JP2004065078A - ピルビン酸濃度の簡易判定キット及びピルビン酸濃度の簡易判定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】高度な実験（操作）技術や専門的知識を全く必要とせず、誰でも簡単にピルビン酸濃度を判定して該ピルビン酸濃度を簡易に測定することができる極めて実用性に秀れたピルビン酸濃度の判定技術を提供するものである。
【解決手段】清酒等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸濃度を簡易に判定する判定キットであって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）と、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）と、テトラゾリウム塩と、触媒と、ピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す比較材とから成り、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ），前記乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），前記テトラゾリウム塩及び前記触媒は、夫々所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定する為に必要な量ずつに分量して使用できるように構成されているピルビン酸濃度の簡易判定キット。
【解決手段】清酒等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸濃度を簡易に判定する判定キットであって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）と、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）と、テトラゾリウム塩と、触媒と、ピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す比較材とから成り、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ），前記乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），前記テトラゾリウム塩及び前記触媒は、夫々所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定する為に必要な量ずつに分量して使用できるように構成されているピルビン酸濃度の簡易判定キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば清酒等の酵母発酵物を製造する際に生成されるピルビン酸の濃度を簡易に判定するためのピルビン酸濃度の簡易判定キット及びピルビン酸濃度の簡易判定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
清酒等の酵母発酵物を製造する際には、ピルビン酸と呼ばれる物質が生成される。
【０００３】
このピルビン酸は酵母発酵物の香りを劣化させる物質の前駆体であることが知られている。
【０００４】
従って、製造者は、酵母発酵物を製造する際に該酵母発酵物中に形成されるピルビン酸を一定濃度以下にしなければならず、その為、酵母発酵物を製造する際に該酵母発酵物中にピルビン酸がどれだけの濃度（量）含まれているか測定しなければならない。
【０００５】
しかし、従来から酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定することは厄介であり、容易に行うことはできなかった。
【０００６】
例えば、ピルビン酸濃度の測定方法として、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを用いた比色法、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）及び補酵素（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型：ＮＡＤＨ）を用いた吸光度分析法、ピルビン酸オキシターゼ及び発色剤を用いた比色法等が知られている。
【０００７】
しかし、これらの方法にはいずれも問題点がある。
【０００８】
２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを用いる比色法は、該２，４−ジニトロフェニルヒドラジンが劇物であるため、取り扱いに専門的な知識が求められ、化学薬品の取り扱いに不慣れな例えば清酒製造業者は簡便に使用することが難しいことから、専門の技術者を雇わなければならいという問題点がある。
【０００９】
特に、中小企業においては、ピルビン酸濃度の測定のためだけに専門の技術者を雇うことは極めて困難であり、そのため、ピルビン酸濃度の測定は容易には行うことができない。
【００１０】
また、前記２，４−ジニトロフェニルヒドラジンはピルビン酸以外の有機物にも反応を起こしてしまうため、特異性に欠け、正確なピルビン酸濃度の測定を行いづらいという問題点もある。
【００１１】
また、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を用いた吸光度分析法は、前記乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）等がピルビン酸に特異的に反応するため、正確なピルビン酸濃度を知ることができる点で秀れるが、該吸光度分析法は、可視光領域外の特定波長の増減によってピルビン酸濃度を定量するため、高価な分析機器が必要となり、よって、コスト高となる問題点がある。
【００１２】
ピルビン酸オキシダーゼ及び発色剤を用いた比色法は、発色剤等を塗布した試験紙に、ピルビン酸を含む酵母発酵物を接触させることで該試験紙が発する可視光領域の色調の濃淡によりピルビン酸濃度の測定ができるため、高価な分析機器を用いる必要がない点で秀れるが、この比色法は、前記試験紙の発色度合いが微妙であることから、前記色調の濃淡が分かりにくく、そのため、ピルビン酸の濃度を正確に測定するには熟練を要するという問題点がある。
【００１３】
よって、上記三方法で、ピルビン酸濃度を容易に測定することはできない。
【００１４】
また、その他、ピルビン酸濃度の測定を行う為の種々の手段が知られているが、いずれも専門的な知識を必要としたり測定操作が厄介なものがほとんどで、誰でも簡単にピルビン酸濃度を測定できる方法は未だ提案されていない。
【００１５】
本発明は、上記問題点を解決するもので、高度な実験（操作）技術や専門的知識を全く必要とせず、誰でも簡単にピルビン酸濃度を判定して該ピルビン酸濃度を簡易に測定することができる極めて実用性に秀れたピルビン酸濃度の判定技術を提供するものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨を説明する。
【００１７】
清酒等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸濃度を簡易に判定する判定キットであって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型と、乳酸脱水素酵素と、テトラゾリウム塩と、触媒と、ピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す比較材とから成り、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型，前記乳酸脱水素酵素，前記テトラゾリウム塩及び前記触媒は、夫々所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定する為に必要な量ずつに分量して使用できるように構成されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キットに係るものである。
【００１８】
また、請求項１記載のピルビン酸濃度の簡易判定キットにおいて、前記比較材は、所定濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型とテトラゾリウム塩と触媒とを混合して反応せしめることで生成する所定の発色度合いのフォルマザンを含んだ溶液が採用されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キットに係るものである。
【００１９】
また、請求項１，２いずれか１項に記載のピルビン酸濃度の簡易判定キットにおいて、前記比較材は、少なくとも低濃度，中濃度，高濃度の各ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型に、テトラゾリウム塩及び触媒を夫々加えることで生成する、発色度合いが夫々異なるフォルマザンを含んだ溶液が採用されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キットに係るものである。
