JPH07102156B2 - 脱水素酵素または基質の測定法 - Google Patents
脱水素酵素または基質の測定法Info
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- JPH07102156B2 JPH07102156B2 JP62082277A JP8227787A JPH07102156B2 JP H07102156 B2 JPH07102156 B2 JP H07102156B2 JP 62082277 A JP62082277 A JP 62082277A JP 8227787 A JP8227787 A JP 8227787A JP H07102156 B2 JPH07102156 B2 JP H07102156B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は脱水素酵素反応において，該脱水素酵素反応を
触媒する脱水素酵素，または基質をその濃度に関係なく
正確かつ迅速に，しかも測定機器を色素などで汚染する
ことなく測定する方法に関する。
触媒する脱水素酵素，または基質をその濃度に関係なく
正確かつ迅速に，しかも測定機器を色素などで汚染する
ことなく測定する方法に関する。
（従来の技術） 脱水素酵素が関与する脱水素反応としては各種の反応が
知られている。例えばグルコース−６−リン酸脱水素酵
素によりグリコース−６−リン酸→グリコノ−δ−ラク
トン−６−リン酸の反応が，乳酸脱水素酵素により乳酸
→ピルビン酸の反応が触媒される。これらの反応におい
て酵素または基質の定量は，例えばこれらの反応に関与
する補酵素（NAD+,NADP+など）が還元されて生じる還元
型酵素（NADH,NADPHなど）を測定することによって行わ
れる。例えばNADHの吸光度を測定することにより酵素ま
たは基質の定量がなされる。しかし，このような方法は
感度が充分ではないため,NADHをさらに他の化合物に変
換して測定する方法が採用されている。例えば，次に示
すようなホルマザン発色を利用する方法がある： 〔ここで,1−mPMSは１−メトキシ−５−メチルフェナジ
ニウムメチルサルフェート,1−mPMSH2はその還元型,MTT
は３−（4,5−ジメチルチアゾイル−２）−2,5−ジフェ
ニルテトラゾリウムブロミド,MTTH2はその還元型（ホル
マザン色素）を示す。〕 この反応例においては,D−グルコース−６−リン酸→Ｄ
−グルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸の脱水素酵素反
応により生じるNADH（NADPHも同様の反応様式を示す）
は,1−mPMSなどの電子伝達体に電子を供与することによ
りNAD+に変化する。１−mPMSは還元されて１−mPMSH2と
なる。さらに，系内に存在するMTTがこの１−mPMSH2に
より還元されてMTTH2となる。このMTTH2はホルマザン色
素であり，この色素の紫色の発色の吸光度計で測定する
ことにより，上記NADH,つまり酵素や基質が間接的に測
定される。電子伝達体としては,1−mPMSのほかフェナジ
ンメトサルフェート（PMS）,9−ジメチルアミノベンゾ
−α−フェナゾキソニウム（メルドラーブルー）なども
利用される。ホルマザン色素の測定は，上記NADHの測定
よりも高感度である。しかし，この色素が測定機器のチ
ューブやセルに沈着する傾向が強いため自動分析器によ
る測定が困難であるという欠点がある。
知られている。例えばグルコース−６−リン酸脱水素酵
素によりグリコース−６−リン酸→グリコノ−δ−ラク
トン−６−リン酸の反応が，乳酸脱水素酵素により乳酸
→ピルビン酸の反応が触媒される。これらの反応におい
て酵素または基質の定量は，例えばこれらの反応に関与
する補酵素（NAD+,NADP+など）が還元されて生じる還元
型酵素（NADH,NADPHなど）を測定することによって行わ
れる。例えばNADHの吸光度を測定することにより酵素ま
たは基質の定量がなされる。しかし，このような方法は
感度が充分ではないため,NADHをさらに他の化合物に変
換して測定する方法が採用されている。例えば，次に示
すようなホルマザン発色を利用する方法がある： 〔ここで,1−mPMSは１−メトキシ−５−メチルフェナジ
ニウムメチルサルフェート,1−mPMSH2はその還元型,MTT
は３−（4,5−ジメチルチアゾイル−２）−2,5−ジフェ
ニルテトラゾリウムブロミド,MTTH2はその還元型（ホル
マザン色素）を示す。〕 この反応例においては,D−グルコース−６−リン酸→Ｄ
−グルコノ−δ−ラクトン−６−リン酸の脱水素酵素反
応により生じるNADH（NADPHも同様の反応様式を示す）
