JP2013172676A - ノンアルコール飲料の品質を保証するキット及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ノンアルコール飲料の品質を保証するキット及び方法の提供。
【解決手段】アルコールデヒドロゲナーゼ、電子受容体、還元系色素及びｐＨ７．８〜９．５の緩衝液を含み、さらに酸化剤を含むノンアルコール飲料の品質保証キット。該キットと試料とを反応させて得られる反応液を目視することで、試料中のアルコールを測定することが可能である。
【選択図】なし

Description

本発明は、ノンアルコール飲料の品質を保証するキット及び方法に関する。

自動車の運転者はアルコール飲料を飲むことができないため、その代替品としてノンアルコールビール等のノンアルコール飲料の需要が高まっている。自動車の運転者がノンアルコール飲料と間違ってアルコール飲料を摂取して飲酒運転することは大きな問題となる。例えば、樽詰のノンアルコール飲料を飲料用容器に注ぎ出して客に提供する際に、樽内や抽出装置の経路内への微生物混入等の影響により、ノンアルコール飲料にアルコールが混入する可能性がある。したがって、ノンアルコール飲料に所定量以上のアルコールが含まれていないという品質を保証することは重要となる。

飲料中のアルコール濃度の測定は、市販の測定キットにより行うことができる（例えば、非特許文献１）。しかしながら、市販の測定キットは、分光光度計等の高額な機器を用いるため、操作が複雑であるという問題点がある。

また、飲料には酸化防止剤としてアスコルビン酸が含まれていることがある。アスコルビン酸の存在により、アルコール濃度の測定が影響を受ける可能性があるという問題点がある。

株式会社ジェイ・ケイ・インターナショナル「Ｆ−キット エタノール」製品カタログ

本発明は、分光光度計等の高額な機器を用いずに、目視だけでアルコールを測定することができる、ノンアルコール飲料の品質を保証するキット及び方法を提供することを目的とする。

本発明は、また、アスコルビン酸の存在の影響を受けずに、正しくアルコールを測定することができる、ノンアルコール飲料の品質を保証するキット及び方法を提供することをも目的とする。

本発明は、ノンアルコール飲料の品質保証キットであって、アルコールデヒドロゲナーゼ、電子受容体、還元系色素及びｐＨ７．８〜９．５の緩衝液を含み、さらに酸化剤を含むキットを提供する。

また本発明は、ノンアルコール飲料の品質を保証する方法であって、試料とアルコールデヒドロゲナーゼ、電子受容体及び緩衝液とを混合してｐＨ７．０〜９．０の反応液１を得る工程、反応液１と酸化剤とを混合して反応液２を得る工程、反応液２と還元系色素とを混合して反応液３を得る工程及び反応液３の色を目視することで試料中のアルコールを測定する工程を含む方法を提供する。

上記キット及び方法によれば、０．００５％（ｗ／ｖ）以上のアルコールを１０分程度の短時間で目視によりアルコールを測定することが可能である。分光光度計を用いずに目視のみで測定することができるため、使用する場所や人を選ばず、簡便に測定することが可能である。

また、上記キット及び方法によれば、試料中のアスコルビン酸の存在に影響を受けずに、正しくアルコールを測定することが可能である。

また、上記キット及び方法によれば、試料中の夾雑物に影響を受けずにアルコールを測定することが可能であるため、試料を希釈することなくそのまま測定できるという利点がある。希釈をせずに測定できるため、アルコール分が非常に低いノンアルコール飲料の品質保証、例えば対象となるノンアルコール飲料に０．００５％（ｗ／ｖ）以上のアルコール分が含まれないことを保証するのに適している。

上記キット及び方法において、電子受容体は、ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体、及びニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体、の組み合わせであることが好ましく、ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体は、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であることが好ましく、ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体は、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシフェナジンメトサルフェート、メルドラブルー又はジアホラーゼであることが好ましく、テトラゾリウム塩は、ニトロテトラゾリウムブルー、テトラゾリウムブルー、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド、２，３−ビス−（２−メトシキ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノソジウム、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノソジウム又は２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムであることが好ましく、緩衝液は、ｐＨ８．４〜９．５の緩衝液であることが好ましい。また、上記方法は、試料とアルコールデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体及び緩衝液とを混合してｐＨ７．０〜９．０の反応液１を得る工程、反応液１と酸化剤とを混合して反応液２を得る工程及び反応液２とニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体及び還元系色素とを混合して反応液３を得る工程反応液３の色を目視することで試料中のアルコールを測定する工程を含むことが好ましい。さらに、上記反応において、反応液１がｐＨ７．２〜８．７になるように調整することが好ましい。これらの構成とすることで、より高感度に、より短時間で、アルコールの測定が可能である。

本発明に係るノンアルコール飲料の品質保証キット及び方法によれば、分光光度計等の機器を用いずに、目視だけでアルコールを測定することができる。また、本発明に係るノンアルコール飲料の品質保証キット及び方法によれば、高感度に、かつ短時間で、目視によりアルコールを測定することができる。さらに、本発明に係るノンアルコール飲料の品質保証キット及び方法によれば、アスコルビン酸の存在の影響を受けずに、正しくアルコールを測定することができる。

