KR101850483B1 - 감광활성 측정 제제, 및 이를 이용한 키트 및 방법 - Google Patents

감광활성 측정 제제, 및 이를 이용한 키트 및 방법 Download PDF

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Abstract

포르마잔을 포함하는 감광활성 측정 제제는, 감광성 화합물과 직접적으로 반응하여 신속하고 간편하게 감광활성을 측정할 수 있다. 상기 감광활성 측정 제제는, 다양한 구성의 측정 키트 또는 방법에 적용되어, 각종 감광성 화합물의 추적과 감광성 화합물의 화학 반응에 관련된 광범위한 연구 및 산업적 활용을 가능하게 한다.

Description

감광활성 측정 제제, 및 이를 이용한 키트 및 방법 {FORMULATION FOR MEASURING PHOTOSENSITIZING ACTIVITY, AND KIT AND METHOD USING SAME}
본 발명은 감광성 화합물의 감광활성(photosensitizing activity)을 측정하기 위한 제제, 및 이를 이용한 키트 및 방법에 관한 것이다.
감광성이란 특정 물질이 광원에서 흡수한 에너지에 의해 스스로 화학적 변화를 일으키거나, 다른 분자에 에너지를 전달하여 화학적 또는 물리적 변화를 유도하는 성질을 의미한다. 이들은 빛을 받아 들뜬 상태가 되고 그 에너지를 주변 환경에 존재하는 물질에게 전달하여 각종 화학 반응을 유발하며, 그 결과 생물체에 손상을 입히거나 식품을 상하게 하는 등의 문제를 일으키게 된다.
일반적으로 감광성 화합물은 광노출에 의해 활성화되면서 에너지를 전달하여 활성산소종(ROS)를 형성하는 제2형 광산화반응(type II photooxidation)에 관여하는 것으로 알려져 있다. 한편 최근에는, 감광성 화합물이 활성화되면서 다양한 환경에서 식품이나 조직 중의 기질로부터 직접 전자를 흡수하여 라디칼을 형성하고 이로 인해 산화를 유발하는 제1형 광산화반응(type I photooxidation)에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
현재까지 보고된 감광활성 측정 방법은, 제2형 광산화반응 중에 생성되는 활성 산소종이나 이들에 의한 산화물 검출 등의 간접적인 영향을 평가하는 방식이다. 그러나 상기 방식에 따르면, 감광성 화합물이 산화 방지능이나 라디칼 소거 활성을 갖는 경우에는 간섭으로 인해 감광활성 측정이 불가능하였다.
한편, 감광성 화합물과 기질의 직접적인 반응에 의해 유발되는 제1형 광산화반응과 연관된 감광활성을 검출할 수 있는 방법은 아직 보고된 바가 없다.
따라서, 감광성 화합물의 추적이나, 감광성 화합물에 의해 발생하는 다양한 산화 및 분해 반응의 관련 기전 연구를 위해, 감광성 화합물과의 직접적인 반응까지 평가할 수 있는, 종래와 차별화된 기술의 개발이 요구되고 있다.
Biochem Biophys Res Commun. 2010 Jul 2;397(3):603-7.
본 발명의 목적은 지금까지 측정이 어려웠던 감광활성을 측정하기 위한 새로운 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 감광활성 측정 제제를 이용하여 고감도의 시험을 편리하게 수행하기 위한 키트 및 방법들을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 포르마잔을 포함하는 감광활성 측정 제제를 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 (1) 감광성 화합물을 포함하는 시료를, 포르마잔을 포함하는 감광활성 측정 제제에 가하는 단계; (2) 상기 시료 및 상기 감광활성 측정 제제를 광에 노출시키는 단계; 및 (3) 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 분석하는 단계를 포함하는, 감광활성 측정 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 포르마잔을 포함하는 감광활성 측정 제제; 및 감광성 화합물을 포함하는, 광노출 측정 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 (1) 상기 감광활성 측정 제제 및 감광성 화합물을 포함하는 광노출 측정 키트를 준비하는 단계; (2) 상기 광노출 측정 키트와 광원 사이에 시료를 배치하는 단계; (3) 상기 광원으로부터 파장별 광을 발생하여 시료에 투과시키는 단계; 및 (4) 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 분석하는 단계를 포함하는, 시료의 광흡수 파장 측정 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명은 (1) 감광성 화합물을 포함하는 시료를, 포르마잔을 포함하는 감광활성 측정 제제에 가하고 광에 노출시키면서, 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 분석하는 단계; (2) 감광성 화합물을 포함하는 시료를 광에 노출시키면서, 발생되는 활성산소종(ROS)을 검출하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (1)의 결과와 상기 단계 (2)의 결과를 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 단계 (1)과 (2)에서 사용하는 감광성 화합물은 광노출이 되지 않은 동일한 화합물인, 감광성 화합물의 광산화반응 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 감광활성 측정 제제는, 감광성 화합물과 직접적으로 반응하여 신속하고 간편하게 감광활성을 측정할 수 있으며 정량적인 측정도 가능하다.