は,1−mPMSなどの電子伝達体に電子を供与することによ
りNAD+に変化する。１−mPMSは還元されて１−mPMSH2と
なる。さらに，系内に存在するMTTがこの１−mPMSH2に
より還元されてMTTH2となる。このMTTH2はホルマザン色
素であり，この色素の紫色の発色の吸光度計で測定する
ことにより，上記NADH,つまり酵素や基質が間接的に測
定される。電子伝達体としては,1−mPMSのほかフェナジ
ンメトサルフェート（PMS）,9−ジメチルアミノベンゾ
−α−フェナゾキソニウム（メルドラーブルー）なども
利用される。ホルマザン色素の測定は，上記NADHの測定
よりも高感度である。しかし，この色素が測定機器のチ
ューブやセルに沈着する傾向が強いため自動分析器によ
る測定が困難であるという欠点がある。
このような色素による汚染を回避する方法が特開昭60−
83598号公報に開示されている。この方法においては，
上記ホルマザン発色法のMTTの代わりに酸素，ペルオキ
シダーゼ（POD），色原体（例えばＮ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン;TOOSおよび４−アミノアンチピリン（４−AA））
を反応系に共存させる。この反応の前半は上記ホルマザ
ン発色法と同様であり,NADHの生成以降の反応（電子伝
達体として１−mPMS,そして色原体としてTOOSと４−AA
を用いた反応例）を次に示す。
83598号公報に開示されている。この方法においては，
上記ホルマザン発色法のMTTの代わりに酸素，ペルオキ
シダーゼ（POD），色原体（例えばＮ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン;TOOSおよび４−アミノアンチピリン（４−AA））
を反応系に共存させる。この反応の前半は上記ホルマザ
ン発色法と同様であり,NADHの生成以降の反応（電子伝
達体として１−mPMS,そして色原体としてTOOSと４−AA
を用いた反応例）を次に示す。
上記系においてもNADHから電子が１−mPMSに供与され,1
−mPMSH2が生成する。次にこの１−mPMSH2は系内に存在
するO2に電子を供与するため,O2はO2 -を経てH2O2とな
る。H2O2はペルオキシダーゼの存在下でTOOSおよび４−
AAに作用し，色原体が酸化縮合されて色素が生成する。
この色素は前記ホルマザン色素と異なり測定機器が汚染
することなく測定され得る。
−mPMSH2が生成する。次にこの１−mPMSH2は系内に存在
するO2に電子を供与するため,O2はO2 -を経てH2O2とな
る。H2O2はペルオキシダーゼの存在下でTOOSおよび４−
AAに作用し，色原体が酸化縮合されて色素が生成する。
この色素は前記ホルマザン色素と異なり測定機器が汚染
することなく測定され得る。
しかし，発明者らが上記方法を実施したところ，特に基
質が高濃度の場合は，発色後急激な退色が起こるため正
確な測定が困難であった。
質が高濃度の場合は，発色後急激な退色が起こるため正
確な測定が困難であった。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものでありその目的
とするところは，脱水素酵素反応における酵素や基質を
正確にかつ簡単な方法で容易に，しかも測定機器の色素
などで汚染することなく測定しうる方法を提供すること
にある。
とするところは，脱水素酵素反応における酵素や基質を
正確にかつ簡単な方法で容易に，しかも測定機器の色素
などで汚染することなく測定しうる方法を提供すること
にある。
（問題点を解決するための手段および作用） 発明者らはまず次の方法で上記特開昭60−83598号公報
に記載の方法についての検討を行った。
に記載の方法についての検討を行った。
実験例 〔グルコース−６−リン酸の定量〕 反応組成１ トリス−塩酸緩衝液（pH8.0） 1.4ml グルコース−６−リン酸溶液（０〜0.01M） 0.1ml グルコース−６−リン酸脱水素酵素溶液（0.5U/ml）0.3
ml NAD+溶液（0.1M） 0.2ml １−mPMS溶液（0.5mg/ml） 0.1ml 反応組成２ ４−アミノアンチピリン溶液（10mg/ml） 0.3ml TOOS溶液（10mg/ml） 0.3ml ペルオキシダーゼ溶液（100U/ml） 0.3ml 上記反応組成１（pH8.0）を37℃にて正確に５分間反応
させ，次いでこの系に反応組成２を加えてさらに４分間
反応させた。この反応系の吸光度を550nmにおいて測定
した。基質（グルコース−６−リン酸）濃度と0D値（ブ
ランクをさし引いた値；ΔOD550として示す）との関係