アルコール測定の概略図を示す。 反応液１のｐＨを変化させたときの反応液２のΔＡｂｓ_５７０（超純水と５０ｐｐｍのエタノールを添加した超純水とのＡｂｓ_５７０の差）を表すグラフである。 反応液１のｐＨを変化させたときの反応液２のΔＡｂｓ_５７０（ノンアルコールビールテイスト飲料と５０ｐｐｍのエタノールを添加したノンアルコールビールテイスト飲料とのＡｂｓ_５７０の差）を表すグラフである。 緩衝液としてグリシン緩衝液又はピロリン酸緩衝液を用いた時の反応液２のΔＡｂｓ_５７０（超純水と５０ｐｐｍのエタノールを添加した超純水とのＡｂｓ_５７０の差）を表すグラフである。 緩衝液としてグリシン緩衝液又はピロリン酸緩衝液を用いた時の反応液２のΔＡｂｓ_５７０（ノンアルコールビールテイスト飲料と５０ｐｐｍのエタノールを添加したノンアルコールビールテイスト飲料とのＡｂｓ_５７０の差）を表すグラフである。 反応液１のｐＨを変化させたときの反応液１のΔＡｂｓ_３４０（超純水と５０ｐｐｍのエタノールを添加した超純水とのＡｂｓ_３４０の差）を表すグラフである。 ヨウ化カリウムを添加の有無による、Ａｂｓ_３４０の変化を表すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について、より詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。

用語の定義

本明細書における「ノンアルコール飲料」とは、１％（ｗ／ｖ）未満のアルコール分を含む飲料をいう。「ノンアルコール飲料」のアルコール分は、好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）未満であり、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）未満であり、さらに好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）未満である。飲料の種類は問わず、例えば、ビールテイスト飲料、ワインテイスト飲料、スパークリングワインテイスト飲料、日本酒テイスト飲料、焼酎テイスト飲料及びカクテルテイスト飲料などが挙げられる。最も好ましい「ノンアルコール飲料」とは、アルコール分が０．００５％（ｗ／ｖ）未満であるビールテイスト飲料である。

本明細書における「品質保証」とは、ノンアルコール飲料に所定量以上のアルコールが混入していないことの保証をいう。例えば、測定するノンアルコール飲料がＸ％（ｗ／ｖ）未満のアルコール分を含むことを謳った商品である場合、その商品にＸ％（ｗ／ｖ）以上のアルコール分が含まれていないことを保証することをいう（Ｘは１以下の数値）。

本明細書における「アルコール」とは、エタノールをいう。

ノンアルコール飲料の品質保証キット
本実施形態にかかるキットは、アルコールデヒドロゲナーゼ、電子受容体、還元系色素及び
ｐＨ７．８〜９．５の緩衝液を含み、さらに酸化剤を含む。

本キットによるアルコール測定の概略を説明する。アルコールが存在するとアルコールデヒドロゲナーゼによりアルデヒドへと酸化される。同時に、電子受容体が還元される。還元された電子受容体が還元系色素を還元して発色性の色素が形成され、これを目視することでアルコールの測定が可能となる。しかしながら、アスコルビン酸が存在すると、アルコールデヒドロゲナーゼの反応とは無関係に電子受容体を還元する。酸化剤は、アスコルビン酸による電子受容体の還元を抑制するため、アスコルビン酸が含まれている試料でも正確なアルコール測定が可能である。

電子受容体は単一の化合物の酸化型／還元型であってもよいが、電子授受の効率の観点から複数の化合物の酸化型／還元型の組み合わせであることが好ましい。

別の実施形態にかかるキットは、アルコールデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体、ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体、還元系色素及びｐＨ７．８〜９．５の緩衝液を含み、さらに酸化剤を含む。

この実施形態にかかるキットによるアルコール測定の概略図を図１に示す。図１は、分かり易さのために、特定の化合物で説明しているが、本発明はこれらの化合物に限定されるものではない。アルコールが存在するとアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によりアルデヒドへと酸化される。同時に、ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体（ＮＡＤ^＋）は還元型（ＮＡＤＨ）へと還元される。ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体が存在すると、ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体（ＮＡＤＨ）は酸化型（ＮＡＤ^＋）へと酸化される一方、ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体は酸化型（酸化型ＰＭＳ）から還元型（還元型ＰＭＳ）となる。この還元型（還元型ＰＭＳ）がテトラゾリウム塩（ＮＴＢ）を還元して発色性のホルマザン（ジホルマザン）が形成され、これを目視することでアルコールの測定が可能となる。

また、アスコルビン酸は、ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体（ＮＡＤＨ）とは独立して、ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体を酸化型（酸化型ＰＭＳ）から還元型（還元型ＰＭＳ）とする。これにより、アルコールが存在しなくてもアスコルビン酸が存在することで、発色性のホルマザンが形成され、正しくアルコールの測定ができない可能性がある。しかし、ヨウ化カリウムが存在することで、アスコルビン酸とニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体との反応を阻害することができる。

