgreb, der kan bestå af polystyren.

12

DK 162400 B

Testmaterialet fremstilles ved en metode, ved hvilken man indarbejder et reagens ifølge opfindelsen i en bærer.

Når reagenset foreligger på flydende form, tørres det derefter. Materialet fremstilles fortrinsvis ved en éngangs-im-5 prægneringsproces. Koncentrationerne af de i imprægneringsopløsningen anvendte reagenser ligger i området fra ca.

0,1 mM til en mættet opløsning. Mest egnet er i de fleste tilfælde en koncentration på ca. 50 mM for pyridin-nucleo-tidet. Koncentrationen af peroxidasen i imprægneringsopløs-10 ningen andrager fra ca. 0,015 til ca. 2 mg/ml. Som opløsningsmidler til fremstillingen af imprægneringsopløsningerne egner sig vand, fysiologiske opløsninger, organiske opløsningsmidler eller kombinationer af disse opløsningsmidler.

Testmaterialet anvendes med fordel på den måde, 15 at det kortvarigt dyppes i en forsøgsprøve, eller ved, at man på anden måde indfører en forsøgsprøve i bærermaterialet, hvorved der indtræder en synlig farveændring, når analyten er nærværende. Bærerens optagelsesformåen tjener til at begrænse mængden af det af bæreren absorberede og 20 på det deri indarbejdede ieagens til indvirkning af kommende prøvemateriale. Et eventuelt overskud af prøven kan fjernes ved skylning eller aftørring af bæreren, hvorved den testede prøvemængde begrænses til det faktisk i bærermassen indførte rumfang af prøven. Testmateriale kan an-25 vendes på samme måde, når der undersøges prøver af plasma, serum eller andre legemsvæsker.

Testmaterialer i form behandlede bærematerialer opbevares ofte i et betydeligt tidsrum inden anvendelsen.

Det er derfor hensigtsmæssigt, at de valgte reagenser ikke 30 er let oxiderbare i luften. Det er tilrådeligt at beskytte testmaterialerne mod lyspåvirkning, og i visse tilfælde er det hensigtsmæssigt at holde dem tæt tillukket i en fug-tighedsafvisende pakning, som kun åbnes kort før brugen til udtagelse af ét eller flere testmaterialer.

13

DK 162400 B

Værdien af refleksionsevnen af den ved reaktion med den i prøven tilstedeværende analyt kan bestemmes med i handelen gængse spektrofotometre, f.eks. Beckman-DK-2-spek-trofotometret (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, pr

Californien) eller spektrokolorimetret SCF-1 (Israel Electro-Optical Industrie Ltd., forhandler i USA: Broomer Research Corporation, Plainwell, Long Island, N.Y.).

Eksemplerne 2 og 3 belyser foretrukne udførelsesformer for opfindelsen.

10

Eksempel 1 I dette eksempel beskrives tests, der udføres med fire reagenser, der indeholder hver sin indikator. Følgende fire forskellige indikatorer blev afprøvet: 15 1) o-tolidin, 2) MBTH + N,N-dimethylanilin, 3) MBTH + chromotropsyre og 4) MBTH + primaquin.

Reagenserne fremstilles i form af opløsninger, der indeholder bestanddelene (med undtagelse af bestanddelene fra o-tolidintesten) i de følgende koncentrationer: 0,31 M 20 citrat (pH 7,59), 0,03 M natriumbenzoat, 1 mM EDTA, 147 μΜ NAH, 0,05 mg/ml peberrods-peroxidase og hver 100 μΜ MBTH og tilhørende kobler. Til o-tolidintesten anvendes der 127,5 μΜ o-tolidin, og i stedet for citratpufferen anvendes der 0,02 M kaliumphosphat (pH 7,6). Alle øvrige forbindelser er de samme 25 som ved de tre andre reagenser, der indeholder MBTH + kobler. Reaktionen kan ske ved indføring af salicylathydroxylase til en koncentration på 1,17 μg/ml. Disse reaktioner gennemføres under omgivelsernes betingelser i laboratoriet, og graden af farveudviklingen iagttages med et spektrofotometer 30 "Gilford 2000". Farveudviklingen aflæses for hver indikator ved de bølgelængder, der bestemmes som optimale for hver enkelt forbindelse.

De resultater, der fås ved iagttagelsen af de ovenfor omtalte reaktioner, er angivet i det følgende:

14 DK 162400 B

o ............................