【００２０】
また、請求項１〜３いずれか１項に記載のピルビン酸濃度の簡易判定キットにおいて、前記触媒は、ジアフォラーゼ等の酸化還元酵素若しくはフェナジンメントサルフェート等の電子キャリアが採用されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キットに係るものである。
【００２１】
また、清酒等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度を簡易に判定する方法であって、前記酵母発酵物にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型及び乳酸脱水素酵素を加えて、該酵母発酵物中に存在するピルビン酸を酸化せしめて乳酸とすると共に該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換し、続いて、テトラゾリウム塩及び触媒を加えることで、上記でピルビン酸の酸化の際に消費されずに残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換すると共に、テトラゾリウム塩を発色性を有するフォルマザンに変換し、該フォルマザンが示す発色状態でピルビン酸の濃度を判定することを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定方法に係るものである。
【００２２】
また、清酒，ビール，ワイン等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度を判定キットにより簡易に判定する方法であって、該判定キットは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型と、乳酸脱水素酵素と、テトラゾリウム塩と、触媒と、ピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す比較材とから成り、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型，前記乳酸脱水素酵素，前記テトラゾリウム塩及び前記触媒は、夫々所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定する為に必要な量ずつに分量して使用できるように構成されており、溶液状の前記酵母発酵物に前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型及び前記乳酸脱水素酵素を加えて、該酵母発酵物中に存在するピルビン酸を酸化せしめて乳酸とすると共に該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換し、続いて、該ピルビン酸を乳酸に酸化せしめた後の溶液にテトラゾリウム塩及び触媒を加えることで、該ピルビン酸の酸化の際に消費されずに残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換すると共に、テトラゾリウム塩を発色性を有するフォルマザンに変換し、該フォルマザンが示す発色状態をピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す前記比較材と比較することで、前記酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度が比較材で示されるピルビン酸の所定濃度より高いか低いかを判定することを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定方法に係るものである。
【００２３】
【発明の作用及び効果】
清酒等の酵母発酵物に乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）及び濃度既知のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を加えると、該酵母発酵物中のピルビン酸が乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の働きにより、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の消費を伴って乳酸に酸化され、更に、該酸化反応において消費されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に変換されることになる。
【００２４】
この際、ピルビン酸が例えば１ｍｏｌ酸化される為に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）は１ｍｏｌ消費されるため、該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の消費量からピルビン酸濃度を測定することができる。
【００２５】
そして、ピルビン酸を乳酸に酸化せしめた後の溶液に、テトラゾリウム塩と触媒とを加えると、前記ピルビン酸の酸化の際に消費されずに残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に変換され、テトラゾリウム塩が発色性を有するフォルマザンに変換されることになる。
【００２６】
このフォルマザンが呈する色の濃さにより、ピルビン酸の濃度を判定することができる。
【００２７】
例えば、このフォルマザンが呈する色の濃さを、ピルビン酸が所定濃度の際に呈する色の濃さを示す比較材と比較し、該比較材が示す色の濃さに対して前記フォルマザンが呈する色が濃いか若しくは薄いかを目視で判定（確認）することで、酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度が比較材で示されるピルビン酸の所定濃度より高いか低いかを判定して酵母発酵物中のピルビン酸濃度を測定することができる。
【００２８】
請求項１記載の発明においては、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ），前記乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），テトラゾリウム塩及び触媒は、夫々、所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸濃度を測定する為に必要な量ずつ分量して使用できるように構成されているため、単に前記酵母発酵物を所定量取り出し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ），前記乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），テトラゾリウム塩及び触媒を、順次必要な量ずつ分量して加え、最後に目視で判定（確認）するだけで、ピルビン酸の濃度を測定することができる。
【００２９】
従って、本発明によれば、高度な実験（操作）技術も専門的な知識も不要で、酵母発酵物に酵素等を必要量だけ分量して順次加えていくだけで、誰もが簡単に酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を判定して該ピルビン酸濃度を簡易に測定することができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施例について、以下に説明する。
【００３１】
本実施例は、清酒，ビール，ワイン等の酵母発酵物（醸造物等）の製造の際に生成するピルビン酸の濃度を簡易に判定する判定キットであって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）と、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）と、テトラゾリウム塩と、触媒と、ピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す比較材とから成り、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ），前記乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），前記テトラゾリウム塩及び前記触媒は、夫々所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定する為に必要な量ずつに分量して使用できるように構成されているものである。
【００３２】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）は、酵母発酵物中のピルビン酸が乳酸に酸化される際の補酵素として使用する。