酸化剤として、例えば、ヨウ化カリウム、ヨウ素液（ヨウ素ヨウ化カリウム溶液）、Ｃｕ^２＋を含む溶液、Ｆｅ^３＋を含む溶液及び過酸化水素水などが挙げられる。Ｃｕ^２＋を含む溶液として、例えば、硝酸銅（II）溶液、硫酸銅（II）溶液などが挙げられる。Ｆｅ^３＋を含む溶液として、例えば、硝酸鉄（III）溶液、硫酸鉄（III）溶液などが挙げられる。アスコルビン酸の抑制効果の観点から、ヨウ化カリウム又はヨウ素液が好ましい。

ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体として、例えば、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ^＋）などが挙げられる。

ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体として、例えば、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシフェナジンメトサルフェート、メルドラブルー、ジアホラーゼ、ジクロロフェノールインドフェノール及びフェリシアン化物（フェリシアン化カリウムなど）などが挙げられる。

還元系色素とは、還元されることで発色する色素又は還元されることで色が変化する色素をいい、例えば、テトラゾリウム塩が挙げられる。

テトラゾリウム塩として、例えば、ニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）、テトラゾリウムブルー（ＴＢ）、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２，３−ビス−（２−メトシキ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド（ＸＴＴ）、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノソジウム（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノソジウム（ＷＳＴ−３）及び２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＷＳＴ−８）が挙げられる。テトラゾリウム塩が還元されるとホルマザンへと変化するが、ホルマザンの吸収極大波長が４００ｎｍ〜６００ｎｍ程度にあることで、黄色〜赤紫色の発色が生じる。

ｐＨ７．８〜９．５の緩衝液は、アルコール、アルコールデヒドロゲナーゼ及び電子受容体の反応において用いられる。その後の、酸化剤との反応及び還元系色素との反応にそのまま用いても構わない。アルコール、アルコールデヒドロゲナーゼ及び電子受容体の反応にｐＨ７．８〜９．５の緩衝液を用いることにより、短時間で効率よく反応させることが可能となり、その結果、還元型の電子受容体が生成することになる。十分量の電子受容体が存在することにより、還元系色素との反応が短時間で効率よく進む。このように、ｐＨ７．８〜９．５の緩衝液を用いることで、アルコールを高感度に、かつ短時間で、測定することが可能となる。より高感度かつ短時間の測定のために、ｐＨ８．４〜９．５の緩衝液を用いることが好ましい。

キットが、アルコールデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体、ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体、還元系色素、ｐＨ７．８〜９．５の緩衝液及び酸化剤を含む場合、ｐＨ７．８〜９．５の緩衝液は、アルコール、アルコールデヒドロゲナーゼ及びニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体の反応において用いられる。その後の、酸化剤との反応並びにニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体及び還元系色素との反応にそのまま用いても構わない。アルコール、アルコールデヒドロゲナーゼ及びニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体の反応にｐＨ７．８〜９．５の緩衝液を用いることにより、短時間で効率よく反応させることが可能となり、その結果、十分量のニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体が生成することになる。十分量のニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体が存在することにより、ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体及び還元系色素との反応が短時間で効率よく進む。このように、ｐＨ７．８〜９．５の緩衝液を用いることで、アルコールを高感度に、かつ短時間で、測定することが可能となる。より高感度かつ短時間の測定のために、ｐＨ８．４〜９．５の緩衝液を用いることが好ましい。

緩衝液は上述の通り、アルコール、アルコールデヒドロゲナーゼ及び電子受容体の反応又はアルコール、アルコールデヒドロゲナーゼ及びニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体の反応において用いられるが、この反応液のｐＨを７．０〜９．０、好ましくは７．２〜８．７に調整できる緩衝液が選択される。試料の種類及び試料に対する緩衝液の体積比率などによって反応液のｐＨは変化するが、測定する試料に応じて、緩衝液の種類、ｐＨ、試料に対する緩衝液の体積比率を適宜選択することにより、反応液のｐＨを所定の範囲に調整することが可能である。

緩衝液の種類は特に限定されないが、例えば、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、グリシン緩衝液、トリシン緩衝液及びピロリン酸緩衝液などが挙げられる。反応速度の観点から、トリス緩衝液が好ましい。当業者にとって周知の通り、塩酸などの酸及び水酸化ナトリウムなどのアルカリを適宜加えることで、所望のｐＨに調整可能である。

キットの各構成要素の提供形態は溶液でも粉末でもよい。粉末の場合、使用時に水を適量加えることで溶液とすることができる。

キットの各構成要素は、個別の容器に収容されていてもよく、そのままの状態では直接反応しない構成要素同士であれば混合物として一緒の容器に収容されていてもよい。

キットの上記構成要素に加えて、一般的にキットに含まれる構成要素をさらに含んでいてもよい。例えば、水、キットの使用方法が記載された説明書、安定化剤、界面活性剤、反応停止試薬、アルコール標準液、反応容器及び色見本などが挙げられる。

