JPH0533999B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、溶液中のアルコール、特にエタノー
ルの濃度を酵素法で測定する試験片に関するもの
であり、さらに詳細には、ニコチンアミド アデ
ニン ジヌクレオチド（以後NADと略す）又は、
ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチドフオ
スフエート（以後NADPと略す）と、好熱性細
菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼと、好熱性
細菌由来のジアホラーゼと、色素と、担体とから
なるアルコール検出用試験片に関するものであ
る。 溶液中のアルコール濃度の測定は、食品工業や
化学工業において、プロセス管理の目的で頻繁に
行われている。アルコールのうち、特にエタノー
ル濃度の測定は、医学や臨床検査部門において日
常的な測定項目であり、また、交通法規上では重
要な検査項目となつている。 溶液中のアルコール測定に利用されてきた多く
の化学的方法は、アルコールの酸化に要した酸化
剤の容量的な変化や酸化剤の色調変化による方法
が採用されている。これらの方法はすべて使用す
る酸化剤がアルコール以外の様々な揮発性物質と
反応しうるため、特異性を欠くという重大な難点
がつきまとつた。 このため、目的とする物質のみを特異的に測定
する物理化学的な方法として、ガスクロマトグラ
フイー、液体クロマトグラフイーによるアルコー
ルの分析方法が1960年代に開発されたが、それら
の方法は正確に定量ができ、特異的である反面、
分析に長時間を要し、特殊で高価な装置や、それ
を十分使いことなくしうる人材の育成が必要であ
り、汎用性に欠け、即時性、実用性に難点があつ
た。 一方、酵素を用いる生化学的分析方法は、化学
的方法や物理化学的方法に比べると一般的に特異
性に優れ、装置的にも特殊なもの、大型のものを
用いる必要がない等の利点があり、この方法とし
て、アルコールデヒドロゲナーゼを用いた方法
（スキヤンド・ジエイ・クリニ・ラボ・アンド
インベスト，358頁，1951年，ボニチエセン筆
著；Scand.J.Clin.Lab.and Invest.，358，1951，
R.Bonnichsen et al）やアルコールオキシダー
ゼを用いた方法（バイオキミ・バイオフイジ・ア
クタ 151巻330〜342頁，1968年，ジャンセン筆
著；Biochim.Biophys.Acta，151，330〜342，
1968，Frank.W.Janssen et al）が報告されてい
る。これらの方法はいずれも、溶液中で酵素反応
を行わせ、生成したニコチンアミド アデニンジ
ヌクレオチド還元型（以後NADHと略す）を
340nmで測定したり、生成した過酸化水素をパー
オキシダーゼの作用でオルトジアニシジンと反応
させ、その発色を436nmで測定したりする方法が
あり、またNADHの測定法として、ジアホラー
ゼと色素とを組合せた報告（アーチ・バイオキ
ミ・バイオフイジ・132巻，91頁，1969年，カプ
ラン筆著；Arch.Biochim.Biochys.，132，91，
1969，F.Kaplan et al）もあるが、光学的な方
法であるため、分光光度計などの装置はやはり必
要であり、血液や食品などのように混濁したサン
プルの場合は測定が不可能であつた。また、酵素
反応を行わせるには、種々の試薬を溶解した上
で、反応器中に所定量ずつ分注する操作が必要
で、煩雑であり、溶解した試薬の保存性も悪く、
汎用性に欠けている。 このような欠点を克服するために、酵素的方法
と電気化学的方法とを組合せてアルコールを測定
する方法が研究されており、酵素電極法として例
えば、特公昭57−56019号公報には、アルコール
デヒドロゲナーゼ（アルコール脱水素酵素）を用
いた方法が記載されている。この方法は酵素反応
でエタノールから生成した水素を酸化−還元系を
用いて電気的に測定するもので、酵素固定化膜や
電気的な測定装置が必要であり、酵素膜は耐久性
に乏しく、液体酵素膜は４℃で２日間、酵素固定
化膜でも２週間の安定性しかなく、実用的でな
い。また、測定に要するサンプルも電極を十分ひ
たす量、すなわち比較的多量のサンプルが必要と
考えられ、臨床検査に用いる時などは採血する血
液量に限界があることから、やはりこの方法も汎
用性、一般性、実用性に欠けている。 したがつて、当業界では持ち運びが容易で、特
別の装置、技術を要することなく、任意の場所で
