JPS60164498A - アルコ−ル検出用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、溶液中のアルコール、特にエタノールの濃度
を酵素法で測定する試験片に関するものであり、さらに
詳細には、ニコチンアミド　アデニン　ジヌクレオチド
（以後ＮＡＤと略す）又は。

ニコチンアミド　アデニン　ジヌクレオチドフォスフェ
ート（以後ＮＡＤＰと略す）と、アルコールデヒドロゲ
ナーゼと９色素と、担体とからなるアルコール検出用試
験片に関するルのである。

溶液中のアルコール濃度の測定は１食品工業や化学工業
において、プロセス管理の目的で頬繁に行われている。

アルコールのうち、特にエタノール濃度の測定は、医学
や臨床検査部門において日常的な測定項目であり、また
、交通法規上では重要な検査項目となっている。

溶液中のアルコール測定に利用されてきた多（の化学的
方法は、アルコールの酸化に要した酸化剤の容量的な変
化や酸化剤の色調変化による方法が採用されている。こ
れらの方法はすべて使用する酸化剤がアルコール以外の
様々な揮発性物質と反応しうるため、特異性を欠くとい
う重大な難点がつきまとった。

このため、目的とする物質のみを特異的に測定する物理
化学的な方法として、ガスクロマトグラフィー、　？ｅ
Ｌ体クロマトグラフィーによるアルコールの分析方法が
１９６０年代に開発されたが、それらの方法は正確に定
量ができ、特異的である反面。

分析に長時間を要し、特殊で高価な装置や、それを十分
使いことなくしうる人材の育成が必要であリ、汎用性に
掛け、即時性、実用性に難点があった。

一方、酵素を用いる生化学的分析方法は、化学的方法や
物理化学的方法に比べると一般的に特異性に優れ、装置
的にも特殊なもの、大型のものを用いる必要がない等の
利点があり、この方法として、アルコールデヒドロゲナ
ーゼを用いた方法（スキヤント・ジエイ・クリニ・ラボ
・アンド　インへスト、３５８頁、　１９５１年、ボニ
チェセン筆著；５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、ａ
ｎｄ　Ｉｎｖｅｓｔ、＋　３５８＋　１９５ＬＲ，Ｂｏ
ｎｎｉｃｈｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ）やアルコールオキシダ
ーゼを用いた方法（バイオキミ・バイオフィシ・アクタ
１５１巻３３０〜３４２頁、　１９６８年、ジャンセン
筆著；　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ
、　１５１．３３０〜３４２゜１９６８、　Ｆｒａｎｋ
、　Ｈ，Ｊａｎｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ）が報告されてい
る。これらの方法はいずれも、溶液中で酵素反応を行わ
せ、生成したニコチンアミド　アデニンジヌクレオチド
還元型（以後ＮＡＤＩ＋と略す）を３４０ｎｍで測定し
たり、生成した過酸化水素をパーオキシダーゼの作用で
オルトジアニシジンと反応させ。

その発色を４３６ｎｍで測定したりする方法であり。

またＮＡＤＩＩの測定法として、ジアホラーゼとを色素
を組合せた報告（アーチ・バイオキミ・バイオフィシ・
１３２頁、　１９６９年、カブラン筆著；　Ａｒｃｈ。

旧ｏｃｈｉｍ、旧ｏｃｌ＋ｙｓ、　、　１３２．９１．
１９６９．　Ｆ、にａｐｌａｎｅｔ　ａｌ　）もあるが
°、光学的な方法であるため２分光光度計などの装置は
やはり必要であり、血液や食品などのように混濁したサ
ンプルの場合は測定が不可能であった。また、酵素反応
を行わせるには１種々の試薬を溶解した上で１反応器中
に所定量ずつ分注する操作が必要で、煩雑であり、溶解
した試薬の保存性も悪く、汎用性に欠けている。

このような欠点を克服するために、酵素的方法と電気化
学的方法とを組合せてアルコールを測定する方法が研究
されており、酵素電極法として例えば、特公昭５７−５
６０１９号公報には、アルコールデヒドロゲナーゼ（ア
ルコール脱水素酵素）を用いた方法が記載されている。

この方法は酵素反応でエタノールから生成した水素を酸
化−還元系を用いて電気的に測定するもので、酵素固定
化膜や電気的な測定装置が必要であり、酵素膜は耐久性
に乏しく、液体酵素膜は４℃で２日間、酵素固定化膜で
も２週間の安定性しかなく、実用的でない。

また、測定に要するサンプルも電極を十分ひたず量、す
なわち比較的多量のサンプルが必要と考えられ、臨床検
査に用いる時などは採血する血液量に限度があることか
ら、やはりこの方法も汎用性。