反応停止試薬は発色反応を停止させる試薬であり、所定時間経過後に反応を停止させることで、より正確なアルコールの測定が可能となる。反応停止試薬としては、例えば、塩酸が挙げられる。

アルコール標準液を用いた反応液の色と試料を用いた反応液の色とを比較することで、より正確なアルコールの測定が可能となる。また、複数濃度のアルコール標準液又は単一濃度のアルコール標準液を適宜希釈したものを用いた反応液と、試料を用いた反応液の色とを比較することで、試料のアルコール濃度を半定量的に測定することも可能である。

色見本とは、予め所定濃度のアルコールを用いた際の発色を印刷したものであり、試料を用いた反応液の色と色見本を比較することで、より正確なアルコールの測定が可能となったり、試料のアルコール濃度を半定量的測定が可能となったりする。

発色時の反応液の量が多すぎると取り扱いが面倒となる傾向があり、少なすぎると発色の確認が困難となる傾向がある。したがって、発色時の反応液の量が１００μｌ〜５０ｍｌ程度となるように、キットの各構成要素の量及び濃度を調節することが好ましい。より具体的には、試料約２０μｌ〜約１０ｍｌに対して、各構成要素又は構成要素の混合物を１滴〜５滴約２０μｌ〜約１０ｍｌ添加することが好ましい。

ノンアルコール飲料の品質を保証する方法
本実施形態にかかる方法は、試料とアルコールデヒドロゲナーゼ、電子受容体及び緩衝液とを混合してｐＨ７．０〜９．０の反応液１を得る工程、反応液１と酸化剤とを混合して反応液２を得る工程、反応液２と還元系色素とを混合して反応液３を得る工程及び反応液３の色を目視することで試料中のアルコールを測定する工程を含む。

別の実施形態にかかる方法は、試料とアルコールデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体及び緩衝液とを混合してｐＨ７．０〜９．０の反応液１を得る工程、反応液１と酸化剤とを混合して反応液２を得る工程、反応液２とニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体及び還元系色素とを混合して反応液３を得る工程及び反応液３の色を目視することで試料中のアルコールを測定する工程を含む。

試料とは、ノンアルコール飲料自体及びノンアルコール飲料を提供する樽の洗浄液などの品質を保証したいノンアルコール飲料へのアルコールの混入が予想される任意の試料をいう。試料は、アスコルビン酸が含まれている又は含まれていると予想される試料であることが好ましい。

本実施形態にかかる方法の測定原理及び各構成要素については、本実施形態にかかるキットの項で説明した通りである。

反応液１を得る工程における反応温度は、取り扱いの容易さ及び迅速な反応の観点から、室温が好ましく、常温がより好ましい。室温とは１℃〜３０℃であり、常温とは１５℃〜２５℃である。反応液１を得る工程における反応時間は、通常、１分〜１０分である。反応液１におけるアルコールデヒドロゲナーゼの濃度は０．５Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌであることが好ましく、商業利用の観点から、０．５Ｕ／ｍｌ〜３Ｕ／ｍｌであることがより好ましい。電子受容体又はニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体の濃度は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．１％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。

反応液２を得る工程における反応温度は、取り扱いの容易さ及び迅速な反応の観点から、室温が好ましく、常温がより好ましい。反応液２を得る工程における反応時間は、通常、１０秒〜２分である。酸化剤の濃度は種類によって異なるが、例えば、ヨウ化カリウムの濃度は０．５％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。

反応液３を得る工程における反応温度は、取り扱いの容易さ及び迅速な反応の観点から、室温が好ましく、常温がより好ましい。反応液２を得る工程における反応時間は、通常、１分〜５分である。反応液３におけるニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体の濃度は０．０００５％（ｗ／ｖ）〜０．０１％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、還元系色素の濃度は、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．１％（ｗ／ｖ）であることが好ましい。

反応液３を得る工程と反応液３の色を目視することで試料中のアルコールを測定する工程との間に、反応停止試薬を添加して反応液３の反応を停止させる工程を含んでいてもよい。反応液３の反応時間を一定にすることで、より正確なアルコールの測定が可能となる。

反応液３の色を目視することで試料中のアルコールを測定する工程は、試料の反応液のみで判断してもよいが、より正確な測定のためには、本実施形態にかかるキットの項で説明したような、アルコール標準液を使用した反応液と比較を行ったり、色見本との比較を行ったりすることが好ましい。

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例で使用する略語は以下のとおりである。
ＡＤＨ：アルコールデヒドロゲナーゼ
ＮＡＤ^＋：酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ＮＡＤＨ：還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ＮＴＢ：ニトロテトラゾリウムブルー
ＰＭＳ：フェナジンメトサルフェート
トリス：トリスヒドロキシメチルアミノメタン