を第１図に示す。
ml NAD+溶液（0.1M） 0.2ml １−mPMS溶液（0.5mg/ml） 0.1ml 反応組成２ ４−アミノアンチピリン溶液（10mg/ml） 0.3ml TOOS溶液（10mg/ml） 0.3ml ペルオキシダーゼ溶液（100U/ml） 0.3ml 上記反応組成１（pH8.0）を37℃にて正確に５分間反応
させ，次いでこの系に反応組成２を加えてさらに４分間
反応させた。この反応系の吸光度を550nmにおいて測定
した。基質（グルコース−６−リン酸）濃度と0D値（ブ
ランクをさし引いた値；ΔOD550として示す）との関係
を第１図に示す。
第１図から，基質（グリコース−６−リン酸）濃度が比
較的低い0.0003Mまでは基質濃度とOD値とが直線的な関
係を示すが,0.005Mおよび0.010Mにおいては発色後速や
かに退色が起こるため,4分後には基質濃度が0Mの場合と
同様に吸光度の上昇が認められなかった。
較的低い0.0003Mまでは基質濃度とOD値とが直線的な関
係を示すが,0.005Mおよび0.010Mにおいては発色後速や
かに退色が起こるため,4分後には基質濃度が0Mの場合と
同様に吸光度の上昇が認められなかった。
発明者らは上記理由を検討した結果，基質が高濃度の場
合に発色した色素の急激な退色が起こるのは次の模式図
１に示すような反応が進行するためと考えた。上記グル
コース−６−リン酸の脱水素酵素反応のタイプの他，サ
ルコシン脱水素酵素の反応のような補酵素が関与しない
タイプの反応も同様に，模式図２に示すような反応が進
行するため退色が起こると考えられる。
合に発色した色素の急激な退色が起こるのは次の模式図
１に示すような反応が進行するためと考えた。上記グル
コース−６−リン酸の脱水素酵素反応のタイプの他，サ
ルコシン脱水素酵素の反応のような補酵素が関与しない
タイプの反応も同様に，模式図２に示すような反応が進
行するため退色が起こると考えられる。
例えば模式図１においては，脱水素酵素反応により生じ
る電子が補酵素および電子伝達系に伝達され，電子伝達
体から電子がO2に供与される。このとき基質濃度が高く
酵素反応が終了していないと上記電子がO2を電子受容
体とせずに還元型電子伝達体から色素（ペルオキシダー
ゼ反応により生成する）に作用し，その結果，急激な退
色が起こる。さらに，還元型電子伝達体からの電子が
O2を電子受容体とせずTOOSに作用してこれを還元し，発
色できないような状態にするため発色不良となる。これ
がこの反応系における発色不良および急激な退色の原因
となる。模式図２の場合も同様の原理であると考えられ
る。従って発明者らは，電子伝達系からの電子を完全に
O2に伝達するためには（ａ）ペルオキシダーゼ反応が開
始される以前に脱水素酵素反応が完了しH2O2の生成が完
了していること；および（ｂ）色原体は脱水素酵素反応
が終了もしくは停止後に添加されることが必要であると
考えた。
る電子が補酵素および電子伝達系に伝達され，電子伝達
体から電子がO2に供与される。このとき基質濃度が高く
酵素反応が終了していないと上記電子がO2を電子受容
体とせずに還元型電子伝達体から色素（ペルオキシダー
ゼ反応により生成する）に作用し，その結果，急激な退
色が起こる。さらに，還元型電子伝達体からの電子が
O2を電子受容体とせずTOOSに作用してこれを還元し，発
色できないような状態にするため発色不良となる。これ
がこの反応系における発色不良および急激な退色の原因
となる。模式図２の場合も同様の原理であると考えられ
る。従って発明者らは，電子伝達系からの電子を完全に
O2に伝達するためには（ａ）ペルオキシダーゼ反応が開
始される以前に脱水素酵素反応が完了しH2O2の生成が完
了していること；および（ｂ）色原体は脱水素酵素反応
が終了もしくは停止後に添加されることが必要であると
考えた。
それゆえ，本発明の脱水素酵素または基質の測定法は，
脱水素酵素反応により基質から生じる電子を電子伝達
体，または補酵素および電子伝達体を経由して酸素に受
容させることにより過酸化水素を生成させ，該脱水素酵
素反応が終了または停止後に該過酸化水素をペルオキシ
ダーゼおよび色原体と反応させ生成する色素を測定する
ことを特徴とし，そのことにより上記目的が達成され
る。
脱水素酵素反応により基質から生じる電子を電子伝達
体，または補酵素および電子伝達体を経由して酸素に受
容させることにより過酸化水素を生成させ，該脱水素酵
素反応が終了または停止後に該過酸化水素をペルオキシ
ダーゼおよび色原体と反応させ生成する色素を測定する
ことを特徴とし，そのことにより上記目的が達成され
る。
本発明でいう脱水素酵素および基質は，上記模式図１ま