【００３３】
また、このニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の濃度は、酵母発酵物中のピルビン酸の濃度が１００ｍｇ／ｌの時に該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）が全量消費される濃度、即ち、８０５ｍｇ／ｌに設定する。
【００３４】
また、このニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）は、例えば錠剤状のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を採用する。また、この錠剤状のＮＡＤＨは、該錠剤１錠で、丁度ピルビン酸の濃度を１回測定できるように形成する。
【００３５】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、酵母発酵物中のピルビン酸を乳酸に酸化する酵素として使用する。
【００３６】
この乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、例えばウサギ筋繊維由来ＬＤＨを採用する。
【００３７】
また、この乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の濃度は、例えば１００ｕｎｉｔ／ｍｌに設定する（尚、ｕｎｉｔは酵素の反応速度を示す国際単位である。）。
【００３８】
テトラゾリウム塩は、酵母発酵物中のピルビン酸が乳酸に酸化された後に、該酸化反応で使用されずに残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）と反応して発色させる為に使用する。
【００３９】
具体的には、テトラゾリウム塩と、酵母発酵物中に残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）とが反応すると、該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に変換され、テトラゾリウム塩はフォルマザンに変換されて、該フォルマザンの濃度によって薄赤色から濃赤色に発色する。
【００４０】
このテトラゾリウム塩は、例えば２−（４−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩＮＴ）を採用する。
【００４１】
また、このテトラゾリウム塩の濃度は、例えば５００ｍｇ／ｌに設定する。
【００４２】
前記触媒は、電子キャリアーを採用している。
【００４３】
具体的には、この電子キャリアーとして、例えば１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）を使用する。
【００４４】
また、この電子キャリアーの濃度は、例えば５５ｍｇ／ｌに設定する。
【００４５】
前記比較材は、該比較材が示す色の濃さと、酵母発酵物中に含まれるピルビン酸を乳酸に酸化した後に残存するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）にテトラゾリウム塩であるＩＮＴと電子キャリアーである１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳを加えて発色したもの（フォルマザンによる発色）の色の濃さとを比較して、前記比較材が示す色の濃さに対して前記フォルマザンによる発色が示す色の濃さが濃いか若しくは薄いかを目視により判定（確認）することで、前記酵母発酵物中のピルビン酸濃度を測定するために使用する。
【００４６】
この比較材（図示省略）は、所定濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）に電子キャリアー及びテトラゾリウム塩を加えることで形成される。この際、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の濃度は、低濃度，中濃度，高濃度（例えば４０２．５，８０５，２４１５ｍｇ／ｌ）の三種類が設けられ、各濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）溶液に、上述した電子キャリアー及びテトラゾリウム塩を加えて三種類の異なる濃度の比較材を形成することで、酵母発酵物中に含まれるピルビン酸の濃度をより細かく分析することができる。尚、前述したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の低濃度から高濃度までの三種類の濃度は、ピルビン酸濃度が５０，１００，３００ｍｇ／ｌの時に丁度反応する濃度である。
【００４７】
また、ピルビン酸から乳酸への酸化反応の際に、ｐＨの急激な変化を防止するための緩衝液も併用すると良い。この緩衝液は、例えば０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を採用する。
【００４８】
また、この０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）は、後述の液体ボトル２に収容され、一本の液体ボトル２に収容された緩衝液が、丁度ピルビン酸を一回定量する為に必要とされる量に設定されている。
【００４９】
その他、ピンセット，スポイト，試験管，２５℃の恒温槽（厳密な試験の場合に必要），タイマーを用意する。
【００５０】
また、前記スポイトは、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）用と１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳ用とテトラゾリウム塩用の３本が用意されている。
【００５１】
また、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）用のスポイトは、１滴が丁度ピルビン酸濃度の一回の測定に使用される量となるように構成されている。
【００５２】
また、１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳ（電子キャリアー）用のスポイトは、１滴が丁度ピルビン酸濃度の一回の測定に使用される量となるように構成されている。
【００５３】
また、ＩＮＴ（テトラゾリウム塩）用のスポイトは、５滴が丁度ピルビン酸濃度の一回の測定に使用される量となるように構成されている。
【００５４】
尚、図中符号１は錠剤のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を収納した容器、符号２は緩衝液を収容したボトル、符号３は乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を収容したボトル、符号４は電子キャリアーである１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳを収容したボトル、符号５はテトラゾリウム塩であるＩＮＴを収容したボトルを示している。
【００５５】
本実施例の判定キットの使用方法について説明する。
【００５６】
先ず、ボトル２に収容された０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を全量試験管に移す。
【００５７】
続いて、この試験管にピルビン酸濃度１００ｍｇ／ｌ用ＮＡＤＨ錠剤を一錠加えよく撹拌し溶解させる。尚、ここで１００ｍｇ／ｌ用のＮＡＤＨ錠剤を採用したのは、ピルビン酸濃度が１００ｍｇ／ｌとなる時点が、もろみ上槽タイミングを決める一つの目安になるからである。
【００５８】
続いて、試験管に試料となる酵母発酵物を所定量加えると共に、該試験管に前記ボトル３に収容した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を乳酸脱水素酵素用のスポイトを用いて一滴加えて撹拌する。
【００５９】
続いて、前記試験管を２５℃の温度にて１０分間放置する。尚、この際にピルビン酸が反応して乳酸に酸化される。
【００６０】
この放置後、前記試験管に、前記ボトル４に収容した１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳを、１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳ用のスポイトを用いて１滴加えると共に、該試験管に、前記ボトル５に収容したＩＮＴを、ＩＮＴ用のスポイトを用いて５滴加え、１０分間放置して発色させる。
【００６１】
試料中のピルビン酸濃度が１００ｍｇ／ｌ未満の場合には、該ピルビン酸の濃度により赤色の色素が形成される。一方、ピルビン酸濃度が１００ｍｇ／ｌを超える場合は無色のままとなる。尚、本実験例は、従来のピルビン酸オキシダーゼと発色剤を用いた方法に比し、発色剤の発色度合いが明瞭で視認し易いため、ピルビン酸濃度を正確に測定することができる。