特に明記しない限り、以下の実施例において％はｗ／ｖ％を意味する。

試験例１：ｐＨの影響
試料とＡＤＨとの反応時のｐＨを変化させたときに、アルコールの検出感度にどのような影響を及ぼすかについて調べた。緩衝液１００μｌ、試料１００μｌ、０．４％ ＮＡＤ^＋水溶液２０μｌ及び１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＨ溶液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）２０μｌを混合し反応液１を得た。反応液１を室温で０〜２５分間放置して反応させた。その後、反応液１に０．０１％ ＰＭＳ及び０．１％ ＮＴＢの水溶液２０μｌを添加し反応液２を得た。反応液２を室温で２分間放置して反応させた。その後、反応液２に１Ｎ 塩酸２０μｌを添加して反応を停止した。反応液１のｐＨを測定した。また、反応停止後の反応液２の５７０ｎｍの吸光度を測定した。また、反応液２の色を目視し、試料中のアルコールの有無による発色の相違を区別できるかどうかを調べた。

試料は、超純水及び市販のノンアルコールビールテイスト飲料Ａ並びにそれらに５０ｐｐｍのエタノールを添加したものを用いた。エタノールを添加した試料の吸光度からエタノールを添加していない試料の吸光度を引いた数値（ΔＡｂｓ）を評価指標とした。

緩衝液には、０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ５．８、７．４、８．４、８．９、９．６、及び１２．７；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）を用いた。

結果を表１〜２及び図２〜３にまとめた。表１及び図２は、試料に超純水及び５０ｐｐｍのエタノールを添加した超純水の結果をまとめたものであり、表２及び図３は、試料にノンアルコールビールテイスト飲料及び５０ｐｐｍのエタノールを添加したノンアルコールビールテイスト飲料の結果をまとめたものである。表中の「目視による区別」とは、反応液１の反応時間を５分間とした場合に、５０ｐｐｍのエタノール添加により反応液２の発色を目視で区別できるか否かを表したものである。

表１及び図２から明らかなように、試料が超純水の場合には、緩衝液のｐＨが７．４〜８．９の範囲であれば、５０ｐｐｍのエタノールの添加の有無によるΔＡｂｓが十分大きく、また目視により発色の相違を区別することが可能であった。このとき、反応液１のｐＨは７．２〜８．７であった。また、表２及び図３から明らかなように、試料がノンアルコールビールテイスト飲料の場合には、緩衝液のｐＨが８．４〜９．６の範囲であれば、５０ｐｐｍのエタノールの添加の有無によるΔＡｂｓが十分大きく、また目視により発色の相違を区別することが可能であった。このとき、反応液１のｐＨは７．８〜８．６であった。

試験例２：緩衝液の種類
緩衝液として０．１ｍｏｌ／ｌ グリシン水酸化ナトリウム緩衝液又は０．１ｍｏｌ／ｌ ピロリン酸ナトリウム塩酸緩衝液を用いて、試験例１と同様の試験を行った。試料は、試験例１と同様に超純水及び市販のノンアルコールビールテイスト飲料並びにそれらに５０ｐｐｍのエタノールを添加したものを用いた。緩衝液のｐＨは、反応液１のｐＨが８．６となるものを使用した。すなわち、試料が超純水の場合は、ｐＨ８．６のグリシン水酸化ナトリウム緩衝液又はｐＨ８．６のピロリン酸ナトリウム塩酸緩衝液を用い、試料がノンアルコールビールテイスト飲料の場合は、ｐＨ９．５のグリシン水酸化ナトリウム緩衝液又はｐＨ９．４のピロリン酸ナトリウム塩酸緩衝液を用いた。（各緩衝液は、全て１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有。）

結果を表３〜４及び図４〜５にまとめた。表３及び図４は、試料に超純水及び５０ｐｐｍのエタノールを添加した超純水の結果をまとめたものであり、表４及び図５は、試料にノンアルコールビールテイスト飲料及び５０ｐｐｍのエタノールを添加したノンアルコールビールテイスト飲料の結果をまとめたものである。

表３〜４及び図４〜５から明らかなように、緩衝液としてグリシン水酸化ナトリウム緩衝液又はピロリン酸ナトリウム塩酸緩衝液を用いた場合も、５０ｐｐｍのエタノールの添加の有無によるΔＡｂｓが十分大きく、また目視により発色の相違を区別することが可能であった。

試験例３：反応液１中のＮＡＤＨ量
緩衝液のｐＨを変化させたときに、反応液１中のＮＡＤＨ量にどのような影響を及ぼすかを調べた。トリス塩酸緩衝液（７．４、８．４、８．９、９．６及び１２．７；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）１００μｌ、試料１００μｌ、０．４％ ＮＡＤ^＋水溶液２０μｌ及び１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＨ溶液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）２０μｌを混合し反応液１を得た。反応液１を室温で０〜２５分間放置して反応させた。反応液１の３４０ｎｍの吸光度を測定した。試料は、超純水及び５０ｐｐｍのエタノールを添加した超純水を用いた。エタノールを添加した試料の吸光度からエタノールを添加していない試料の吸光度を引いた数値（ΔＡｂｓ）を、ＮＡＤＨ量として評価した。