たは２に示されるタイプの脱水素酵素反応（基質から生
じる電子を補酵素および電子伝達体，または電子伝達体
を介してO2に供与し過酸化水素を生成しうる反応）に関
与する脱水素酵素および基質を指していう。例えば次の
基質と脱水素酵素との組み合わせがある。但し本発明方
法に列挙される基質および脱水素酵素のみを対象とする
場合に限定されない。また基質は下記のように各脱水素
酵素に対応したものに限定されるものではなく，他の基
質であっても特異的に作用する場合もあり得る。
たは２に示されるタイプの脱水素酵素反応（基質から生
じる電子を補酵素および電子伝達体，または電子伝達体
を介してO2に供与し過酸化水素を生成しうる反応）に関
与する脱水素酵素および基質を指していう。例えば次の
基質と脱水素酵素との組み合わせがある。但し本発明方
法に列挙される基質および脱水素酵素のみを対象とする
場合に限定されない。また基質は下記のように各脱水素
酵素に対応したものに限定されるものではなく，他の基
質であっても特異的に作用する場合もあり得る。
本発明方法に用いられる補酵素は,NAD+,NADP+およびフ
ラビン類等がある。フラビン類としてはフラビンアデニ
ンジヌクレオチド（FAD），フラビンモノヌクレオチド
（FMN）などが挙げられる。補酵素が関与する脱水素酵
素反応は，上記のうち，グルコース脱水酵素，グルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素，マレイト脱水素酵素,3α−
ヒドロキシステロイド脱水素酵素，乳酸脱水素酵素,L−
グルタミン酸脱水素酵素およびロイシン脱水素酵素が触
媒する脱水素酵素反応がある。反応時における補酵素の
濃度は特に制限されないが，通常0.001〜2000mMであ
る。
ラビン類等がある。フラビン類としてはフラビンアデニ
ンジヌクレオチド（FAD），フラビンモノヌクレオチド
（FMN）などが挙げられる。補酵素が関与する脱水素酵
素反応は，上記のうち，グルコース脱水酵素，グルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素，マレイト脱水素酵素,3α−
ヒドロキシステロイド脱水素酵素，乳酸脱水素酵素,L−
グルタミン酸脱水素酵素およびロイシン脱水素酵素が触
媒する脱水素酵素反応がある。反応時における補酵素の
濃度は特に制限されないが，通常0.001〜2000mMであ
る。
電子伝達体としては，フェナジンメトサルフェート,1−
メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート
および９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニ
ウムクロライド等を用いることが好ましい。これらの電
子伝達体を使用する場合は,1種または２種以上を混合し
て使用することもできる。電子伝達体を使用する場合の
濃度については何ら限定されるものではないが，反応系
に通常0.001〜1.0mg/mlの割合で含有される。
メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート
および９−ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニ
ウムクロライド等を用いることが好ましい。これらの電
子伝達体を使用する場合は,1種または２種以上を混合し
て使用することもできる。電子伝達体を使用する場合の
濃度については何ら限定されるものではないが，反応系
に通常0.001〜1.0mg/mlの割合で含有される。
色原体としては，ペルオキシダーゼ存在下でH2O2により
酸化発色する化合物が用いられる。このような化合物と
しては次のような組合せがある。
酸化発色する化合物が用いられる。このような化合物と
しては次のような組合せがある。
４−アミノアンチピリン／アニリン誘導体系 ４−アミノアンチピリン／フェノール誘導体系 ベンゾチアゾリノンヒドラゾン誘導体／アニリン誘導体
系 本発明で用いられるアニリン誘導体の具体例としては,N
−メチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−３−メチルアニリ
ン,N−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−メチルアニ
リン,N−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−エチルア
ニリン,N−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−メチル