상기 감광활성 측정 제제는, 다양한 구성의 측정 키트 또는 방법에 적용되어, 각종 감광성 화합물의 추적과 감광성 화합물의 화학 반응에 관련된 광범위한 연구 및 산업적 활용을 가능하게 한다.
도 1의 (a) 내지 (c)는 각각 프로토포르피린 IX, 리보플라빈, 및 메틸렌블루에 대해 농도 별로 광노출 시간에 따른 본 발명의 제제의 탈색 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 각 감광성 화합물에 대해 암소에서의 본 발명의 제제의 색상 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3의 (a)는 다양한 감광성 화합물에 대해 광노출 시간과 본 발명의 제제의 탈색 정도 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다. (b)는 다양한 감광성 화합물의 농도와 본 발명의 제제의 탈색 정도 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다. (c)는 다양한 감광성 화합물의 농도와 본 발명의 제제의 반감기 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 4의 (a) 및 (b)는 각각 강황(turmeric) 및 모나스쿠스에 대해 농도 별로 광노출 시간에 따른 본 발명의 제제의 탈색 정도를 나타낸 그래프이다. (c)는 각 감광성 화합물에 대해 농도와 본 발명의 제제의 반감기 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 5의 (a) 내지 (c)는 각각 MTT 포르마잔, TTC 포르마잔 및 INT 포르마잔에 대해 다양한 감광성 화합물과의 광노출 시간에 따른 탈색 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6의 (a) 내지 (c)는 서로 다른 방식으로 감광성 화합물들의 감광활성을 정량 평가한 결과이다.
도 7의 (a)는 다양한 감광성 화합물에 대해 광노출 이력에 따라 본 발명의 제제의 탈색 정도를 나타낸 그래프이다. (b)는 다양한 감광성 화합물에 대해 광노출 시간과 본 발명의 제제의 탈색 정도 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 8은 광의 세기에 따라 감광성 화합물에 의해 본 발명의 제제가 탈색되는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 시료의 광흡수 파장 측정 방법을 나타낸 것이다.
도 10 및 11는 광산화반응을 판별하는 방법을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은, 포르마잔을 포함하는 감광활성 측정 제제를 제공한다.
포르마잔(formazan)은 생명/의학 관련 분야에서 조직 및 세포의 생존도, 탈수소효소, 환원효소 등의 평가에 사용되었던 테트라졸륨 염(tetrazolium salt)의 환원에 의해서 생성되는 발색체이다.
상기 포르마잔은 색상을 띌 수 있으며, 이에 따라 상기 감광활성 측정 제제는 유색의 제제일 수 있다. 예를 들어, 상기 감광활성 측정 제제는 청자색, 적자색 등을 띌 수 있다.
상기 포르마잔은 INT(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride), MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide), XTT(2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide), MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium), TTC(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride) 등의 테트라졸륨 염이 환원되어 형성된 포르마잔일 수 있다.
바람직한 일례로서, 상기 포르마잔은 MTT 포르마잔일 수 있다.
바람직한 다른 예로서, 상기 포르마잔은 TTC 포르마잔, INT 포르마잔, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
바람직한 또 다른 예로서, 상기 포르마잔은 MTT 포르마잔, TTC 포르마잔, INT 포르마잔, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 감광활성 측정 제제는 포르마잔 외의 다른 보조 성분 없이도 감광활성의 측정이 가능할 수 있다. 이에 따라, 상기 감광활성 측정 제제는 포르마잔 외의 다른 보조 성분을 더 포함하지 않을 수 있다. 즉 상기 감광활성 측정 제제는 포르마잔으로만 이루어질 수 있다.
한편, 상기 감광활성 측정 제제는 필요에 따라 포르마잔 외의 다른 성분들을 더 포함하는 조성물일 수 있다.
예를 들어, 상기 감광활성 측정 제제는 용매를 더 포함할 수 있고, 즉 상기 감광활성 측정 제제는 포르마잔이 용매 중에 용해된 용액의 형태일 수 있다.
상기 용매는 수성 용매, 유기 용매, 또는 이들의 혼합 용매일 수 있다. 또한, 상기 용매는 극성 용매, 비극성 용매, 또는 이들의 혼합 용매일 수 있다. 또한, 상기 용매는 양자성 용매, 비양자성 용매, 또는 이들의 혼합 용매일 수 있다.
또한 포르마잔의 용액 중 농도는 50~500μM일 수 있다.