−膜性、実用性に欠けている。

したがって、当業界では持ち運びが容易で・、特別の装
置、技術を要することなく、任意の場所で簡便に、ＩＩ
＆量のサンプルでアルコール濃度が測定できる方法が望
まれながら、それらずぺてを満足する方法のないまま今
日に至っているのが現状である。

本発明者らは、かかる現状に鑑み１食品製造管理、急性
アルコール中毒症の給断や交通取締りの現場から持ち運
びが容易で特別の装置、技術を要することなく、任意の
場所で簡便に、微量のサンプルで、アルコール濃度を検
出することができるアルコールの測定について鋭意研究
を重ねた結果。

ＮＡＤ又はＮへｌ）Ｐと、アルコールデヒドロゲナーゼ
ジアホラーゼと，色素と，担体とからなる試験片が，極
く微量の被検液でも被検液中のアルコールの含有量に応
じて発色又は展色し，アルコール濃度が測定でき．上記
の目的が達成されることを見い出し．本発明を完成する
に至った。

、すなわち、本発明は．（ａ）ＮＡＤ又はＮＡＤＰと。

（ｂ）アルコールデヒドロゲナーゼと．　（Ｃ）ジアホ
ラーゼと．　（ｄ）色素と．　（ｅ）担体とからなるア
ルコール検出用試験片である。

本発明の試験片は．アルコールを含有する溶液を含浸さ
せると．直ちにアルコールと酵素反応を起こし，まずア
ルコールがＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下。

アルコールデヒドロゲナーゼによってアルデヒドとＮＡ
Ｄｌｌ又はＮＡＡｌＩ３返還される段階（反応式−１）
、次に生成したＮＡＩＩｌｌ又はＮＡＤＰＩＩはジアホ
ラーゼによって色素に水素を移され，その結果色素は退
色もしくは発色する段階とからなっている（反応式−２
）。アルコール量の測定は試験片をアルコールを含む溶
液に浸し，その退色あるいは発色の程度や速さを視認す
ることで行われる。　反応式−１ アルコールデヒドロゲナーゼ アルコール アルデヒド 反応式−２ ジアホラーゼ ＮＡ［ｌ　（Ｐ）　Ｈ十色素（酸化型）　ψＮＡＤ（Ｐ
）十色素（還元型） 本発明に用いられる酵素のうち，アルコールデヒドロゲ
ナーゼは，一般に，　Ａｌｃｏｈｏｌ　：　Ｎ＾１〕ｏ
ｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ＋　ＥＣ　Ｌｌ＋１＋１や
　八ｌｃｏｈｏｌ　；　ＮＡＤ（Ｐ）　ｏｘｉｄｏｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅ，　ＥＣ　１＋１＋１＋２に分類される
ものであって，測定しようとするアルコールを脱水素で
きるものならいずれでもよく，例えば、エタノールを測
定しようとする場合は，ウマ肝臓由来，細菌由来のいず
れをも用いることができ，それらはすでに数社より全世
界的に市販されている（ベーリンガー　マン　ハイム山
之内社，オリエンタル酵母社）。また好熱性細菌由来の
アルコールデヒドロゲナーゼを用いる場合には，常法に
従って精製すればよく．例えば、バチルス　ステアロサ
ーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）からアルコールデヒドロゲナーゼ
を精製するには，バイオケミカル　ジャーナル　１２７
巻，３号６３〜６４頁，　１９７２年（Ｂｉｏｃｈｅｍ
．　Ｊ．　１２７．　３．　６３−６４。

１９７２、＾．八へＫＩＮＳＯＮ　）や、エフ、イー、
ビー、ニス、レター、３３巻，１号１〜３頁，　１９７
３年（Ｆ．ｔ！。

Ｂ．Ｓ．　Ｌｅｆｔ．、　３３．　１＋　１〜３＋　１
９７３，　Ｂｒｉｄｇｅｎ．　Ｊｏｈｎ）の方法を用い
ることができる。

またジアホラーゼは＋　ＮＡＤＨ　：　ｌｉｐｏａｎｉ
ｄｅ　ｏｘｉｄｏ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｕ　Ｃ　１．
６．４．３や，ジアホラーゼＮＡＤＨ　：ｄｙｅ　ｏｘ
ｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｕ　Ｃ　１．６．９９に分
類されるものであって，用いる色素を還元できるもので
あればいかなるものでもよく，これもブタ心臓，１！に
生物由来のものがずでに市販されている（ベーリンガー
　マンハイム山之内社，東洋紡社）。また好熱性細菌由
来のジアホラーゼを用いることもでき。