アニリン,N−メチル−Ｎ−ヒドロキシプロピル−３−メ
チルアニリン,N−エチル−Ｎ−ヒドロキシプロピル−３
−メチルアニリン,N−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−
３−エチルアニリン,N−プロピル−Ｎ−ヒドロキシエチ
ル−３−メチルアニリン,N−メチル−Ｎ−ヒドロキシエ
チル−３−プロピルアニリン,N,N−ビス（β−ヒドロキ
シエチル）−３−メチルアニリン,N,N−ビス（β−ヒド
ロキシプロピル）−３−メチルアニリン,N,N−ジメチル
−３−メチルアニリン,N,N−ジメチル−３−エチルアニ
リン,N,N−ジメチル−３−プロピルアニリン,N,N−ジエ
チル−３−メチルアニリン,N,N−ジエチル−３−エチル
アニリン,N,N−ジプロピル−３−メチルアニリン,N−エ
チル−Ｎ−（β−メタンスルホンアミドエチル）−ｍ−
トルイジン,N−エチル−Ｎ−（β−アセトアミドエチ
ル）−３−メチルアニリン,N,N−ジメチルアニリン,N,N
−ジエチルアニリン,N,N−ジイソプロピルアニリン,N−
メチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリン,N−エチル−Ｎ
−ヒドロキシエチルアニリン,N−エチル−Ｎ−スルホプ
ロピル−ｍ−トルイジン,N−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン,N−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）,m−ア
ニシジン,N−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）アニリン,3,5−ジメトキシ−Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）アニリ
ン,3,5−ジメチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）アニリン,N−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−ｍ−アニシジン,N−エチル−Ｎ−スルホプ
ロピル−3,5−ジメチルアニリン,N−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン等が挙げられ
る。
系 本発明で用いられるアニリン誘導体の具体例としては,N
−メチル−Ｎ−ヒドロキシメチル−３−メチルアニリ
ン,N−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−メチルアニ
リン,N−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−エチルア
ニリン,N−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−メチル
アニリン,N−メチル−Ｎ−ヒドロキシプロピル−３−メ
チルアニリン,N−エチル−Ｎ−ヒドロキシプロピル−３
−メチルアニリン,N−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−
３−エチルアニリン,N−プロピル−Ｎ−ヒドロキシエチ
ル−３−メチルアニリン,N−メチル−Ｎ−ヒドロキシエ
チル−３−プロピルアニリン,N,N−ビス（β−ヒドロキ
シエチル）−３−メチルアニリン,N,N−ビス（β−ヒド
ロキシプロピル）−３−メチルアニリン,N,N−ジメチル
−３−メチルアニリン,N,N−ジメチル−３−エチルアニ
リン,N,N−ジメチル−３−プロピルアニリン,N,N−ジエ
チル−３−メチルアニリン,N,N−ジエチル−３−エチル
アニリン,N,N−ジプロピル−３−メチルアニリン,N−エ
チル−Ｎ−（β−メタンスルホンアミドエチル）−ｍ−
トルイジン,N−エチル−Ｎ−（β−アセトアミドエチ
ル）−３−メチルアニリン,N,N−ジメチルアニリン,N,N
−ジエチルアニリン,N,N−ジイソプロピルアニリン,N−
メチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリン,N−エチル−Ｎ
−ヒドロキシエチルアニリン,N−エチル−Ｎ−スルホプ
ロピル−ｍ−トルイジン,N−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン,N−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）,m−ア