대체로 소수성을 갖는 포르마잔은 수용성 시료와 혼화성(compatibility)이 좋지 않은 문제가 있으므로, 이를 해결하기 위해, 상기 감광활성 측정 제제는 수용성 시료와의 혼화성을 증진시킬 수 있는 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 수산화나트륨(NaOH) 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 이에 따라 포르마잔의 발색도를 향상시켜 측정 감도를 개선하는 효과를 가질 수 있다.
일례로서, 상기 감광활성 측정 제제는 포르마잔이 디메틸설폭사이드 중에 용해된 것일 수 있다. 다른 예로서, 상기 감광활성 측정 제제는 포르마잔이 수산화나트륨 수용액 중에 용해된 것일 수 있으며, 이때 수산화나트륨 수용액의 농도는 0.001~0.5 N일 수 있다. 다만, 수용성인 TTC 포르마잔, XTT 포르마잔, 및 MTS 포르마잔은 수용성 시료를 바로 가하여 사용하는 것도 가능하다.
상기 감광활성 측정 제제는, 감광성 화합물을 포함하는 시료의 감광활성을 측정하는데 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 감광활성 측정 제제는, 감광성 화합물을 포함하는 시료와 함께 광노출 시에 탈색되는 정도에 의해 감광활성을 측정할 수 있다.
예를 들어, 상기 감광활성 측정 제제는 초기에 유색을 띠고, 여기에 감광성 화합물을 포함하는 시료를 가한 후 광에 노출시키면 탈색이 되는데, 이와 같은 탈색의 정도를 분석하여 상기 감광성 화합물의 감광활성을 측정해낼 수 있다.
본 발명의 감광활성 측정 제제를 이용하여 감광활성을 측정할 수 있는 감광성 화합물은 매우 다양하며, 예를 들어 종래에 알려진 다양한 감광제, 염료 등 뿐만 아니라, 종래에는 평가가 어려웠던 식용색소도 대상이 될 수 있다.
본 발명의 감광활성 측정 제제는, 광에 의해 활성화된 감광성 화합물과의 직접적인 반응에 의해, 포르마잔이 분해되면서 탈색이 진행된다. 즉, 본 발명의 감광활성 측정 제제는 제1형 광산화반응과 연관된 감광활성을 측정할 수 있다.
이와 같이 상기 감광활성 측정 제제를 이용하여 감광성 화합물의 감광활성을 측정할 수 있다.
즉, 본 발명은 (1) 감광성 화합물을 포함하는 시료를, 포르마잔을 포함하는 감광활성 측정 제제에 가하는 단계; (2) 상기 시료 및 상기 감광활성 측정 제제를 광에 노출시키는 단계; 및 (3) 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 분석하는 단계를 포함하는, 감광활성 측정 방법을 제공한다.
상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도는, 예를 들어, 아래 수학식 1에 따라 분석될 수 있다:
[수학식 1]
탈색 정도(%) = (Ai - Af) / Ai x 100
상기 식에서, Ai 및 Af는 각각 광노출 이전 및 이후의 광흡수율이다.
상기 시료 내의 감광성 화합물은 광노출에 의해 활성화되면서 상기 감광활성 측정 제제 내의 포르마잔과 반응하고, 그에 따라 유색의 포르마잔은 분해되어 색상을 잃게 된다.
상기 방법에서, 감광성 화합물의 감광활성 반응이 활발할수록 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도가 증가한다. 구체적으로, 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도는, 상기 감광성 화합물의 감광활성의 강도, 상기 감광성 화합물의 농도, 광의 세기, 및 광에 노출된 시간에 비례하여 증가할 수 있다.
상기 방법에 따르면, 시료 내에 미량의 농도로 함유된 감광성 화합물의 감광활성도 측정해낼 수 있다. 예를 들어, 상기 감광성 화합물은 상기 시료 내에 1 mM 이하의 농도, 100μM 이하의 농도, 또는 0.01μM 내지 100μM의 농도로 포함될 수 있으며, 이와 같은 미량의 농도에도 고감도의 감광활성 측정 결과를 제공할 수 있다.
또한, 상기 방법에 따르면, 제2형 광산화반응을 평가할 수 있었던 종래의 제제로는 불가능하였던 감광성 화합물의 검출이 가능하다. 일례로서, 상기 방법에 적용되는 시료의 감광성 화합물은 광노출 시에 활성산소종을 발생하지 않는 것일 수 있다. 다른 예로서, 상기 방법에 적용되는 시료의 감광성 화합물은 광노출 시에 2',7'-다이클로로다이하이드로플루오레세인(DCFH)의 형광 변화를 일으키지 않는 것일 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 방법에 적용되는 시료의 감광성 화합물은 항산화성을 갖는 것일 수 있다.