結果を表５及び図６にまとめた。緩衝液のｐＨにより、ＡＤＨの反応速度が異なり、それにより反応液１中のＮＡＤＨ量が異なることが分かった。反応液２の発色の相違は、反応液１中のＮＡＤＨ量の相違に起因するものと推測できる。

試験例４：併行精度の確認
０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）１００μｌ、試料１００μｌ、０．４％ ＮＡＤ^＋水溶液２０μｌ及び１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＨ溶液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）２０μｌを混合し反応液１を得た。反応液１を室温で５分間放置して反応させた。その後、反応液１に０．０１％ ＰＭＳ及び０．１％ ＮＴＢの水溶液２０μｌを添加し反応液２を得た。反応液２を室温で２分間放置して反応させた。その後、反応液２に１Ｎ 塩酸２０μｌを添加して反応を停止した。試料として、ノンアルコールビールテイスト飲料及び３０ｐｐｍのエタノールを添加したものを用いた。試料を各６つ用意して、併行精度を確認した。表６に示した結果から明らかなように、良好な併行精度を示した。

試験例５：日間再現性の確認
０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）１００μｌ、試料１００μｌ、０．４％ ＮＡＤ^＋水溶液２０μｌ及び１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＨ溶液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）２０μｌを混合し反応液１を得た。反応液１を室温で５分間放置して反応させた。その後、反応液１に０．０１％ ＰＭＳ及び０．１％ ＮＴＢの水溶液２０μｌを添加し反応液２を得た。反応液２を室温で２分間放置して反応させた。その後、反応液２に１Ｎ 塩酸２０μｌを添加して反応を停止した。試料として、ノンアルコールビールテイスト飲料及び３０ｐｐｍのエタノールを添加したものを用いた。測定日を異なる５日として、日間再現性を確認した。表７に示した結果から明らかなように、良好な日間再現性を示した。

試験例６：酵素保存試験
０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）１００μｌ、試料１００μｌ、０．４％ ＮＡＤ^＋水溶液２０μｌ及び１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＨ溶液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）２０μｌを混合し反応液１を得た。反応液１を室温で５分間放置して反応させた。その後、反応液１に０．０１％ ＰＭＳ及び０．１％ ＮＴＢの水溶液２０μｌを添加し反応液２を得た。反応液２を室温で２分間放置して反応させた。その後、反応液２に１Ｎ 塩酸２０μｌを添加して反応を停止した。試料として、ノンアルコールビールテイスト飲料及び３０ｐｐｍのエタノールを添加したものを用いた。ＡＤＨ溶液を調製後、４℃の冷蔵庫に保存し、ＡＤＨ溶液の保存期間により吸光度がどのように変化するか調べた。結果を表８に示した。ＡＤＨ溶液の保存に伴い、吸光度が低下する傾向が認められた。しかし、３１日保存したＡＤＨ溶液を使用した場合でも、３０ｐｐｍのエタノール添加の有無により十分なΔＡｂｓが認められ、目視による区別も可能であった。

試験例７：アスコルビン酸のアルコール測定への影響
アスコルビン酸がアルコール測定に及ぼす影響について調べた。まずは、ＰＭＳ及びＮＴＢを含む溶液とアスコルビン酸との反応について調べた。０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）１００μｌ、試料１００μｌ並びに０．０１％ ＰＭＳ及び０．１％ ＮＴＢの水溶液２０μｌを添加し、室温で２０秒間放置して反応させた。反応液に１Ｎ 塩酸２０μｌを添加して反応を停止し、５７０ｎｍの吸光度を測定した。試料として、超純水及び１０、５０、１００又は５００ｐｐｍのアスコルビン酸を添加した超純水を用いた。結果を表９に示す。表９から明らかなように、アスコルビン酸の添加量が増加するにつれ、５７０ｎｍの吸光度も増大した。また、反応液を目視観察したところ、アスコルビン酸濃度が１０ｐｐｍでは薄紫色が認められ、アスコルビン酸濃度が濃くなるにつれて色が濃くなり、アスコルビン酸濃度が５００ｐｐｍでは濃青色であった。

次に、エタノール及びアスコルビン酸を含む試料を用いて、アルコール測定を行った。０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）１００μｌ、試料１００μｌ、０．４％ ＮＡＤ^＋水溶液２０μｌ及び１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＨ溶液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）２０μｌを混合し反応液１を得た。反応液１を室温で５分間放置して反応させた。その後、反応液１に０．０１％ ＰＭＳ及び０．１％ ＮＴＢの水溶液２０μｌを添加し反応液２を得た。反応液２を室温で２分間放置して反応させた。その後、反応液２に１Ｎ 塩酸２０μｌを添加して反応を停止し、５７０ｎｍの吸光度を測定した。試料として、５００ｐｐｍのアスコルビン酸水溶液及びそこに１０、３０、５０又は１００ｐｐｍのエタノールを添加したものを用いた。結果を表１０に示す。表１０から明らかなように、エタノール濃度を変化させても、吸光度の数値が大きすぎるため、適切な測定が行えない。また、反応液を目視観察したところ、すべて濃青色となり区別できなかった。