Reduceret indikator Earveudylklmgsgrad Bølgelængde £ QD/mjn.

o-Tolidin 411 0,0000 MBTH + Ν,Ν-dimethylanilin 585 0,0112 5 MBTH + chromotropsyre 565 0,186 MBTH + primaquin 510 0,266

De foranstående resultater viser, at reagenser, der indeholder MBTH + primaquin som indikator, giver farveud-vikling ud fra NADH, medens dette ikke er tilfældet med reagenser, der indeholder o-tolidin.

Eksempel 2 Mælkesyrebestemmelse 15 Diabetikere er udsat for en forøget risiko for udviklingen af mælkesyreacidose. Denne situation kan forværres af det hypoglycæmiske medikament "Phenformin".

Der forefindes således et behov for en mælkesyretest. Ved det her beskrevne forsøg "omdannes" lactat til farve i op-20 løsning og i materialet under anvendelse af reagenser med de følgende sammensætninger:

Reagens Opløsnings- Middel: Første aypn^g test Bnprægneringsopløsntng

Pyrophosphatpuffer, 25 pH=8,0 mol 0,05 0,05 EDTA, mmol 1,0 1,0

Natriumbenzoat mmol 30 30 NAD, mmol 5,25 52,5

Peroxidase, mg/ml 0,005 0,5 30 Polyvinylpyrrolidon, mg/ml - 6,4

Salicylathydroxylase, mg/ml 0,-0117 1,17

Lactatdehydrogenase, mg/ml 0,0017 0,017

Anden dypning MBTH-HC1, mmol 0,1 10 35

Primaquindiphosphat (PDP), 0,1 10 mmol

Benzen Opløsnings- Opløsnings*· middel middel 15

DK 162400 B

I form af en opløsning er det samlede system indeholdt i en enkelt kuvette, og resultaterne af den ved indføringen af vandige lactatopløsninger med de i det følgende nævnte koncentrationer fremkaldte reaktion følges ved iagttagelse 5 af forøgelsen af ekstinktionen ved 510 nm i et spektrofoto-meter.

Til fremstilling af materialerne dyppes særskilte blade af filtrerpapir "Eaton-Dikeman® 205" (Eaton-Dikeman,

Mount Holly Springs, Pa.) hver gang i de ovennævnte impræg-10 neringsopløsninger til mætning. Efter hver imprægnering holdes bladede i et almindeligt laboratorie-varmeskab ved 60°C, indtil de er tørre. Disse papirblade, der indeholder den tørrede remanens fra imrægningsopløsningerne, udskæres derpå i kvadrater med 2,5 mm kantlængde. Materialerne samles 15 dernæst med dobbeltsidige klæbestrimler og befæstiges herved til formstofunderlag. Til udløsning af farveudviklingen udpipetteres vandige lactatopløsninger med de i det følgende nævnte koncentrationer på midlerne. Farveudviklingen følges visuelt eller i et refleksionsspektrofotometer.

20 Såvel i opløsning som ved anvendelse af materialerne bestemmer man lactatkoncentrationer, der omfatter det fysiologiske område for lactat i blodet, dvs. fra 0,6 til 6 mM.

I opløsning skelnes koncentrationerne fra hverandre ved hjæp af farveudviklingens hastighed. Hastigheden af farveud-25 viklingen er angivet som ændringen af den optiske tæthed pr. minut (AOD pr. minut). Jo mere lactat der er til stede, desto hurtigere forløber farveudviklingen. Når der anvendes materialer som de ovennævnte til forsøgene, skelnes koncentrationerne fra hverandre ved hjælp af den i løbet af ét 30 minut iagttagne procentuelle refleksionsgrad. Jo mere lactat der er til stede, desto mere farve dannes der i løbet af ét minut.

Den følgende reaktion med lactatet indtræder under disse testbetingelser ved anvendelse af reagensopløsninger 35 og materialer imprægneret med reagens: 16

DK 162400 B

Opløsning Lactatkoncen- Farveudviklings- tration, mM hastighed (AOD/min. ved 510 ran) 5 7,75 0,576 2,58 0,395 0,65 0,148 0 0,0116

Materiale Lactatkoncen- Refleksionsgrad. i % efter 10 tration, mM 1 minut ved 520 nm 77,5 19,2 7,75 29,1 0,775 40,2 -15 0 54'9

Resultaterne, der er angivet ovenfor for tests såvel i opløsning som under anvendelse af materialer, viser, at reagenset ifølge opfindelsen er virksomt til den kvantitative bestemmelse af mælkesyre i begge former.