【００６２】
これにより、試料中にピルビン酸が、もろみ上槽タイミングを決める一つの目安となる１００ｍｇ／ｌよりも多く含まれているか或いは少なく含まれているかを、目視により測定（確認）できることになる。
【００６３】
この際、予め、比較材であるピルビン酸標準を例えば２５ｍｇ／ｌ，５０ｍｇ／ｌ，７５ｍｇ／ｌの三種類（夫々色が異なる）を用意し、これら各濃度の比較材と試験管の溶液が呈する色とを比較することで、酵母発酵物中に含まれるピルビン酸の濃度をより詳しく知ることができる。よって、酵母発酵物の製造者は、該酵母発酵物にピルビン酸がどれだけ含まれているかを、高度な実験（操作）技術を要さずに、また、専門的な知識を要さずに、単にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）等を試験管に加えて発色させ、各種濃度の比較材と比較するだけで比較的詳しく知ることができる。
【００６４】
本実施例は上述のようにするから、ピルビン酸濃度を測定したい酵母発酵物（例えば清酒）に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）等を一回のピルビン酸濃度の測定に必要な量ずつ簡単に分量して順次加えていくだけで、誰でも容易に酵母発酵物中のピルビン酸濃度を判定しておおよその濃度を測定することができる。
【００６５】
即ち、高度な実験（操作）技術がなくても専門的な知識がなくても、酵母発酵物中のピルビン酸濃度を簡単に測定することができる。
【００６６】
しかも、本実施例の判定キットは、予めボトル等の容器に収納した酵素等を所定量の酵母発酵物と共に加え、比較材と比較するだけで、該酵母発酵物中のピルビン酸濃度を測定できるため、高価な器具や装置を必要とせず、また、専門の技術者を雇う必要もないため、よって、安価にピルビン酸濃度を測定することができる。これにより、これまでピルビン酸濃度の測定を容易に行うことができなかった中小企業でも、ピルビン酸濃度の測定を容易且つ安価に行うことができる。
【００６７】
また、本実施例では、ピルビン酸を含んだ溶液をフォルマザンの発色作用により、良好に発色させて比較材と容易に比較することができるため、ピルビン酸濃度をより簡易且つ正確に測定することができる。
【００６８】
また、例えば比較材を複数用意し、これら複数の比較材と試料を含む発色させた溶液とを単に比較するだけで、酵母発酵物中のピルビン酸濃度をより詳しく知ることもできる。
【００６９】
また、本実施例の簡易判定キットは、劇物等の人体に影響を与える試薬を用いないため、食品製造メーカーでも安心して使用することができる。
【００７０】
また、例えば酒製造メーカーにおいては、酵母発酵物中のピルビン酸濃度を小まめに管理できるため、清酒の酒質を向上させることができる。
【００７１】
次に、本実施例の簡易判定キットを用いてピルビン酸濃度を測定した際の実験例を示す。尚、ピルビン酸濃度の測定に使用する酵素等の濃度は、前述した各種酵素等の濃度を採用した。
【００７２】
また、本実験例においては、以下のように調整した溶液を比較材として用いて各種実験を行った。
【００７３】
先ず、試験管に蒸留水を１．９ｍｌ加えた。
【００７４】
続いて、試験管に０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液を１．０ｍｌ加えた。
【００７５】
続いて、錠剤ではなく、液状のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）溶液を０．１ｍｌ加えた。尚、この液状のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）溶液の濃度は、５．３ｍｇ／ｍｌに設定した。
【００７６】
続いて、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）溶液を０．１ｍｌ加えた。
【００７７】
続いて、試料０．１ｍｌを採取して前記試験管に加えた。
【００７８】
この試験管をよく撹拌後、２５℃の水浴中で１０分間放置した。
【００７９】
続いて、試験管に電子キャリアーである１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳを０．０２ｍｌ加えると共に、テトラゾリウム塩であるＩＮＴを０．５ｍｌ加えて室温で１０分間放置した。
【００８０】
この放置後、所定発色度合いの比較材を得た。
【００８１】
第一実験例
先ず、本判定キットの定量性について調べるために検量線の作成を行った。
【００８２】
標準物質としてピルビン酸ナトリウム水溶液の濃度を段階的に増加させたものを試料として使用し、各濃度における波長５００ｎｍの吸光度を測定した。
【００８３】
尚、対照は蒸留水を試料として用いた。
【００８４】
また、予備実験の結果、残存するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の量が比較的多い場合、不溶性の色素が生成されるため、ｎ−デカン３ｍｌを投入してよく撹拌し、ｎ−デカン層へ色素を抽出し、この抽出液の色調により定量した。その結果を下記表１に示した。
【００８５】
【表１】
【００８６】
表１によれば、標準物質の濃度の増加と吸光度の間には比例関係が認められた。また、係数もＲ２＝０．９９５５と非常に高かった。
【００８７】
従って、本方法には定量性があると言える。
【００８８】
第二実験例
次に、既存定量キットとの相関について調べた。
【００８９】
既存の定量キット（Ｆ−キットピルビン酸用、ロシュ社製）の定量値と本方法における定量値の関係について検討した。同一の標準物質を夫々の方法で測定し、その定量値をプロットしたものが下記表２である。
【００９０】
【表２】
【００９１】
表２によれば、両者の定量値には、ｒ＝０．９９９８９と非常に高い相関が認められた。
【００９２】
従って、本実施例は、既存の定量キットと同様に利用することが可能であると言える。
【００９３】
第三実験例
次に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）濃度制限による発色の制御に関する検討を行った。
【００９４】
これは、測定時に添加するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）濃度を制限することによって、ピルビン酸の濃度により発色の有無を意図的に操作可能ではないかと考えられたためである。
【００９５】
第一，第二実験例で使用したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）溶液を５倍に希釈して用いた。標準物質濃度を０，７０，８０，９０，１００，１１０，１２０及び２００ｍｇ／ｌと設定した。これらを用いて測定操作を行い５００ｎｍの吸収を測定した。その結果を下記表３に示す。
【００９６】
【表３】
【００９７】
表３によれば、ピルビン酸濃度が１００ｍｇ／ｌ未満の場合には、直線的に発色が減少し、１００ｍｇ／ｌを超える濃度では発色しないことが認められた。
【００９８】
従って、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の濃度を測定したいピルビン酸濃度ですべて消費されるように調節することで、検体中のピルビン酸濃度を試料を含んだ溶液の発色の有無により判別可能であると考えられた。
【００９９】
尚、ピルビン酸濃度の９０ｍｇ／ｌと１００ｍｇ／ｌの発色の差異は肉眼で判別可能であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施例の判定キット一式を示す説明図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば清酒等の酵母発酵物を製造する際に生成されるピルビン酸の濃度を簡易に判定するためのピルビン酸濃度の簡易判定キット及びピルビン酸濃度の簡易判定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
清酒等の酵母発酵物を製造する際には、ピルビン酸と呼ばれる物質が生成される。
【０００３】
このピルビン酸は酵母発酵物の香りを劣化させる物質の前駆体であることが知られている。
【０００４】
従って、製造者は、酵母発酵物を製造する際に該酵母発酵物中に形成されるピルビン酸を一定濃度以下にしなければならず、その為、酵母発酵物を製造する際に該酵母発酵物中にピルビン酸がどれだけの濃度（量）含まれているか測定しなければならない。
【０００５】
しかし、従来から酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定することは厄介であり、容易に行うことはできなかった。
【０００６】