試験例８：ヨウ化カリウムによるアスコルビン酸による影響の抑制
０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）１００μｌ、試料１００μｌ、０．４％ ＮＡＤ^＋水溶液２０μｌ及び１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＨ溶液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）２０μｌを混合し反応液１を得た。反応液１を室温で５分間放置して反応させた。その後、反応液１に２０％ヨウ化カリウム水溶液を１０又は２０μｌ添加し反応液２を得た。反応液２を室温で１．５分間放置して反応させた。反応液２に０．０１％ ＰＭＳ及び０．１％ ＮＴＢの水溶液２０μｌを添加し反応液３を得た。反応液３を室温で２分間放置して反応させた。その後、反応液３に１Ｎ 塩酸２０μｌを添加して反応を停止し、５７０ｎｍの吸光度を測定した。試料として、超純水、５００ｐｐｍのアスコルビン酸水溶液、及びそれらに５０又は１００ｐｐｍのエタノールを添加したものを用いた。結果を表１１に示す。表１１から明らかなように、ＫＩの添加によりアスコルビン酸による影響を抑制することができ、エタノールの測定が可能となった。また、反応液３を目視観察したところ、ＫＩを添加しなかった場合のアスコルビン酸水溶液ではすべて濃青色となり区別できなかったが、ＫＩを１０又は２０μｌ添加した場合のアスコルビン酸水溶液では、エタノール添加量が０及び５０ｐｐｍの試料の色の違いを区別することができた。

次に、アスコルビン酸を含むノンアルコールビールテイスト飲料を試料に用いて、アルコール測定を行った。０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）１００μｌ、試料１００μｌ、０．４％ ＮＡＤ^＋水溶液２０μｌ及び１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＨ溶液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）２０μｌを混合し反応液１を得た。反応液１を室温で５分間放置して反応させた。その後、反応液１に２０％ヨウ化カリウム水溶液を２０又は３０μｌ添加し反応液２を得た。反応液２を室温で１．５分間放置して反応させた。反応液２に０．０１％ ＰＭＳ及び０．１％ ＮＴＢの水溶液２０μｌを添加し反応液３を得た。反応液３を室温で２分間放置して反応させた。その後、反応液３に１Ｎ 塩酸２０μｌを添加して反応を停止し、５７０ｎｍの吸光度を測定した。試料として、市販のノンアルコールビールテイスト飲料Ｂ、及びそれに５０又は１００ｐｐｍのエタノールを添加したものを用いた。結果を表１２に示す。表１２から明らかなように、ＫＩの添加によりアスコルビン酸による影響を抑制することができ、エタノールの測定が可能となった。また、反応液３を目視観察したところ、ＫＩを添加しなかった場合のノンアルコールビールテイスト飲料ではすべて濃青色となり区別できなかったが、ＫＩを１０又は２０μｌ添加した場合のノンアルコールビールテイスト飲料では、エタノール添加量が０及び５０ｐｐｍの試料の色の違いを区別することができた。

試験例９：ヨウ化カリウムによるＮＡＤＨへの影響
ヨウ化カリウムがＮＡＤＨ量に及ぼす影響について調べた。０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）１００μｌ、試料１００μｌ、０．４％ ＮＡＤ^＋水溶液２０μｌ及び１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＨ溶液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）２０μｌを混合し反応液１を得た。反応液１を室温で１５分間放置して反応させた。反応開始１５分後に、反応液１に２０％ヨウ化カリウム水溶液又は超純水を３０μｌ添加し反応液２を得た。反応液２を室温で放置して反応させた。反応液１又は２の３４０ｎｍの吸光度を測定して、ＮＡＤＨ量を測定した。試料として、超純水及び３０ｐｐｍのエタノールを添加した超純水を用いた。結果を表１３及び図８に示す。図８は、試料として３０ｐｐｍエタノール水溶液を用いた場合に、ヨウ化カリウムの添加の有無について比較したグラフである。表１３及び図８から明らかなように、ヨウ化カリウムの添加以降のＮＡＤＨ量はほぼ一定となった。この結果から、ヨウ化カリウムの添加は、ＡＤＨの反応を阻害するがＮＡＤＨの分解は行わないことが推測される。したがって、ヨウ化カリウムがＡＤＨの反応時に存在すると適切なアルコール測定が行えない可能性があり、ＡＤＨの反応によりＮＡＤＨが十分生成した後にヨウ化カリウムを添加する必要があることが示唆された。