측정 시간의 단축을 위해 광노출 강도를 높이거나 온도를 높여 측정하는 것도 고려해볼 수 있다. 예를 들어, 반응을 신속히 하기 위해 광에 노출 시의 온도를 30~50℃ 정도로 높여 수행할 수 있다.
본 발명의 감광활성 측정 제제를 이용하여, 광노출 시간 또는 이력을 추정할 수 있다. 즉, 본 발명은 또한 포르마잔을 포함하는 감광활성 측정 제제; 및 감광성 화합물을 포함하는, 광노출 측정 키트를 제공한다.
상기 키트 내에 포함되는 포르마잔과 상기 감광성 화합물의 몰비는 감광활성의 정도에 따라 조절될 수 있고, 예를 들어 1:1 내지 100:1의 범위일 수 있다.
상기 키트에 사용되는 포르마잔 및 감광성 화합물의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 포르마잔은 MTT 포르마잔, TTC 포르마잔, INT 포르마잔 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되고; 상기 감광성 화합물이 프로토포르피린 IX, 리보플라빈, 메틸렌블루, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 광노출 측정 키트는 포르마잔의 존재로 인해 초기에는 유색을 띌 수 있다. 상기 광노출 측정 키트는 광노출에 따라 지속적으로 탈색이 진행되고, 광이 차단되면 탈색이 즉각 정지하거나 지연된다.
이에 따라, 상기 광노출 측정 키트는 광노출 시간(누적시간)을 추정하는데 사용할 수 있다.
구체적인 일례로서, 상기 감광성 화합물이 프로토포르피린 IX이고, 상기 포르마잔이 MTT 포르마잔인 경우, 상기 광노출 측정 키트는 아래 수학식 2에 의해 광노출 시간을 추정할 수 있다:
[수학식 2]
광노출 시간(분) = [ (Ai - Af) / Ai x 100 ] x 1.64 - 4.08
상기 식에서, Ai 및 Af는 각각 광노출 이전 및 이후의 광흡수율이다
또한, 상기 광노출 측정 키트는 광노출 이력을 추정하는데 사용할 수 있다. 즉, 상기 광노출 측정 키트는, 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 시간대별로 측정 및 기록하는 장치를 추가로 구비하여, 광노출 이력을 추정할 수 있다.
또한, 상기 광노출 측정 키트를 이용하여 감광성 화합물을 포함하는 시료의 파장대별 광흡수율을 평가할 수 있다.
즉, 본 발명은 (1) 상기 감광활성 측정 제제 및 감광성 화합물을 포함하는 광노출 측정 키트를 준비하는 단계; (2) 상기 광노출 측정 키트와 광원 사이에 시료를 배치하는 단계; (3) 상기 광원으로부터 파장별 광을 발생하여 시료에 투과시키는 단계; 및 (4) 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 분석하는 단계를 포함하는, 시료의 광흡수 파장 측정 방법을 제공한다.
상기 방법에 따르면, 광원에서 발생한 광은 시료를 투과하면서 시료에 흡수되거나 흡수되지 않을 수 있다. 이때 시료에 흡수되지 않은 광은 광노출 측정 키트에 도달하여 탈색을 유발한다(도 9 참조). 반면, 시료에 흡수된 광은 광노출 측정 키트에 도달하지 못하여 탈색을 유발하지 못한다.
이를 이용하여 시료의 파장대별 광흡수율을 평가할 수 있으며, 이는 다양한 분야에 활용될 수 있다. 예를 들어, 투과성이 좋은 적외선, 원적외선에 감작할 수 있는 감광제의 선별을 통해 의약학계에서 광역동 치료(photodynamic therapy)에 활용할 수 있다. 또한 태양전지, 폐수처리 및 오염물질의 제거, 유해균의 살균 등 다방면에 응용되는 각종 감광제의 선별이 가능하다.
또한, 상기 감광활성 측정 제제를 이용하여 감광성 화합물의 광산화반응의 종류를 판별할 수 있다.
즉, 본 발명은 (1) 감광성 화합물을 포함하는 시료를, 포르마잔을 포함하는 감광활성 측정 제제에 가하고 광에 노출시키면서, 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 분석하는 단계; (2) 감광성 화합물을 포함하는 시료를 광에 노출시키면서, 발생되는 활성산소종(ROS)을 검출하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (1)의 결과와 상기 단계 (2)의 결과를 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 단계 (1)과 (2)에서 사용하는 감광성 화합물은 광노출이 되지 않은 동일한 화합물인, 감광성 화합물의 광산화반응 판별 방법을 제공한다.
이때 상기 단계 (2)는, 감광성 화합물을 포함하는 시료를 활성산소종 검출 제제(DCFH 등)에 가하고 광에 노출시키면서, 상기 활성산소종 검출 제제의 변화(형광 변화 등)를 분석하는 것으로 수행될 수 있다.