簡便に、微量のサンプルでアルコール濃度が測定
できる方法が臨まれながら、それらすべてを満足
する方法のないまま今日に至つているのが現状で
ある。 本発明者らは、かかる現状に鑑み、食品製造管
理、急性アルコール中毒症の診断や交通取締りの
現場から持ち運びが容易で特別の装置、技術を要
することなく、任意の場所で簡便に、微量のサン
プルで、アルコール濃度を検出することができる
アルコールの測定について鋭意研究を重ねた結
果、NAD又はNADPと、好熱性細菌由来のアル
コールデヒドロゲナーゼと、好熱性細菌由来のジ
アホラーゼと、色素と、担体とからなる試験片
が、極く微量の被検液でも被検液中のアルコール
の含有量に応じて発色又は脱色し、アルコール濃
度が測定でき、しかも保存安定性がよく、上記の
目的が達成されることを見い出し、本発明を完成
するに至つた。 すなわち、本発明は、(a)NAD又はNADPと、
(b)好熱性細菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼ
と、(c)好熱性細菌由来のジアホラーゼと、(d)色素
と、(e)担体とからなるアルコール検出用試験片で
ある。 本発明の試験片は、アルコールを含有する溶液
を含浸させると、直ちにアルコールと酵素反応を
起こし、まずアルコールがNAD又はNADPの存
在下、好熱性細菌由来のアルコールデヒドロゲナ
ーゼによつてアルデヒドとNADH又はNADPH
に変換される段階（反応式−１）、次に生成した
NADH又はNADPHは好熱性細菌由来のジアホ
ラーゼによつて色素に水素を移され、その結果色
素は退色もしくは発色する段階とからなつている
（反応式−２）。アルコール量の測定は試験片をア
ルコールを含む溶液に浸し、その退色あるいは発
色の程度や速さを視認することで行われる。反応
式−１ アルコールデヒドロゲナーゼ アルコール＋NAD（Ｐ）NAD（Ｐ）Ｈ＋アル
デヒド 反応式 ２ ジアホラーゼ NAD（Ｐ）Ｈ＋色素（酸化型）NAD（Ｐ）＋
色素（還元型） 本発明に用いられる酵素のうち、アルコールデ
ヒドロゲナーゼは、一般に、Alcohol：NAD
oxidoreductase，EC １，１，１，１や
Alcohol；NAD（Ｐ）oxidoreductase，EC １，
１，１，２に分類されるものであつて、好熱性細
菌由来のものを用いることが必要である。この好
熱性細菌由来のアルコールデヒドロゲナーゼを得
る場合には、常法に従つて精製すればよく、例え
ば、バチルス ステアロサーモフイラス
（Bacillus stearothermophilus）からアルコール
デヒドロゲナーゼを精製するには、バイオケミカ
ル ジヤーナル 127巻，３号63〜64頁，1972年
（Biochem.J.127，３，63−64，1972，A.
ATKINSON）や、エフ．イー．ビー．エス．レ
ター．33巻，１号１〜３頁，1973年（F.E.B.S.
Lett.，33，１，１〜３，1973，Bridgen，John）
の方法を用いることができる。 またジアホラーゼは、NADH：lipoamide
oxidoreductase Ｅ Ｃ 1.6.4.3や、ジアホラー
ゼNADH：dye oxidoreductase Ｅ Ｃ 1.6.99
に分類されるものであつて、用いる色素を還元で
きる好熱性細菌由来のジアホラーゼを用いること
が必要である。例えばバチルス ステアロサーモ
フイラスのジアホラーゼを得るには、バイオケミ
カル ジヤーナル 191巻，457〜465頁，1980年
（Biochem.J.191，457〜465，1980）に従えばよ
い。 さらにNAD、NADPも試薬として、例えば各
社（ベーリンガーマンハイム山之内社，オリエン
タル酵母社，シグマ社，生化学工業社）から市販
されているものを用いればよい。色素としては、
ジアホラーゼの作用によつて発色もしくは退色す
るものならいかなるものでもよく、例えばフエリ
シアン化合物や一般にホルマザン色素と呼ばれる
ものがあり、前者の例としては、フエリシアン化
カリウム、後者の例としては、ヨードニトロテト
ラゾリウム塩を用いることができる。またその他
の色素として、メチレンブルー、２，６−ジクロ
ルフエノールインドフエノール、インジゴカルミ
ン、アマランスなどをあげることができ、測定者
の安全衛生上の観点から安全性が確認されている
色素、すなわち食品添加物として許可されている
ものや、医薬として用いられているインジゴカル
ミン、アマランス、メチレンブルーを用いるのが
好ましい。このように安全が確認されている色素