例えばバチルス　ステアロサーモフィラスのジアホラー
ゼを得るには，バイオケミカル　ジャーナル　１９１Ｓ
，　４５７〜４６５頁，　１９８０年（Ｂｉｏｃｈｅｍ
。

Ｊ．　１９１．　４５７〜４６５．　１９８０　）に従
えばよい。

さらにＮＡＤ，　ＮＡ叶も試薬として，例えば各社（ベ
ーリンガーマンハイム山之内社，オリエンタル酵母社，
シグマ社，生化学工業社）から市販されているものを用
いればよい。色素としては，ジアホラーゼの作用によっ
て発色もしくは退色するものならいかなるものでもよく
．例えばフェリシアン化合物や一般にホルマザン色素と
呼ばれるものがあり．前者の例としては，フェリ′シア
ン化カリウム、後者の例としては，ヨードニトロテトラ
ゾリウム塩を用いることができる。またその他の色素と
して，メチレンブルー、２．６ジクロルフエノールイン
ドフエノール、インジゴカルミン、アマランスなどをあ
げることができ，測定者の安全衛生上の観点から安全性
が確認されている色素。

すなわち食品添加物として許可されているものや。

医薬として用いられているインジゴカルミン、アマラン
ス、メチレンブルーを用いるのが好ましい。

このように安全が確認されている色素を用いたアルコー
ル検出用試験片は，唾液中のアルコール濃度の検出に最
適で，交通法規上のエタノール測定にメリットが甚大で
ある。

また、本発明の試験片に用いる担体としては。

常温で水に不溶性もしくは難溶性（溶解度１．０％以下
，２５℃）のものならばいかなるものでもよく。

例えばゼラチン、寒天，サイクロデキストリン。

セルロース、紙，キチン、グルカンなどに代ズされる天
然物の低分子から高分子のものや，レーヨン、ビニロン
、ポリエステル、ある種のポリビニルアルコール、ナイ
ロン、アクリルなどの半合成から合成Ｉｒ１１分子のい
ずれをも用いることができる。

大きさや厚さ．形状は任意のものを用いればよい。

本発明の試験片を作るにあたって，それぞれの試薬の濃
度は次のようにすればよい。例えば、１モル／ｌの濃度
のアルコール検出用試験片を作る場合．色素は０．０１
−１０モル／ｆｆ，好ましくは０．１〜２．０モル／ｌ
ｌ最も好ましくは０．２〜１．０モル／Ｉｌとすればよ
く．アルコールデヒドロゲナーゼやジアホラーゼはそれ
ぞれ１０２〜１０１１ユニット／β、好ましくは１０４
〜１０”ユニッｌ−／　ｌ　、最も好ましくはＩＯ６〜
１０８ユニット／ｌとすればよい。

またＮＡＤやＮＡＤＰは、ｏ、ｏｏｉ〜２．０モル／ｌ
、好ましくは０．０１〜１．５モル／Ｉ！、最も好まし
くは０．１〜１．０モル／ｌとすればよい。これらを熔
解する緩衝液はいかなる種類のものでも用いることがで
きる。そのｐＨ１としては４〜１２．好ましくは６〜１
１゜最も好ましくは７．０〜９，５であればよく、その
濃度としては、　ｏ、ｏｉ〜２ミル２モノｔ、好ましく
はｏ、ｉ〜１．０モル／ｎ、最も好ましくは０．２〜０
．８モル／ｌとすればよい。このような緩衝液としては
。

例えば、トリス−塩酸緩ｉｈ液があげられる。検出しよ
うとするアルコール濃度が１モル／１．より低い時には
、その低い割合に応じて、各成分を減少させればよいが
、実際には酵素反応に要する時間が長くなるので１色素
のみを減少させることが普通である。また、用いる酵素
の性質によって、　ＮＡＤのみ、　ＮＡＤＰのみ、ある
いは両者を一緒に加えζもよい。添加する酵素の単位ユ
ニットとは２国際型位であり、１分間に基質１マイクロ
モルを２５〜３０℃の反応条件で変化させる活性をいう
。

本発明の試験片を作るには１例えば、水不溶性あるいは
難溶性の担体の１部あるいは全部を上記の各試薬の溶解
液に含浸せしめればよく、引き上げた後、そのまま使っ
たり、あるいは乾燥後、使用に供すればよい。大きな担
牽を用いた場合は。