본 발명의 감광활성 측정 제제는, 광에 의해 활성화된 감광성 화합물과 직접적으로 반응을 일으키는 제1형 광산화반응과 연관되어 있다. 반면, 종래의 DCFH와 같은 제제들은, 광에 의해 활성화된 감광성 화합물이 부산물(ROS 등)을 생성하는 제2형 광산화반응을 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제제와 종래의 제제를 모두 사용하는 상기 판별 방법에 의하면, 시료의 광산화반응을 판별하는 것이 가능하다(도 10 참조).
한편, 일반적으로 제1형 광산화반응과 제2형 광산화반응이 독립적으로 일어나기 보다는 동시에 발생하는 경우가 빈번하다. 따라서 감광성 시료에 대해 본 발명의 감광활성 측정 제제와, ROS 검출 제제(DCFH 등)를 각각 시험해서 비교해보면, 감광성 시료가 갖는 특성과 광산화반응의 기전에 대해 판별할 수 있다(도 11 참조). 이를 활용할 수 있는 분야는 많으며, 예를 들어, 식품 중의 광산화 과정에서 나타나는 변패현상에 대한 예측과 방지에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
단 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에 사용된 재료들은 아래와 같다:
- 식용색소류: 강황(tumeric), 모나스쿠스(monascus) 등 21개 시료를 ES식품원료(군포, 한국)에서 구매하였다.
- MTT 포르마잔, INT 포르마잔, TTC 포르마잔, 및 2',7'-다이클로로다이하이드로플루오레세인 다이아세테이트(DCFH-DA)를 시그마알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다.
- 다이메틸설폭사이드(DMSO)를 대정화학(서울, 한국)에서 구매하였다.
- 그 외 프로토포르피린 IX (PPIX), 징크 프로토포르피린 (ZnPP), 리보플라빈(Rf), 메틸렌블루(MB) 등의 시료들을 시그마알드리치(St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다.
이하의 실시예에 사용된 장치들은 아래와 같다:
- 광 조사 장치는 자연광 또는 일반 형광등을 포함한 다양한 LED와 광도별 조사장치(B&B Co., 서울, 한국)를 사용하였다.
- 흡광도와 형광도 측정장치는 Spectra Max M3 마이크로 플레이트 판독기(Molecular device, Sunnylvale, CA, USA)를 사용하였다.
- 항온 반응을 위한 반응장치는 비전과학 항온기(서울, 한국)를 사용하였다.
이하의 실시예에서 탈색 정도(%)는 아래의 수학식 1에 따라 계산되었다:
[수학식 1]
탈색 정도(%) = (Ai - Af) / Ai x 100
상기 식에서, Ai 및 Af는 각각 광노출 이전 및 이후의 광흡수율이다.
이때 백그라운드에 해당하는 암소에서의 광흡수율을 측정하여 보정하였다.
또한 색유지율(%)은, 상기 탈색정도(%)를 먼저 산출한 후 이를 100에서 뺀 값으로 하였다.
실시예 1: 반응의 보편성, 신속성 및 광의존성 평가
다양한 감광성 시료들을 본 발명의 제제에 가하고 광노출 후 탈색 정도를 평가하여, 그 결과를 도 1의 (a) 내지 (c)에 나타내었다. 또한, 동일한 화합물들에 대해 광을 차단한 암소 조건에서 360분간 보관한 뒤 색유지율을 평가하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
- 감광성 시료: PPIX, Rf, MB - 농도 변화
- 제제 구성: 80μM MTT 포르마잔의 DMSO 용액
- 광노출 조건: 27W 형광등에 대해 30cm 거리에서 노출
도 1의 (a) 내지 (c)에서 보듯이, 본 발명의 제제는 구조적으로 상이한 감광성 시료들(PPIX, Rf, MB)에 대해 모두 반응하였으며, 그 반응은 감광성 시료의 종류 별로 차이가 있지만 비교적 신속하게 일어났음을 알 수 있다(도 1의 (a) 내지 (c)에 표기된 농도는 감광성 시료를 제제에 가하여 얻은 DMSO 용액 중의 농도이다). 또한, 도 2에서 보듯이, 광을 차단한 경우에는 본 발명의 제제의 탈색이 발생하지 않았다.
실시예 2: 반응의 민감성 및 정량성 평가
다양한 감광성 시료들을 본 발명의 제제에 가하고 광노출 후 탈색 정도를 측정하여, 그 결과를 도 3의 (a) 내지 (c)에 나타내었다.