例えば、ピルビン酸濃度の測定方法として、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを用いた比色法、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）及び補酵素（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型：ＮＡＤＨ）を用いた吸光度分析法、ピルビン酸オキシターゼ及び発色剤を用いた比色法等が知られている。
【０００７】
しかし、これらの方法にはいずれも問題点がある。
【０００８】
２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを用いる比色法は、該２，４−ジニトロフェニルヒドラジンが劇物であるため、取り扱いに専門的な知識が求められ、化学薬品の取り扱いに不慣れな例えば清酒製造業者は簡便に使用することが難しいことから、専門の技術者を雇わなければならいという問題点がある。
【０００９】
特に、中小企業においては、ピルビン酸濃度の測定のためだけに専門の技術者を雇うことは極めて困難であり、そのため、ピルビン酸濃度の測定は容易には行うことができない。
【００１０】
また、前記２，４−ジニトロフェニルヒドラジンはピルビン酸以外の有機物にも反応を起こしてしまうため、特異性に欠け、正確なピルビン酸濃度の測定を行いづらいという問題点もある。
【００１１】
また、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を用いた吸光度分析法は、前記乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）等がピルビン酸に特異的に反応するため、正確なピルビン酸濃度を知ることができる点で秀れるが、該吸光度分析法は、可視光領域外の特定波長の増減によってピルビン酸濃度を定量するため、高価な分析機器が必要となり、よって、コスト高となる問題点がある。
【００１２】
ピルビン酸オキシダーゼ及び発色剤を用いた比色法は、発色剤等を塗布した試験紙に、ピルビン酸を含む酵母発酵物を接触させることで該試験紙が発する可視光領域の色調の濃淡によりピルビン酸濃度の測定ができるため、高価な分析機器を用いる必要がない点で秀れるが、この比色法は、前記試験紙の発色度合いが微妙であることから、前記色調の濃淡が分かりにくく、そのため、ピルビン酸の濃度を正確に測定するには熟練を要するという問題点がある。
【００１３】
よって、上記三方法で、ピルビン酸濃度を容易に測定することはできない。
【００１４】
また、その他、ピルビン酸濃度の測定を行う為の種々の手段が知られているが、いずれも専門的な知識を必要としたり測定操作が厄介なものがほとんどで、誰でも簡単にピルビン酸濃度を測定できる方法は未だ提案されていない。
【００１５】
本発明は、上記問題点を解決するもので、高度な実験（操作）技術や専門的知識を全く必要とせず、誰でも簡単にピルビン酸濃度を判定して該ピルビン酸濃度を簡易に測定することができる極めて実用性に秀れたピルビン酸濃度の判定技術を提供するものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨を説明する。
【００１７】
清酒等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸濃度を簡易に判定する判定キットであって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型と、乳酸脱水素酵素と、テトラゾリウム塩と、触媒と、ピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す比較材とから成り、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型，前記乳酸脱水素酵素，前記テトラゾリウム塩及び前記触媒は、夫々所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定する為に必要な量ずつに分量して使用できるように構成されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キットに係るものである。
【００１８】
また、請求項１記載のピルビン酸濃度の簡易判定キットにおいて、前記比較材は、所定濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型とテトラゾリウム塩と触媒とを混合して反応せしめることで生成する所定の発色度合いのフォルマザンを含んだ溶液が採用されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キットに係るものである。
【００１９】
また、請求項１，２いずれか１項に記載のピルビン酸濃度の簡易判定キットにおいて、前記比較材は、少なくとも低濃度，中濃度，高濃度の各ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型に、テトラゾリウム塩及び触媒を夫々加えることで生成する、発色度合いが夫々異なるフォルマザンを含んだ溶液が採用されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キットに係るものである。
【００２０】
また、請求項１〜３いずれか１項に記載のピルビン酸濃度の簡易判定キットにおいて、前記触媒は、ジアフォラーゼ等の酸化還元酵素若しくはフェナジンメントサルフェート等の電子キャリアが採用されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キットに係るものである。
【００２１】
また、清酒等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度を簡易に判定する方法であって、前記酵母発酵物にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型及び乳酸脱水素酵素を加えて、該酵母発酵物中に存在するピルビン酸を酸化せしめて乳酸とすると共に該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換し、続いて、テトラゾリウム塩及び触媒を加えることで、上記でピルビン酸の酸化の際に消費されずに残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換すると共に、テトラゾリウム塩を発色性を有するフォルマザンに変換し、該フォルマザンが示す発色状態でピルビン酸の濃度を判定することを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定方法に係るものである。
【００２２】
また、清酒，ビール，ワイン等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度を判定キットにより簡易に判定する方法であって、該判定キットは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型と、乳酸脱水素酵素と、テトラゾリウム塩と、触媒と、ピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す比較材とから成り、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型，前記乳酸脱水素酵素，前記テトラゾリウム塩及び前記触媒は、夫々所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定する為に必要な量ずつに分量して使用できるように構成されており、溶液状の前記酵母発酵物に前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型及び前記乳酸脱水素酵素を加えて、該酵母発酵物中に存在するピルビン酸を酸化せしめて乳酸とすると共に該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換し、続いて、該ピルビン酸を乳酸に酸化せしめた後の溶液にテトラゾリウム塩及び触媒を加えることで、該ピルビン酸の酸化の際に消費されずに残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換すると共に、テトラゾリウム塩を発色性を有するフォルマザンに変換し、該フォルマザンが示す発色状態をピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す前記比較材と比較することで、前記酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度が比較材で示されるピルビン酸の所定濃度より高いか低いかを判定することを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定方法に係るものである。
【００２３】
【発明の作用及び効果】