各試薬の熔解液にひたしたのち、適当な大きさ。

例えば幅５ｍｍ、長さ４０ｍｍ　＜らいに細断すればよ
い。

乾燥を行う際には、酵素が元来熱に対して不安定である
ので、低温乾燥や凍結乾燥などを行う方がよい。乾燥し
たものは、室温保存１力月後にも十分使用に供すること
ができる。

本発明の試験片で実際に溶液中のアルコール濃度を測定
するには２例えば測定に適した濃度の試験片を測定する
溶液にひたし、引き上げて室温にてその色素の退色もし
くは発色に要する時間を測定することで行うことができ
る。また色調変化によってもアルコール濃度を測定する
ことができる。

唾液中のアルコール濃度を測定する場合も、唾液にアル
コール検出用試験片をひたし、退色に要する時間を測定
したり、あるいは色調変化を視認することで唾液中のア
ルコール濃度の測定ができる。

本発明のアルコール検出用試験片は、持ち運びが非常に
容易であることはもちろん、ジアホラーゼと色素とが加
わっ′ているために、酵素反応の結果を視認で判断でき
るため２分光光度計や電気化学的な特殊な装置を全く必
要とせず、任意の場所で簡便に、微量のサンプルで短時
間のうちにアルコール濃度を検出することができる。特
に乾燥した試験片は１力月以上の長期保存性に優れてお
り。

さらに、好熱性細菌由来の酵素を用いた場合には。

一層保存性が優れた試験片が得られることから。

急性アルコール中毒の診断のように急を要する場合や、
交通法規上の使用に非常に有益であり９社会生活上、公
衆が得る利益ははかり知れないものがある。

次に本発明を実施例により具体的に説明する。

この実施例で下記の試薬を用いた。

１、　ＮＡＤ又はＮＡＤＰ　、オリエンタル酵母社製。

２、アルコールデヒドロゲナーゼ；オリエンタル酵母社
製カタログ魚　ＡＤＨ−Ｏｆ。

３、ジアホラーゼ；ベーリンガー　マンハイム山之内社
製カタログ１ｌｋＬ　４１１５５８゜なお、アルコール
デヒドロゲナーゼの１ユニツトは、２５℃で１分間に１
マイクロモルのエタノールを消費する酵素量であり、ジ
アホラーゼの１ユニツトは２５℃でヨードニトロテトラ
ゾリウムバイオレット存在下、１分間に１マイクロモル
ＮＡＤＨを消費する酵素量である。

実施例１ メチレンブルー４ミリモル／１．　（以後ｍＭと略す）
、アルコールデヒドロゲナーゼ３４０ユニツト／　ｍ　
ｌ　、ジ°ｒボラーゼ１００ユニット／ｍｌ、）リドン
Ｘ−１００Ｏｎ＋１／　１２　、トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，０）２００　ｍＭ、ＮＡＤ　１０　＋ｍＭの濃度
となるよう調整した溶液を、濾紙（東洋科学製定性濾紙
Ｎ１１２．直径９ｃｍ円型、厚さ０．２６ｍｍ）に含浸
させ、凍結乾燥後９幅５ｍｍ、長さ４０＋ｍの短冊状に
細断して青色の試験片Ｉを得た。

この試験片１を０．５ｇ／ｌのエタノール溶液に浸漬し
、取り出した後、室温に放置し、肉眼で観察したところ
、浸漬部分の青色が退色しはじめ。

１分で無色になった。浸漬するエタノール溶液のエタノ
ール濃度を変化させ、退色に要する時間を測定した所、
エタノール濃度が高（なるにつれて退色に要する時間が
短くなり、エタノール濃度が非常・にうずくなると退色
が完全に行われず１色調がうずくなるにとどまった。

その結果を第１表に示した。

第１表 第１表に示したように、退色に要する時間、その色調変
化を視認することで、溶液中のエタノール濃度を測定す
ることができた。

上記組成よりなる試験片Ｉは、簡便なエタノール検出用
試験片として使用可能であり、室温にて１カ月以上保存
し°ζもその性能は保たれていた。

また試験片Ｉはエタノールに対して反応したが。

メタノールには反応せず、特異性が高いことが確認され
た。

実施例２ 実施例１で示した組成のうち、メチレンブルーをヨード
ニトロテトラゾリウムバイオレット４ｍＭに代えて用い
た以外は実施例１と同様にして試験片■を作製した。試
験片■の作製はすべて暗所で行った。

ｉ！）られた試験片■は白色であり、０．５ｇ／ｌのエ
タノール溶液に浸漬し、取り出した後、室温に放置し、
肉眼で観察した所、浸漬部分が徐々に赤変しはじめ、完
全に赤変し、赤紫色になるのに５０秒を要した。