- 감광성 시료: PPIX, Rf, MB
- 제제 구성: 80μM MTT 포르마잔의 DMSO 용액
- 광노출 조건: 27W 형광등에 대해 30cm 거리에서 노출
도 3에서 보듯이, 본 발명의 제제는 일부 감광성 시료의 경우 나노몰 수준의 극미량에 대해서도 민감하게 반응하였으며, 광노출 시간 또는 감광성 시료의 농도와 탈색 정도 간에 매우 정확한 정량적 관계를 나타내었다.
실시예 3: 식용색소의 감광활성 측정 (DCFH를 이용한 측정과의 비교)
다양한 식용색소들을 본 발명의 제제에 가하고 광에 노출시키면서 시험하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 또한, 동일한 식용색소들에 대해서 종래의 제제로 시험하여 그 결과를 표 1에서 함께 비교하였다.
- 감광성 시료: 식용색소류
- 제제 구성: 80μM MTT 포르마잔의 DMSO 용액
이때 감광성 시료의 농도를 고정하고, 3시점 이상에서 탈색 정도를 측정하여 광노출 시간과 탈색 정도 간의 선형의 상관관계 수식을 얻은 후, 상기 수식으로부터 탈색 정도가 50%가 되는 시간(반감기)을 산출하였다.
광파장 시료명 농도(mg/mL) 반감기(h) DCFH 형광
420nm Cacao color 300 0.25 5.3±0.1 미검출
Orange color AC-5104 2.5 5.7±0.5 미검출
P212 Caramel color 1 21.3±2.1 미검출
Red color RR 10 35.4±1.0 미검출
Safflower yellow AC-5102 10 89.1±1.5 미검출
Curcumin 20 (μM) 5.8±0.5 형광 검출
Turmeric 0.03 3.8±0.2 미검출
465nm Gardenia yellow AC-5108 10 52.2±3.0 미검출
Green color ES 2.5 61.2±1.7 미검출
Green color GG-8610 2.5 45.8±0.6 미검출
Parprika oleoresin 0.5 37.0±2.0 미검출
Hydrophilic parprika 5E 0.5 20.5±1.9 미검출
520nm Monascus color 0.25 7.1±1.5 형광 검출
Red color PB 0.25 86.9±1.7 미검출
Red cabbage color 100 10 55.9±1.0 미검출
Grape skin color 4 62.8±1.7 미검출
Red cabbage color 5 29.4±3.9 미검출
550nm Cherry red 10 75.8±2.7 미검출
Red color CG2 4 27.8±2.2 미검출
605nm Blue color ES 5 24.8±1.0 미검출
Gardenia blue 27 0.25 6.4±0.3 미검출
상기 표 1에서 보듯이, 본 발명의 제제는 다양한 식용색소들에 대해 반응하여 검출이 가능했던 반면, 종래의 DCFH를 이용한 측정 방법에 의해서는 대부분의 식용색소가 검출되지 않았다.
실시예 4: 식용색소의 감광활성 측정 (정량 평가)
식용색소들을 본 발명의 제제에 가하고 광에 노출시키면서 시험하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
- 감광성 시료: 강황, 모나스쿠스 - 농도 변화
- 제제 구성: 80μM MTT 포르마잔의 DMSO 용액
- 광노출 조건: 27W 형광등에 대해 30cm 거리에서 노출
도 4에서 보듯이, 본 발명의 제제는 식용색소들에 대해 정량적 감광활성을 나타내었다.
실시예 5: 제제 구성의 다양화
감광성 시료를 본 발명의 제제에 가하고 광에 노출시키면서 시험하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
- 감광성 시료: Rf, ZnPP, PPIX - 각 10μM 농도
- 제제 구성: MTT 포르마잔, TTC 포르마잔, 또는 INT 포르마잔의 DMSO 용액
- 광노출 조건: 27W 형광등에 대해 30cm 거리에서 240분간 노출
도 5에서 보듯이, 다양한 구성의 본 발명의 제제들이 모두 감광성 시료에 반응하여 우수한 검출 성능을 나타내었다.
실시예 6: 정량적 측정 - 탈색 정도
감광성 시료들을 본 발명의 제제에 가하고 광에 노출한 뒤 탈색 정도를 측정하여, 그 결과를 도 6의 (a)에 나타내었다.
이때 감광성 시료의 농도와 광노출 조건을 동일하게 하였다.
- 감광성 시료: PPIX, Rf, MB - 각 2.5μM 농도
- 제제 구성: 80μM MTT 포르마잔의 DMSO 용액
- 광노출 조건: 27W 형광등에 대해 30cm 거리에서 노출
도 6의 (a)에서 보듯이, 감광성 시료 별로 감광활성의 정도를 정량적으로 평가할 수 있었다.