を用いたアルコール検出用試験片は、唾液中のア
ルコール濃度の検出に最適で、交通法規上のエタ
ノール測定にメリツトが甚大である。 また、本発明の試験片に用いる担体としては、
常温で水に不溶性もしくは難溶性（溶解度1.0％
以下、25℃）のものならばいかなるものでもよ
く、例えばゼラチン、寒天、サイクロデキストリ
ン、セルロース、紙、キチン、グルカンなどに代
表される天然物の低分子から高分子のものや、レ
ーヨン、ビニロン、ポリエステル、ある種のポリ
ビニルアルコール、ナイロン、アクリルなどの半
合成から合成高分子のいずれをも用いることがで
きる。大きさや厚さ、形状は任意のものを用いれ
ばよい。 本発明の試験片を作るにあたつて、それぞれの
試薬の濃度は次のようにすればよい。例えば、１
モル／の濃度のアルコール検出用試験片を作る
場合、色素は0.01〜10モル／、好ましくは
0.1／2.0モル／、最も好ましくは0.2〜1.0モ
ル／とすればよく、アルコールデヒドロゲナー
ゼやビアホラーゼはそれぞれ10²〜10¹¹ユニツ
ト／、好ましくは10⁴〜10⁹ユニツト／、最も
好ましくは10⁶〜10⁸ユニツト／とすればよい。
またNADやNADPは、0.001〜2.0モル／、好
ましくは0.01〜1.5モル／、最も好ましくは0.1
〜1.0モル／とすればよい。これらを溶解する
緩衝液はいかなる種類のものでも用いることがで
きる。そのPHとしては４〜12、好ましくは６〜
11、最も好ましくは7.0〜9.5であればよく、その
濃度としては、0.01〜２モル／、好ましくは
0.1／1.0モル／、最も好ましくは0.2〜0.8モ
ル／とすればよい。このような緩衝液として
は、例えば、トリス−塩酸緩衝液があげられる。
検出しようとするアルコール濃度が１モル／よ
り低い時には、その低い割合に応じて、各成分を
減少させればよいが、実際には酵素反応に要する
時間が長くなるので、色素のみを減少させること
が普通である。また、用いる酵素の性質によつ
て、NADのみ、NADPのみ、あるいは両者を一
緒に加えてもよい。添加する酵素の単位ユニツト
とは、国際単位であり、１分間に基質１マイクロ
モルを25〜30℃の反応条件で変化させる活性をい
う。 本発明の試験片を作るには、例えば、水不溶性
あるいは難溶性の担体の１部あるいは全部を上記
の各試薬の溶解液に含浸せしめればよく、引き上
げた後、そのまま使つたり、あるいは乾燥後、使
用に供すればよい。また、一層ずつ積層するよう
な方法で作成してもよい。大きな担体を用いた場
合は、各試薬の溶解液にひたしたのち、適当な大
きさ、例えば幅５mm、長さ40mmくらいに細断すれ
ばよい。乾燥を行う際には、酵素が元来熱に対し
て不安定であるので、低温乾燥や凍結乾燥などを
行う方がよい。乾燥したものは、室温保存１カ月
後にも十分使用に供することができる。 本発明の試験片で実際に溶液中のアルコール濃
度を測定するには、例えば測定に適した濃度の試
験片を測定する溶液にひたし、引き上げて室温に
てその色素の退色もしくは発色に要する時間を測
定することで行うことができる。また色調変化に
よつてもアルコール濃度を測定することができ
る。唾液中のアルコール濃度を測定する場合も、
唾液にアルコール検出用試験片をひたし、退色に
要する時間を測定したり、あるいは色調変化を視
認することで唾液中のアルコール濃度の測定がで
きる。 本発明のアルコール検出用試験片は、持ち運び
が非常に容易であることはもちろん、ジアホラー
ゼと色素とが加わつているために、酵素反応の結
果を視認で判断できるため、分光光度計や電気化
学的な特殊な装置を全く必要とせず、任意の場所
で簡便に、微量のサンプルで短時間のうちにアル
コール濃度を検出することができる。特に乾燥し
た試験片は１カ月以上の長期保存性に優れてお
り、さらに、好熱性細菌由来の酵素を用いた場合
には、一層保存性が優れた試験片が得られること
から、急性アルコール中毒の診断のように急を要
する場合や、交通法規上の使用に非常に有益であ
り、社会生活上、公衆が得る利益ははかり知れな
いものがある。 次に本発明を実施例及び比較例により具体的に
説明する。この実施例及び比較例で下記の試薬を
用いた。 １ NAD又はNADP；オリエンタル酵母社製。 ２ アルコールデヒドロゲナーゼ；オリエンタル
酵母社製カタログNo.ADH−01又はバチルス
ステアロサーモフイラス由来。 ３ ジアホラーゼ；ベーリンガー マンハイム山
之内社製カタログNo.411558又はバチルス ステ
アロサーモフイラス由来。 なお、アルコールデヒドロゲナーゼの１ユニツ