また、浸漬するエタノール溶液のエタノール濃度を変化
させた所、第２表に示すごとく、相関が見られた。

第２表 第２表に示したように、ヨー１゛ニトロテトラゾリウム
バイオレツトを使用しても、その発色に要する時間や色
調変化から、溶液中のエタノール濃度を測定することが
できた。

上記組成よりなる試験片■は、簡便なエタノール検出用
試験片として使用可能であり、冷暗所保存で１力月以上
その性能が保たれていた。また試験片■はエタノールに
対して反応したが、メタノールには反応せず、特異性が
高いことが確認される。

実施例３ 実施例１に示した組成のうち、アルコールデヒドロゲナ
ーゼとジアホラーゼを、バチルス　ステアロサーモフィ
ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　
ｈｉ−、ｌｕ、ｑ　）由来のものに代えて用いた以外は
実施例１と同様にし′ζ試験片■を得た。

試験片ＩＩを実施例１と同様にして各濃度のエタノール
溶液に浸漬し、その変化を追跡した所、実施例１と全く
同等の結果が得られ、好熱性細菌由来の酵素を用いても
アルコール検出用試験片として使用可能であった。

なお、この試験片■は試験片Ｉよりも保存安定性に優れ
、室温保存で３力月以上その性能を有していた。

実施例４ 実施例３で得られた試験片■を用いて、唾液中のアルコ
ール濃度の測定を実施した。

すなわち１体重６５ｋｇの成人男子に５日本酒３６０ｍ
１を飲酒させ、飲酒１時間後の唾液を採取した。

その唾液中のエタノール濃度をガスクロマトグラフィー
（島津製作所　ＧＣ−３ＢＴ）で測定したところ。

０．５２ｇ／ｌｌのエタノールが含まれていた。

次に、試験片■にこの唾液をしました所、５５秒で濃青
色が白色に退色し、実施例１の結果から。

唾液中に、約０．５ｇ／ｊ！のエタハルが含まれている
と認められた。この結果はガスクロマトグラフィーで得
られた結果とよく一致した。すなわち試験片ｍを用いる
ことによって、唾液中のエタノール濃度を簡便に、測定
しうろことが確認された。

特許出願人　ユニｆ：ｊｔ株ｖｃ会社 手続ネｒｒｉ正書（１釦 昭和５９年　３月２４日 特ｒ「庁長官殿 ■、事件の表示 特Ｊｌｔｌｌ１Ｍ（５９−２０３６”１号２、発明の名
称 アルコール検出用試験片 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　尼崎市東本町１丁目５０番地 名称　（４５０）ユ　ニ　チ　カ　株式会社〒　５４１ 住所　大阪巾東区北久太部町４丁目６８番地名称　ユ　
ニ　チ　カ　株式会社　特許部電話　０６−２８１−５
２５８　（ダイヤルイン）４、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （１）明細書第１買上第２行目の「ヒドロゲナーゼと２
色素」を［ヒドロゲナーゼと、ジアホラーゼと１色素」
と訂正する。

（２）同書第３頁第１行目の「汎用性に掛け」を「汎用
性に欠け」と訂正する。

（３）同書第４頁第２行目の［ジアホラーゼとを色素」
を［ジアホラーゼと色素と」と訂正する。

（４ン同書同頁第４行目の「１３２頁Ｊを「１３２巻、
９１頁」と訂正する。

（５）同書第６頁第１５行目の「返還」を「変換」と８
１正する。

（６）同書第８頁第１１行目のｒ　１ｉｐｏａｎｉｄｅ
　Ｊをｒ　ｌｉｐｏａｍｉｄｅ　Ｊと訂正する。

（７）同書第９頁第１３行目の「２．６ジクロル」を「
２，６−ジクロル」と訂正する。

（８）同書第１２頁第６行目の「供すればよい。」の後
に「また、一層ずつ積層するような方法で作成してもよ
い。」を挿入する。

（９）同書第１３頁第２０行目の「アルコールデヒドロ
ゲナ〜セｊを「アルコールデヒドロケナーゼ」と訂正す
る。

ＱＯＩ同書第１４頁第８行目の［１マイクロモルＮ／１
１１＋１　Ｊを「１マイクロモルのＮＡＤＨＪと訂正す
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ＋１１（ａ）ニコチンアミド　アデニン　ジヌクレオチ
   ド又はニコチンアミド　アデニン　ジヌクレオチドフォ
   スフエイトと、　（ｂ）アルコールデヒドロゲナーゼと
   、　（Ｃ）ジアホラーゼと、　（ｄ）色素と、　（ｅ）
   担体とからなるアルコール検出用試験片。