실시예 7: 정량적 측정 - 반감기
감광성 시료들을 본 발명의 제제에 가하고 광에 노출한 뒤 탈색 정도가 50%가 되는 시간(반감기)을 측정하여, 하기 표 2 및 도 6의 (b)에 나타내었다.
- 감광성 시료: PPIX, Rf, MB - 각 2.5μM 농도
- 제제 구성: 80μM MTT 포르마잔의 DMSO 용액
- 광노출 조건: 27W 형광등에 대해 30cm 거리에서 노출
구체적으로, 감광성 시료의 농도를 고정하고, 3시점 이상에서 탈색 정도를 측정하여 광노출 시간과 탈색 정도 간의 선형의 상관관계 수식을 얻은 후, 상기 수식으로부터 탈색 정도가 50%가 되는 시간(반감기)을 산출하였다.
기울기 절편 R2 반감기(h) 상대값
PPIX 0.61 2.49 1.00 1.31 14.63
Rb 0.04 1.43 0.98 19.13 1.00
MB 1.05 4.60 0.99 0.72 26.44
상기 표 2 및 도 6의 (b)에서 보듯이, 감광성 시료 별로 감광활성의 정도를 정량적으로 평가할 수 있었다.
실시예 8: 정량적 측정 - DC 50
감광성 시료들을 본 발명의 제제에 가하고 광에 노출한 뒤 탈색 정도가 50%가 되는 시료 농도(DC50)을 측정하여, 그 결과를 하기 표 3 및 도 6의 (c)에 나타내었다.
- 감광성 시료: PPIX, Rf, MB - 농도 변화
- 제제 구성: 80μM MTT 포르마잔의 DMSO 용액
- 광노출 조건: 27W 형광등에 대해 30cm 거리에서 60분간 노출
구체적으로, 광노출 시간을 고정하고, 3농도 이상에서 탈색 정도를 측정하여 시료 농도와 탈색 정도 간의 선형의 상관관계 수식을 얻은 후, 상기 수식으로부터 탈색 정도가 50%가 되는 시료 농도(DC50)을 산출하였다.
기울기 절편 R2 DC50 (M) 상대값
PPIX 15.97 1.49 1.00 3.04 13.23
Rb 1.24 0.17 0.94 40.18 1.00
MB 39.38 0.16 0.94 1.27 31.74
상기 표 3 및 도 6의 (c)에서 보듯이, 감광성 시료 별로 감광활성의 정도를 정량적으로 평가할 수 있었다.
실시예 9: 광노출 시간 평가
본 발명의 제제와 감광성 화합물을 조합하여 광노출 측정 키트를 제조하고, 상기 키트에 광노출과 광차단을 반복하면서 탈색 정도를 측정하였다.
- 제제 구성: 80μM MTT 포르마잔의 DMSO 용액
- 키트 I 구성: 제제 + MB (2.5μM)
- 키트 II 구성: 제제 + PPIX (2.5μM)
- 키트 III 구성: 제제 + Rf (10μM)
- 광노출 조건: 27W 형광등에 대해 30cm 거리에서 노출 / 상온의 암소
이때 광노출와 광차단이 이루어진 모든 시간대별로 탈색 정도를 측정하여, 그 결과를 도 7의 (a)에 나타내었다. 도 7의 (a)에서 보듯이, 키트는 광노출에 따라 지속적인 탈색이 진행되었으나, 광을 차단한 경우 탈색이 신속히 정지되거나 지연되는 현상을 뚜렷이 나타내었다. 따라서, 키트를 이용하여 광노출의 이력을 추정할 수 있었다.
또한, 도 7의 (a)의 그래프를 이용하여, 광노출 시간(광 차단 시간 제외)과 탈색 정도 간의 상관관계 그래프를 작도하여 도 7의 (b)에 나타내었다. 도 7의 (b)에서 보듯이, 키트를 이용한 시험에서 광노출 시간-탈색 정도 간에 선형의 상관관계를 보였다.
또한, 도 7의 (b)의 그래프를 이용하여, 수식의 기울기와 절편을 얻고, 이를 이용하여 실제 광노출 시간을 추정해 보았으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
키트 수식 광노출 시간 (분)
기울기 절편 실제 추정값
III 0.71 11.07 120 107.6
II 0.61 2.49 120 115.4
I 0.19 0.88 240 211.6
상기 표 4에서 보듯이, 키트에서 얻은 결과를 바탕으로 추정한 광노출 시간은, 실제 광노출 시간에 거의 근접하였다.
실시예 10: 광노출 강도 평가
본 발명의 제제와 감광성 화합물을 조합하여 광노출 측정 키트를 제조하고, 상기 키트를 광에 노출시키면서 탈색 정도를 평가하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 이때, 광의 세기를 변화시켜가며 시험하였다.