ニシジン,N−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）アニリン,3,5−ジメトキシ−Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）アニリ
ン,3,5−ジメチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）アニリン,N−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−ｍ−アニシジン,N−エチル−Ｎ−スルホプ
ロピル−3,5−ジメチルアニリン,N−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−3,5−ジメトキシアニリン等が挙げられ
る。
またフェノール誘導体の具体例としては,p−クロロフェ
ノール,p−ブロモフェノール,3,5−ジクロロフェノール
スルホン酸,3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香
酸等が挙げられる。
ノール,p−ブロモフェノール,3,5−ジクロロフェノール
スルホン酸,3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香
酸等が挙げられる。
さらにベンゾチアゾリノンヒドラゾン誘導体の具体例と
しては,3−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
が挙げられる。
しては,3−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
が挙げられる。
アニリン誘導体およびフェノール誘導体の使用濃度に関
しては特に制限がないが,0.1〜20mM程度が最適である。
４−アミノアンチピリンの使用濃度は１〜20mM程度が好
ましい。またベンゾチアゾリノンヒドラゾン誘導体の使
用濃度は0.1〜2mM程度が好ましい。
しては特に制限がないが,0.1〜20mM程度が最適である。
４−アミノアンチピリンの使用濃度は１〜20mM程度が好
ましい。またベンゾチアゾリノンヒドラゾン誘導体の使
用濃度は0.1〜2mM程度が好ましい。
本発明方法により脱水素酵素または基質の測定を行うに
は，まず，基質，脱水素酵素,,電子伝達体および必要に
応じて補酵素を反応液中で混合して脱水素酵素反応を行
う。例えば模式図に示すように，基質から生成する電子
は補酵素および電子伝達体（模式図１），または電子伝
達体（模式図２）に伝達され，電子伝達体からO2に電子
が伝達される。O2はO2 -を経てH2O2となる。この反応系
を所定の条件下で保持し，該脱水素酵素反応を終了，も
しくは該反応を停止させる。上記脱水素酵素反応が終了
するのに要する時間は，脱水素酵素反応の種類，反応系
の基質や酵素の濃度，反応温度などにより異なるが，通
常１〜５分である。酸またはアルカリを添加する方法;p
Hの異なる緩衝液などを混合してpHを変化させる方法；
界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム;SDS）など
を添加する方法；酵素の阻害剤を添加する方法により所
望の時間において脱水素酵素を失活させて反応を停止さ
せる。反応が終了もしくは停止後，反応系に色原体およ
びペルオキシダーゼが加えられる。ペルオキシダーゼの
反応により生成する色素は，通常，吸光光度計を用いて
光学的に測定する。
は，まず，基質，脱水素酵素,,電子伝達体および必要に
応じて補酵素を反応液中で混合して脱水素酵素反応を行
う。例えば模式図に示すように，基質から生成する電子
は補酵素および電子伝達体（模式図１），または電子伝
達体（模式図２）に伝達され，電子伝達体からO2に電子
が伝達される。O2はO2 -を経てH2O2となる。この反応系
を所定の条件下で保持し，該脱水素酵素反応を終了，も
しくは該反応を停止させる。上記脱水素酵素反応が終了
するのに要する時間は，脱水素酵素反応の種類，反応系
の基質や酵素の濃度，反応温度などにより異なるが，通
常１〜５分である。酸またはアルカリを添加する方法;p
Hの異なる緩衝液などを混合してpHを変化させる方法；
界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム;SDS）など
を添加する方法；酵素の阻害剤を添加する方法により所
望の時間において脱水素酵素を失活させて反応を停止さ
せる。反応が終了もしくは停止後，反応系に色原体およ
びペルオキシダーゼが加えられる。ペルオキシダーゼの
反応により生成する色素は，通常，吸光光度計を用いて
光学的に測定する。
本発明では脱水素酵素反応が終了もしくは停止している