トは、25℃で１分間に１マイクロモルのアタノー
ルを消費する酵素量であり、ジアホラーゼの１ユ
ニツトは25℃でヨードニトロテトラゾリウムバイ
オレツト存在下、１分間に１マイクロモルの
NADHを消費する酵素量である。 対照例 １ メチレンブル−４ミリモル／（以後mMと略
す）、アルコールデヒドロゲナーゼ340ユニツト／
ml、ジアホラーゼ100ユニツト／ml、トリトンＸ
−100 ６ml／、トリス塩酸緩衝液（PH9.0）
200mM、NAD10mMの濃度となるよう調整した
溶液を、濾紙（東洋科学製定性濾紙No.２、直径９
cm円型、厚さ0.26mm）に含浸させ、凍結乾燥後、
幅５mm、長さ40mmの短冊状に細断して青色の試験
片を得た。 この試験片を0.5g／のエタノール溶液に浸
漬し、取り出した後、室温に報知し、肉眼で観察
したところ、浸漬部分の青色が退色しはじめ、１
分で無色になつた。浸漬するエタノール溶液のエ
タノール濃度を変化させ、退色に要する時間を測
定した所、エタノール濃度が高くなるにつれて退
色に要する時間が短くなり、エタノール濃度が非
常にうすくなると退色が完全に行われず、色調が
うすくなるにとどまつた。 その結果を第１表に示した。

【表】 第１表に示したように、退色に要する時間、そ
の色調変化を視認することで、溶液中のエタノー
ル濃度を測定することができた。 上記組成よりなる試験片は、簡便なエタノー
ル検出用試験片として使用可能であり、室温にて
１カ月以上保存してもその性能は保たれていた。
また試験片はエタノールに対して反応したが、
メタノールには反応せず、特異性が高いことが確
認された。 対照例 ２ 対照例１で示した組成のうち、メチレンブルー
をヨードニトロテトラゾリウムバイオレツト
4mMに代えて用いた以外は実施例１と同様にし
て試験片を作製した。試験片の作製はすべて
暗所で行つた。 得られた試験片は白色であり、0.5g／のエ
タノール溶液に浸漬し、取り出した後、室温に放
置し、肉眼で観察した所、浸漬部分が徐々に赤変
しはじめ、完全に赤変し、赤紫色になるのに50秒
を要した。 また、浸漬するエタノール溶液のエタノール濃
度を変化させた所、第２表に示すごとく、相関が
見られた。

【表】 第２表に示したように、ヨードニトロテトラゾ
リウムバイオレツトを使用しても、その発色に要
する時間や色調変化から、溶液中のエタノール濃
度を測定することができた。 上記組成よりなる試験片は、簡便なエタノー
ル検出用試験片として使用可能であり、冷暗所保
存で１カ月以上その性能が保たれていた。また試
験片はエタノールに対して反応したが、メタノ
ールには反応せず、特異性が高いことが確認され
る。 実施例 １ 対照例１に示した組成のうち、アルコールデヒ
ドロゲナーゼとジアホラーゼを、バチルス ステ
アロサーモフイラス（Bacillus
stearothermophilus）由来のものに代えて用いた
以外は対照例１と同様にして試験片を得た。 試験片を対照例１と同様にして各濃度のエタ
ノール溶液に浸漬し、その変化を追跡した所、実
施例１と全く同等の結果が得られ、好熱性細菌由
来の酵素を用いてもアルコール検出用試験片とし
て使用可能であつた。 なお、この試験片は試験片よりも保存安定
性に優れ、室温保存で３カ月以上その性能を有し
ていた。 実施例 ２ 実施例１で得られた試験片を用いて、唾液中
のアルコール濃度の測定を実施した。 すなわち、体重65Kgの成人男子に、日本酒360
mlを飲酒させ、飲酒１時間後の唾液を採取した。
その唾液中のエタノール濃度をガスクロマトグラ
フイー（島津製作所 GC−3BT）で測定したと
ころ、0.52g／のエタノールが含まれていた。 次に、試験片にこの唾液をしました所、55秒
で濃青色が白色に退色し、対照例１の結果から、
唾液中に、約0.5g／のエタノールが含まれてい
ると認められた。この結果はガスクロマトグラフ
イーで得られた結果とよく一致した。すなわち試
験片を用いることによつて、唾液中のエタノー
ル濃度を簡便に、測定しうることが確認された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ (a)ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチ
   ド又はニコチンアミド アデニン ジヌクレオチ
   ドフオスフエイトと、(b)好熱性細菌由来のアルコ
   ールデヒドロゲナーゼと、(c)好熱性細菌由来のジ
   アホラーゼと、(d)色素と、(e)担体とからなるアル
   コール検出用試験片。