- 제제 구성: 80μM MTT 포르마잔의 DMSO 용액
- 키트 구성: 제제 + PPIX (1μM)
- 광 조사 조건: 5W, 7.5W, 15W, 27W 형광등에 대해 30cm 거리에서 노출
도 8에서 보듯이, 광의 세기에 비례하여 탈색 정도가 증가하였으므로, 키트를 이용한 광노출의 강도 평가가 가능하였다.

Claims (16)

  1. 포르마잔을 포함하는 감광활성 측정 제제로서,
    감광성 화합물과 함께 광노출 시에 감광성 화합물과 직접 반응하여 탈색되는 정도에 의해 감광활성을 측정하는 것인, 감광활성 측정 제제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 포르마잔이 MTT 포르마잔을 포함하는, 감광활성 측정 제제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 포르마잔이 TTC 포르마잔, INT 포르마잔 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 감광활성 측정 제제.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 감광활성 측정 제제가 디메틸설폭사이드 및 수산화나트륨 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 감광활성 측정 제제.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 감광활성 측정 제제가, 감광성 화합물을 포함하는 시료와 함께 광노출 시에 탈색되는 정도에 의해 감광활성을 측정하는 것인, 감광활성 측정 제제.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 감광활성 측정 제제가, 제 1 형 광산화반응(type I photooxidation)과 연관된 감광활성을 측정하는, 감광활성 측정 제제.
  7. (1) 감광성 화합물을 포함하는 시료를, 제 1 항의 감광활성 측정 제제에 가하는 단계;
    (2) 상기 시료 및 상기 감광활성 측정 제제를 광에 노출시키는 단계; 및
    (3) 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 분석하는 단계를 포함하는, 감광활성 측정 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 탈색 정도가
    상기 감광성 화합물의 감광활성의 강도, 상기 감광성 화합물의 농도, 광의 세기, 및 광에 노출된 시간에 비례하여 증가하는, 감광활성 측정 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 탈색 정도가 아래 수학식 1에 따라 분석되는, 감광활성 측정 방법:
    [수학식 1]
    탈색 정도(%) = (Ai - Af) / Ai x 100
    상기 식에서, Ai 및 Af는 각각 광노출 이전 및 이후의 광흡수율이다.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 감광성 화합물이 광노출 시에 2',7'-다이클로로다이하이드로플루오레세인(DCFH)의 형광 변화를 일으키지 않는, 감광활성 측정 방법.
  11. 제 1 항의 감광활성 측정 제제; 및
    감광성 화합물을 포함하는,
    광노출 측정 키트.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 감광활성 측정 제제가 MTT 포르마잔, TTC 포르마잔, INT 포르마잔 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 포르마잔을 포함하고;
    상기 감광성 화합물이 프로토포르피린 IX, 리보플라빈, 메틸렌블루, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는, 광노출 측정 키트.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 감광성 화합물이 프로토포르피린 IX이고, 상기 감광활성 측정 제제가 MTT 포르마잔을 포함하며, 이때 상기 광노출 측정 키트가 아래 수학식 2에 의해 광노출 시간을 추정하는, 광노출 측정 키트:
    [수학식 2]
    광노출 시간(분) = [ (Ai - Af) / Ai x 100 ] x 1.64 - 4.08
    상기 식에서, Ai 및 Af는 각각 광노출 이전 및 이후의 광흡수율이다.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 광노출 측정 키트가, 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 시간대별로 측정 및 기록하는 장치를 추가로 구비하여, 광노출 이력을 추정하는, 광노출 측정 키트.
  15. (1) 제 1 항의 감광활성 측정 제제 및 감광성 화합물을 포함하는 광노출 측정 키트를 준비하는 단계;
    (2) 상기 광노출 측정 키트와 광원 사이에 시료를 배치하는 단계;
    (3) 상기 광원으로부터 파장별 광을 발생하여 시료에 투과시키는 단계; 및
    (4) 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 분석하는 단계를 포함하는,
    시료의 광흡수 파장 측정 방법.
  16. (1) 감광성 화합물을 포함하는 시료를, 제 1 항의 감광활성 측정 제제에 가하고 광에 노출시키면서, 상기 감광활성 측정 제제의 탈색 정도를 분석하는 단계;
    (2) 감광성 화합물을 포함하는 시료를 광에 노출시키면서, 발생되는 활성산소종(ROS)을 검출하는 단계; 및
    (3) 상기 단계 (1)과 상기 단계 (2)의 결과를 비교하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 단계 (1)과 (2)에서 사용하는 감광성 화합물은 광노출이 되지 않은 동일 화합물인, 감광성 화합물의 광산화반응 판별 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2004065078A (ja) * 2002-08-05 2004-03-04 Niigata Prefecture ピルビン酸濃度の簡易判定キット及びピルビン酸濃度の簡易判定方法

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