20

Eksempel 3

Bestemmelse af ketonstoffer β-Hydroxysmørsyre udgør ca. 80% af de i urinen fundne, totale ketonstoffer. De i øjeblikket til rådighed 25 værende tests til påvisning af ketonstoffer i urinen giver kun en bestemmelse af aceteddikesyre, som kun udgør ca. 20% af ketonstofferne. En test for 3-hydroxysmørsyre er således en værdifuld ketonstoftest.

/3-Hydroxysmørsyre ,,omdannes,, såvel ved hjælp af en 30 reagensopløsning som ved hjælp af et reagensmateriale til farve. Reagenskoncentrationerne ved forsøgene med opløsningen og med de i eksempel 2 fremstillede materialer er de samme som angivet for lactatbestemmelsen i eksempel 2, men med følgende ændringer: 17

DK 162400 B

Reagens Opløsnings- Materialer imprægneret test med reagensopløsninger

NAD 3,5 mM 52,5 mM

β-Hydroxybutyrat- 5 dehydrogenase 0,0017 mg/ml 0,2 mg/ml

Lactatdehydrogenase udeladt udeladt

Polyvinylpyrrolidon " "

Som opløsning er det samlede system til stede i 10 en enkelt kuvette, og forløbet af den ved indføringen af vandige β-hydroxysmørsyreopløsninger med de i det følgende angivne koncentrationer fremkaldte reaktion følges ved iagttagelse af forøgelsen af ekstinktionen ved 510 nm i et spektrofotometer. Materialerne ifølge eksempel 2 fremstilles 15 på den dér beskrevne måde med de ovenstående ændringer i sammensætningen. /3-Hydroxysmørsyreopløsningerne indføres, og farveudviklingen følges visuelt og i et refleksions-spek-trofotometer.

Såvel i opløsning som ved hjælp af reagensmaterialerne 20 bestemmes der koncentrationer af β-hydroxysmørsyre, der omfatter de i urinen fundne koncentrationer. I opløsning skelnes koncentrationerne fra hverandre gennem farveudvik-1ingens hastighed. Når der anvendes materialer til forsøget, skelnes niveauerne fra hverandre ved hjælp af den efter ét 25 minuts forløb iagttagne refleksionsgrad.

Den følgende reaktion med β-hydroxysmørsyren indtræder under disse forsøgsbetingelser ved anvendelse af reagensopløsninger og -materialer:

18 DK 162400 B

® Reagensopløsning Koncentration af Farveudviklings- Ø-hydroxysmørsyren, hastighed mM (A OD/min. ved 510 nm) 2,5 0,152 5.0 0,187 5 10,0 0,201 30,0 0,229

Reagensmateriale Koncentration af Refleksionsgrad i % Ø-hydroxysmørsyren, efter 1 min. ved 510 nm _mM_ _ 10 0 50,8 2,5 34,6 10.0 25,6 30.0 20,9 15

De ved dette forsøg opnåede resultater bekræfter, at reagenset ifølge opfindelsen, såvel i opløsning som i form af et materiale, er virksomt til den kvantitative bestemmelse af β-hydroxysmørsyre.

20 25 30 . 35

Claims

1. Reagens til bestemmelse af et reduceret pyridin-nucleotid eller en analyt, som ved hjælp af dennes analyt-specifikke dehydrogenase danner reducerede pyridin-nucleo- 5 tider, kendetegnet ved, at det omfatter a) en hydroxylase, som er i stand til at frikobles, og et pseudosubstrat, som er i stand til at frikoble hydroxy-lasen, således at denne kan danne hydrogenperoxid i nærværelse af reducerede pyridin-nucleotider, 10 b) en peroxidativt aktiv forbindelse, c) en hydrazonindikator, der omfatter en hydrazon og et koblingsmiddel, hvilken indikator på oxideret form ikke kan reduceres af pyridin-nucleotidet, og d) desuden kan indeholde en analyt-specifik dehydro-15 genase og oxiderende pyridin-nucleotider.

2. Reagens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den peroxidativt aktive forbindelse er peroxidase.

3. Reagens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hydrazonen er 3-methyl-2-benzothiazolinonhydrazon.

4. Reagens ifølge krav 3, kendetegnet ved, at koblingsmidlet er primaquin.

5. Materiale til bestemmelse af en analyt i en prøve, kendetegnet ved, at det omfatter en bærer inkorporeret med et reagens ifølge krav 1.