ため基質濃度にかかわらず反応系には還元型の電子伝達
体（例えば１−mPMSH2）が残留していない。そのため還
元型伝達体からの電子が色原体に作用して色原体を還元
して発色できない状態としたり，色原体から生成した色
素に作用して生成した色素を脱色させることがない。こ
のように，基質がいなかる濃度の場合も退色が起こるこ
となく正確な測定がされ得る。本発明方法により生成す
る色素はホルマザン色素のように測定機器のチューブや
セルに沈着することがないため自動分析機を用いて短時
間のうちに大量処理を行うことが可能となる。
ため基質濃度にかかわらず反応系には還元型の電子伝達
体（例えば１−mPMSH2）が残留していない。そのため還
元型伝達体からの電子が色原体に作用して色原体を還元
して発色できない状態としたり，色原体から生成した色
素に作用して生成した色素を脱色させることがない。こ
のように，基質がいなかる濃度の場合も退色が起こるこ
となく正確な測定がされ得る。本発明方法により生成す
る色素はホルマザン色素のように測定機器のチューブや
セルに沈着することがないため自動分析機を用いて短時
間のうちに大量処理を行うことが可能となる。
（実施例） 以下に本発明を実施例を用いて説明する。
実施例１ 〔グルコース−６−リン酸の定量〕 反応組成１ トリス−塩酸緩衝液（pH8.0） 1.3ml グルコース−６−リン酸脱水素酵素（EC 1.1.1.49）溶
液（0.5U/ml） 0.1ml グルコース−６−リン酸溶液（０〜0.01M） 0.3ml NAD+溶液 0.2ml １−mPMS溶液（0.5mg/ml） 0.1ml 反応組成２ ４−アミノアンチピリン溶液（10mg/ml） 0.3ml TOOS溶液（10mg/ml） 0.3ml ペルオキシダーゼ溶液（100U/ml） 0.3ml 上記反応組成１（pH8.0）を37℃で正確に５分間反応さ
せた。これにSDS水溶液（300mg/ml）0.1mlを添加し，脱
水素酵素反応を停止させた。次に，上記反応組成２を加
えて４分間反応させた後に反応溶液の吸光度を550nmで
測定した。グルコース−６−リン酸（基質）と反応後の
OD値（ブランクを差し引いた値；ΔOD550で示す）との
関係を第２図に示す。
液（0.5U/ml） 0.1ml グルコース−６−リン酸溶液（０〜0.01M） 0.3ml NAD+溶液 0.2ml １−mPMS溶液（0.5mg/ml） 0.1ml 反応組成２ ４−アミノアンチピリン溶液（10mg/ml） 0.3ml TOOS溶液（10mg/ml） 0.3ml ペルオキシダーゼ溶液（100U/ml） 0.3ml 上記反応組成１（pH8.0）を37℃で正確に５分間反応さ
せた。これにSDS水溶液（300mg/ml）0.1mlを添加し，脱
水素酵素反応を停止させた。次に，上記反応組成２を加
えて４分間反応させた後に反応溶液の吸光度を550nmで
測定した。グルコース−６−リン酸（基質）と反応後の
OD値（ブランクを差し引いた値；ΔOD550で示す）との
関係を第２図に示す。
比較例 トリス−塩酸緩衝液の量を1.4mlとしたこと以外は実施
例１の反応組成１と同様の反応系で脱水素酵素反応を行
った。正確に５分間反応させた後，直ちに反応組成２
（実施例１と同様）を加えて４分間反応させた後，反応
溶液の吸光度を550nmで測定した。その結果を第２図に
示す。
例１の反応組成１と同様の反応系で脱水素酵素反応を行
った。正確に５分間反応させた後，直ちに反応組成２
（実施例１と同様）を加えて４分間反応させた後，反応
溶液の吸光度を550nmで測定した。その結果を第２図に
示す。
第２図から，本実施例の方法によれば基質濃度が高い場
合にも正確な基質の測定が可能であることがわかる。こ
れに対して従来の方法では低濃度の場合は基質の測定が
可能であるが，基質が高濃度（約0.005M以上）となると
退色が起こるため，吸光度に関しては基質濃度が0Mの場
合と差が認められず，測定が不可能であることがわか
る。
合にも正確な基質の測定が可能であることがわかる。こ
れに対して従来の方法では低濃度の場合は基質の測定が
可能であるが，基質が高濃度（約0.005M以上）となると
退色が起こるため，吸光度に関しては基質濃度が0Mの場
合と差が認められず，測定が不可能であることがわか
る。
実施例２ 〔サルコシン脱水素酵素の測定〕 反応組成１ トリス−塩酸緩衝液（pH8.0） 1.4ml サルコシン脱水素酵素（EC 1.5.99.1）溶液 0.1ml サルコシン溶液（1M） 0.1ml １−mPMS溶液（0.5mg/ml） 0.1ml 上記反応組成１（pH8.0）を37℃で１分間反応させた。
これにｐ−クロロマ−キュリ−ベンゾエート水溶液（0.