試験例１０：種々の酸化剤によるアスコルビン酸による影響の抑制
種々の酸化剤によるアスコルビン酸による影響の抑制効果を調べた。０．１ｍｏｌ／ｌ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９；１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有）１００μｌ、試料１００μｌ、０．４％ ＮＡＤ^＋水溶液２０μｌ及び１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＨ溶液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）２０μｌを混合し反応液１を得た。反応液１を室温で５分間放置して反応させた。その後、反応液１に酸化剤を添加し反応液２を得た。反応液２を室温で１．５分間放置して反応させた。反応液２に０．０１％ ＰＭＳ及び０．１％ ＮＴＢの水溶液２０μｌを添加し反応液３を得た。反応液３を室温で２分間放置して反応させた。その後、反応液３に１Ｎ 塩酸２０μｌを添加して反応を停止し、５７０ｎｍの吸光度を測定した。試料として、５００ｐｍのアスコルビン酸水溶液、及びそれに１００ｐｐｍのエタノールを添加したものを用いた。酸化剤として、１０００ｐｐｍの硝酸銅（ＩＩ）の０．１ｍｏｌ／ｌ硝酸溶液、１０００ｐｐｍの硝酸鉄（ＩＩＩ）の０．１ｍｏｌ／ｌ硝酸溶液、３０％過酸化水素水、２０％ヨウ化カリウム水溶液及び０．１２％ヨウ素液を用いた。結果を表１４に示す。表１４から明らかなように、酸化剤の添加によりアスコルビン酸による影響を抑制をすることができた。また、目視でも、エタノール１００ｐｐｍの添加の有無による、反応液の色の相違を確認することができた。酸化剤の中でも、ヨウ化カリウム及びヨウ素液は吸光度差が大きく、また目視による色の相違の区別も容易であった。

Claims (18)

1. ノンアルコール飲料の品質保証キットであって、
   アルコールデヒドロゲナーゼ、
   電子受容体、
   還元系色素及び
   ｐＨ７．８〜９．５の緩衝液を含み、
   さらに酸化剤を含むキット。
2. 酸化剤が、ヨウ化カリウム、ヨウ素液、Ｃｕ^２＋を含む溶液、Ｆｅ^３＋を含む溶液又は過酸化水素水である、請求項１記載のキット。
3. 電子受容体が、
   ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体、及び
   ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体、
   の組み合わせである、請求項１又は２記載のキット。
4. ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である、請求項３記載のキット。
5. ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシフェナジンメトサルフェート、メルドラブルー又はジアホラーゼである、請求項３又は４記載のキット。
6. 還元系色素が、テトラゾリウム塩である、請求項１〜５のいずれか一項記載のキット。
7. テトラゾリウム塩が、ニトロテトラゾリウムブルー、テトラゾリウムブルー、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド、２，３−ビス−（２−メトシキ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノソジウム、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノソジウム又は２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムである、請求項６記載のキット。
8. 緩衝液が、ｐＨ８．４〜９．５の緩衝液である、請求項１〜７のいずれか一項記載のキット。
9. ノンアルコール飲料の品質を保証する方法であって、
   試料とアルコールデヒドロゲナーゼ、電子受容体及び緩衝液とを混合してｐＨ７．０〜９．０の反応液１を得る工程、
   反応液１と酸化剤とを混合して反応液２を得る工程、
   反応液２と還元系色素とを混合して反応液３を得る工程及び
   反応液３の色を目視することで試料中のアルコールを測定する工程
   を含む方法。
10. ノンアルコール飲料の品質を保証する方法であって、
    試料とアルコールデヒドロゲナーゼ、ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体及び緩衝液とを混合してｐＨ７．０〜９．０の反応液１を得る工程、
    反応液１と酸化剤とを混合して反応液２を得る工程、
    反応液２とニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体及び還元系色素とを混合して反応液３を得る工程及び
    反応液３の色を目視することで試料中のアルコールを測定する工程
    を含む方法。
11. ニコチンアミド骨格を有する酸化型電子伝達体が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である、請求項１０記載の方法。
12. ニコチンアミド骨格を有する還元型電子伝達体と電子の授受ができる電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート、１−メトキシフェナジンメトサルフェート、メルドラブルー又はジアホラーゼである、請求項１０又は１１記載の方法。
13. 酸化剤が、ヨウ化カリウム、ヨウ素液、Ｃｕ^２＋を含む溶液、Ｆｅ^３＋を含む溶液又は過酸化水素水である、請求項９〜１２のいずれか一項記載の方法。
14. 還元系色素が、テトラゾリウム塩である、請求項９〜１３のいずれか一項記載の方法。
15. テトラゾリウム塩が、ニトロテトラゾリウムブルー、テトラゾリウムブルー、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド、２，３−ビス−（２−メトシキ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキシアニリド、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノソジウム、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノソジウム又は２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムである、請求項１４記載の方法。
16. 反応液１がｐＨ７．２〜８．７になるように調整する、請求項９〜１５のいずれか一項記載の方法。
17. 緩衝液が、ｐＨ７．８〜９．５の緩衝液である、請求項９〜１６のいずれか一項記載の方法。
18. 緩衝液が、ｐＨ８．４〜９．５の緩衝液である、請求項９〜１６のいずれか一項記載の方法。

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