清酒等の酵母発酵物に乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）及び濃度既知のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を加えると、該酵母発酵物中のピルビン酸が乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の働きにより、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の消費を伴って乳酸に酸化され、更に、該酸化反応において消費されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に変換されることになる。
【００２４】
この際、ピルビン酸が例えば１ｍｏｌ酸化される為に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）は１ｍｏｌ消費されるため、該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の消費量からピルビン酸濃度を測定することができる。
【００２５】
そして、ピルビン酸を乳酸に酸化せしめた後の溶液に、テトラゾリウム塩と触媒とを加えると、前記ピルビン酸の酸化の際に消費されずに残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に変換され、テトラゾリウム塩が発色性を有するフォルマザンに変換されることになる。
【００２６】
このフォルマザンが呈する色の濃さにより、ピルビン酸の濃度を判定することができる。
【００２７】
例えば、このフォルマザンが呈する色の濃さを、ピルビン酸が所定濃度の際に呈する色の濃さを示す比較材と比較し、該比較材が示す色の濃さに対して前記フォルマザンが呈する色が濃いか若しくは薄いかを目視で判定（確認）することで、酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度が比較材で示されるピルビン酸の所定濃度より高いか低いかを判定して酵母発酵物中のピルビン酸濃度を測定することができる。
【００２８】
請求項１記載の発明においては、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ），前記乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），テトラゾリウム塩及び触媒は、夫々、所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸濃度を測定する為に必要な量ずつ分量して使用できるように構成されているため、単に前記酵母発酵物を所定量取り出し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ），前記乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），テトラゾリウム塩及び触媒を、順次必要な量ずつ分量して加え、最後に目視で判定（確認）するだけで、ピルビン酸の濃度を測定することができる。
【００２９】
従って、本発明によれば、高度な実験（操作）技術も専門的な知識も不要で、酵母発酵物に酵素等を必要量だけ分量して順次加えていくだけで、誰もが簡単に酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を判定して該ピルビン酸濃度を簡易に測定することができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施例について、以下に説明する。
【００３１】
本実施例は、清酒，ビール，ワイン等の酵母発酵物（醸造物等）の製造の際に生成するピルビン酸の濃度を簡易に判定する判定キットであって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）と、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）と、テトラゾリウム塩と、触媒と、ピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す比較材とから成り、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ），前記乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），前記テトラゾリウム塩及び前記触媒は、夫々所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定する為に必要な量ずつに分量して使用できるように構成されているものである。
【００３２】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）は、酵母発酵物中のピルビン酸が乳酸に酸化される際の補酵素として使用する。
【００３３】
また、このニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の濃度は、酵母発酵物中のピルビン酸の濃度が１００ｍｇ／ｌの時に該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）が全量消費される濃度、即ち、８０５ｍｇ／ｌに設定する。
【００３４】
また、このニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）は、例えば錠剤状のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を採用する。また、この錠剤状のＮＡＤＨは、該錠剤１錠で、丁度ピルビン酸の濃度を１回測定できるように形成する。
【００３５】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、酵母発酵物中のピルビン酸を乳酸に酸化する酵素として使用する。
【００３６】
この乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、例えばウサギ筋繊維由来ＬＤＨを採用する。
【００３７】
また、この乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の濃度は、例えば１００ｕｎｉｔ／ｍｌに設定する（尚、ｕｎｉｔは酵素の反応速度を示す国際単位である。）。
【００３８】
テトラゾリウム塩は、酵母発酵物中のピルビン酸が乳酸に酸化された後に、該酸化反応で使用されずに残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）と反応して発色させる為に使用する。
【００３９】
具体的には、テトラゾリウム塩と、酵母発酵物中に残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）とが反応すると、該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）に変換され、テトラゾリウム塩はフォルマザンに変換されて、該フォルマザンの濃度によって薄赤色から濃赤色に発色する。
【００４０】
このテトラゾリウム塩は、例えば２−（４−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩＮＴ）を採用する。
【００４１】
また、このテトラゾリウム塩の濃度は、例えば５００ｍｇ／ｌに設定する。
【００４２】
前記触媒は、電子キャリアーを採用している。
【００４３】
具体的には、この電子キャリアーとして、例えば１−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ（１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）を使用する。
【００４４】
また、この電子キャリアーの濃度は、例えば５５ｍｇ／ｌに設定する。
【００４５】
前記比較材は、該比較材が示す色の濃さと、酵母発酵物中に含まれるピルビン酸を乳酸に酸化した後に残存するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）にテトラゾリウム塩であるＩＮＴと電子キャリアーである１−ｍｅｔｈｏｘｙＰＭＳを加えて発色したもの（フォルマザンによる発色）の色の濃さとを比較して、前記比較材が示す色の濃さに対して前記フォルマザンによる発色が示す色の濃さが濃いか若しくは薄いかを目視により判定（確認）することで、前記酵母発酵物中のピルビン酸濃度を測定するために使用する。
【００４６】
この比較材（図示省略）は、所定濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）に電子キャリアー及びテトラゾリウム塩を加えることで形成される。この際、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の濃度は、低濃度，中濃度，高濃度（例えば４０２．５，８０５，２４１５ｍｇ／ｌ）の三種類が設けられ、各濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）溶液に、上述した電子キャリアー及びテトラゾリウム塩を加えて三種類の異なる濃度の比較材を形成することで、酵母発酵物中に含まれるピルビン酸の濃度をより細かく分析することができる。尚、前述したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の低濃度から高濃度までの三種類の濃度は、ピルビン酸濃度が５０，１００，３００ｍｇ／ｌの時に丁度反応する濃度である。
【００４７】
また、ピルビン酸から乳酸への酸化反応の際に、ｐＨの急激な変化を防止するための緩衝液も併用すると良い。この緩衝液は、例えば０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を採用する。
【００４８】
また、この０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）は、後述の液体ボトル２に収容され、一本の液体ボトル２に収容された緩衝液が、丁度ピルビン酸を一回定量する為に必要とされる量に設定されている。
【００４９】
その他、ピンセット，スポイト，試験管，２５℃の恒温槽（厳密な試験の場合に必要），タイマーを用意する。
【００５０】
また、前記スポイトは、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）用と１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳ用とテトラゾリウム塩用の３本が用意されている。
【００５１】
また、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）用のスポイトは、１滴が丁度ピルビン酸濃度の一回の測定に使用される量となるように構成されている。
【００５２】
また、１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳ（電子キャリアー）用のスポイトは、１滴が丁度ピルビン酸濃度の一回の測定に使用される量となるように構成されている。
【００５３】
また、ＩＮＴ（テトラゾリウム塩）用のスポイトは、５滴が丁度ピルビン酸濃度の一回の測定に使用される量となるように構成されている。
【００５４】
尚、図中符号１は錠剤のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）を収納した容器、符号２は緩衝液を収容したボトル、符号３は乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を収容したボトル、符号４は電子キャリアーである１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳを収容したボトル、符号５はテトラゾリウム塩であるＩＮＴを収容したボトルを示している。
【００５５】
本実施例の判定キットの使用方法について説明する。
【００５６】
先ず、ボトル２に収容された０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）を全量試験管に移す。
【００５７】
続いて、この試験管にピルビン酸濃度１００ｍｇ／ｌ用ＮＡＤＨ錠剤を一錠加えよく撹拌し溶解させる。尚、ここで１００ｍｇ／ｌ用のＮＡＤＨ錠剤を採用したのは、ピルビン酸濃度が１００ｍｇ／ｌとなる時点が、もろみ上槽タイミングを決める一つの目安になるからである。
【００５８】
続いて、試験管に試料となる酵母発酵物を所定量加えると共に、該試験管に前記ボトル３に収容した乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を乳酸脱水素酵素用のスポイトを用いて一滴加えて撹拌する。
【００５９】
続いて、前記試験管を２５℃の温度にて１０分間放置する。尚、この際にピルビン酸が反応して乳酸に酸化される。
【００６０】
この放置後、前記試験管に、前記ボトル４に収容した１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳを、１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳ用のスポイトを用いて１滴加えると共に、該試験管に、前記ボトル５に収容したＩＮＴを、ＩＮＴ用のスポイトを用いて５滴加え、１０分間放置して発色させる。
【００６１】
試料中のピルビン酸濃度が１００ｍｇ／ｌ未満の場合には、該ピルビン酸の濃度により赤色の色素が形成される。一方、ピルビン酸濃度が１００ｍｇ／ｌを超える場合は無色のままとなる。尚、本実験例は、従来のピルビン酸オキシダーゼと発色剤を用いた方法に比し、発色剤の発色度合いが明瞭で視認し易いため、ピルビン酸濃度を正確に測定することができる。
【００６２】
これにより、試料中にピルビン酸が、もろみ上槽タイミングを決める一つの目安となる１００ｍｇ／ｌよりも多く含まれているか或いは少なく含まれているかを、目視により測定（確認）できることになる。
【００６３】
この際、予め、比較材であるピルビン酸標準を例えば２５ｍｇ／ｌ，５０ｍｇ／ｌ，７５ｍｇ／ｌの三種類（夫々色が異なる）を用意し、これら各濃度の比較材と試験管の溶液が呈する色とを比較することで、酵母発酵物中に含まれるピルビン酸の濃度をより詳しく知ることができる。よって、酵母発酵物の製造者は、該酵母発酵物にピルビン酸がどれだけ含まれているかを、高度な実験（操作）技術を要さずに、また、専門的な知識を要さずに、単にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）等を試験管に加えて発色させ、各種濃度の比較材と比較するだけで比較的詳しく知ることができる。
【００６４】
本実施例は上述のようにするから、ピルビン酸濃度を測定したい酵母発酵物（例えば清酒）に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）等を一回のピルビン酸濃度の測定に必要な量ずつ簡単に分量して順次加えていくだけで、誰でも容易に酵母発酵物中のピルビン酸濃度を判定しておおよその濃度を測定することができる。
【００６５】
即ち、高度な実験（操作）技術がなくても専門的な知識がなくても、酵母発酵物中のピルビン酸濃度を簡単に測定することができる。
【００６６】
しかも、本実施例の判定キットは、予めボトル等の容器に収納した酵素等を所定量の酵母発酵物と共に加え、比較材と比較するだけで、該酵母発酵物中のピルビン酸濃度を測定できるため、高価な器具や装置を必要とせず、また、専門の技術者を雇う必要もないため、よって、安価にピルビン酸濃度を測定することができる。これにより、これまでピルビン酸濃度の測定を容易に行うことができなかった中小企業でも、ピルビン酸濃度の測定を容易且つ安価に行うことができる。
【００６７】
また、本実施例では、ピルビン酸を含んだ溶液をフォルマザンの発色作用により、良好に発色させて比較材と容易に比較することができるため、ピルビン酸濃度をより簡易且つ正確に測定することができる。
【００６８】
また、例えば比較材を複数用意し、これら複数の比較材と試料を含む発色させた溶液とを単に比較するだけで、酵母発酵物中のピルビン酸濃度をより詳しく知ることもできる。
【００６９】
また、本実施例の簡易判定キットは、劇物等の人体に影響を与える試薬を用いないため、食品製造メーカーでも安心して使用することができる。
【００７０】
また、例えば酒製造メーカーにおいては、酵母発酵物中のピルビン酸濃度を小まめに管理できるため、清酒の酒質を向上させることができる。
【００７１】
次に、本実施例の簡易判定キットを用いてピルビン酸濃度を測定した際の実験例を示す。尚、ピルビン酸濃度の測定に使用する酵素等の濃度は、前述した各種酵素等の濃度を採用した。
【００７２】
また、本実験例においては、以下のように調整した溶液を比較材として用いて各種実験を行った。
【００７３】
先ず、試験管に蒸留水を１．９ｍｌ加えた。
【００７４】
続いて、試験管に０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液を１．０ｍｌ加えた。
【００７５】
続いて、錠剤ではなく、液状のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）溶液を０．１ｍｌ加えた。尚、この液状のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）溶液の濃度は、５．３ｍｇ／ｍｌに設定した。
【００７６】
続いて、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）溶液を０．１ｍｌ加えた。
【００７７】
続いて、試料０．１ｍｌを採取して前記試験管に加えた。
【００７８】
この試験管をよく撹拌後、２５℃の水浴中で１０分間放置した。
【００７９】
続いて、試験管に電子キャリアーである１−ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳを０．０２ｍｌ加えると共に、テトラゾリウム塩であるＩＮＴを０．５ｍｌ加えて室温で１０分間放置した。
【００８０】
この放置後、所定発色度合いの比較材を得た。
【００８１】
第一実験例
先ず、本判定キットの定量性について調べるために検量線の作成を行った。
【００８２】
標準物質としてピルビン酸ナトリウム水溶液の濃度を段階的に増加させたものを試料として使用し、各濃度における波長５００ｎｍの吸光度を測定した。
【００８３】
尚、対照は蒸留水を試料として用いた。
【００８４】
また、予備実験の結果、残存するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の量が比較的多い場合、不溶性の色素が生成されるため、ｎ−デカン３ｍｌを投入してよく撹拌し、ｎ−デカン層へ色素を抽出し、この抽出液の色調により定量した。その結果を下記表１に示した。
【００８５】
【表１】
表１によれば、標準物質の濃度の増加と吸光度の間には比例関係が認められた。また、係数もＲ２＝０．９９５５と非常に高かった。
【００８７】
従って、本方法には定量性があると言える。
【００８８】
第二実験例
次に、既存定量キットとの相関について調べた。
【００８９】
既存の定量キット（Ｆ−キットピルビン酸用、ロシュ社製）の定量値と本方法における定量値の関係について検討した。同一の標準物質を夫々の方法で測定し、その定量値をプロットしたものが下記表２である。
【００９０】
【表２】
表２によれば、両者の定量値には、ｒ＝０．９９９８９と非常に高い相関が認められた。
【００９２】
従って、本実施例は、既存の定量キットと同様に利用することが可能であると言える。
【００９３】
第三実験例
次に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）濃度制限による発色の制御に関する検討を行った。
【００９４】
これは、測定時に添加するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）濃度を制限することによって、ピルビン酸の濃度により発色の有無を意図的に操作可能ではないかと考えられたためである。
【００９５】
第一，第二実験例で使用したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）溶液を５倍に希釈して用いた。標準物質濃度を０，７０，８０，９０，１００，１１０，１２０及び２００ｍｇ／ｌと設定した。これらを用いて測定操作を行い５００ｎｍの吸収を測定した。その結果を下記表３に示す。
【００９６】
【表３】
表３によれば、ピルビン酸濃度が１００ｍｇ／ｌ未満の場合には、直線的に発色が減少し、１００ｍｇ／ｌを超える濃度では発色しないことが認められた。
【００９８】
従って、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）の濃度を測定したいピルビン酸濃度ですべて消費されるように調節することで、検体中のピルビン酸濃度を試料を含んだ溶液の発色の有無により判別可能であると考えられた。
【００９９】
尚、ピルビン酸濃度の９０ｍｇ／ｌと１００ｍｇ／ｌの発色の差異は肉眼で判別可能であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施例の判定キット一式を示す説明図である。
Claims (6)
- 清酒等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸濃度を簡易に判定する判定キットであって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型と、乳酸脱水素酵素と、テトラゾリウム塩と、触媒と、ピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す比較材とから成り、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型，前記乳酸脱水素酵素，前記テトラゾリウム塩及び前記触媒は、夫々所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定する為に必要な量ずつに分量して使用できるように構成されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キット。
- 請求項１記載のピルビン酸濃度の簡易判定キットにおいて、前記比較材は、所定濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型とテトラゾリウム塩と触媒とを混合して反応せしめることで生成する所定の発色度合いのフォルマザンを含んだ溶液が採用されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キット。
- 請求項１，２いずれか１項に記載のピルビン酸濃度の簡易判定キットにおいて、前記比較材は、少なくとも低濃度，中濃度，高濃度の各ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型に、テトラゾリウム塩及び触媒を夫々加えることで生成する、発色度合いが夫々異なるフォルマザンを含んだ溶液が採用されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キット。
- 請求項１〜３いずれか１項に記載のピルビン酸濃度の簡易判定キットにおいて、前記触媒は、ジアフォラーゼ等の酸化還元酵素若しくはフェナジンメントサルフェート等の電子キャリアが採用されていることを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定キット。
- 清酒等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度を簡易に判定する方法であって、前記酵母発酵物にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型及び乳酸脱水素酵素を加えて、該酵母発酵物中に存在するピルビン酸を酸化せしめて乳酸とすると共に該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換し、続いて、テトラゾリウム塩及び触媒を加えることで、上記でピルビン酸の酸化の際に消費されずに残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換すると共に、テトラゾリウム塩を発色性を有するフォルマザンに変換し、該フォルマザンが示す発色状態でピルビン酸の濃度を判定することを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定方法。
- 清酒，ビール，ワイン等の酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度を判定キットにより簡易に判定する方法であって、該判定キットは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型と、乳酸脱水素酵素と、テトラゾリウム塩と、触媒と、ピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す比較材とから成り、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型，前記乳酸脱水素酵素，前記テトラゾリウム塩及び前記触媒は、夫々所定量の前記酵母発酵物中のピルビン酸の濃度を測定する為に必要な量ずつに分量して使用できるように構成されており、溶液状の前記酵母発酵物に前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型及び前記乳酸脱水素酵素を加えて、該酵母発酵物中に存在するピルビン酸を酸化せしめて乳酸とすると共に該ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換し、続いて、該ピルビン酸を乳酸に酸化せしめた後の溶液にテトラゾリウム塩及び触媒を加えることで、該ピルビン酸の酸化の際に消費されずに残存したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに変換すると共に、テトラゾリウム塩を発色性を有するフォルマザンに変換し、該フォルマザンが示す発色状態をピルビン酸が所定濃度の際の発色状態を示す前記比較材と比較することで、前記酵母発酵物の製造の際に生成するピルビン酸の濃度が比較材で示されるピルビン酸の所定濃度より高いか低いかを判定することを特徴とするピルビン酸濃度の簡易判定方法。
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