1M）0.1mlを加えて脱水素酵素反応を停止させた。次
に，反応組成２（実施例１と同様）を加えて反応させ,4
分後に反応液の吸光度を550nmにて測定した。同様の方
法で2,3,4,5,6,7分間反応を行った。反応時間とOD値
（ブランクを差し引いた値；ΔOD550で示す）との関係
を第３図に示す。第３図からサルコシン脱水素酵素の酵
素活性を正確に測定していることがわかる。
これにｐ−クロロマ−キュリ−ベンゾエート水溶液（0.
1M）0.1mlを加えて脱水素酵素反応を停止させた。次
に，反応組成２（実施例１と同様）を加えて反応させ,4
分後に反応液の吸光度を550nmにて測定した。同様の方
法で2,3,4,5,6,7分間反応を行った。反応時間とOD値
（ブランクを差し引いた値；ΔOD550で示す）との関係
を第３図に示す。第３図からサルコシン脱水素酵素の酵
素活性を正確に測定していることがわかる。
（発明の効果） 本発明によれば，脱水素酵素反応における脱水素酵素ま
たは基質をペルオキシダーゼによる色原体の酸化発色反
応を利用して正確にかつ容易に測定することができる。
従来，基質が高濃度の場合には測定が困難であるのに対
し，本発明方法を用いると基質濃度にかかわらず正確な
測定値が得られる。本発明の反応により生成する色素は
ホルマザン色素とは異なり測定機器のチューブやセルに
沈着することがないため，自動分析器を用いて連続的に
大量の検体の処理が可能である。
たは基質をペルオキシダーゼによる色原体の酸化発色反
応を利用して正確にかつ容易に測定することができる。
従来，基質が高濃度の場合には測定が困難であるのに対
し，本発明方法を用いると基質濃度にかかわらず正確な
測定値が得られる。本発明の反応により生成する色素は
ホルマザン色素とは異なり測定機器のチューブやセルに
沈着することがないため，自動分析器を用いて連続的に
大量の検体の処理が可能である。
第１図は従来の方法により脱水素酵素反応の基質を測定
したときの該基質濃度と反応液のOD値との関係を示すグ
ラフ；第２図は本発明方法および比較例により脱水素酵
素反応の基質を測定したときの該基質濃度と反応液のOD
値との関係を示すグラフ；そして第３図は本発明の方法
により脱水素酵素反応の酵素活性を測定したときの反応
時間と反応液のOD値との関係を示すグラフである。
したときの該基質濃度と反応液のOD値との関係を示すグ
ラフ；第２図は本発明方法および比較例により脱水素酵
素反応の基質を測定したときの該基質濃度と反応液のOD
値との関係を示すグラフ；そして第３図は本発明の方法
により脱水素酵素反応の酵素活性を測定したときの反応
時間と反応液のOD値との関係を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】脱水素酵素反応における脱水素酵素または
基質の測定法であって、該脱水素酵素反応により基質か
ら生じる電子を電子伝達体、または補酵素および電子伝
達体を経由して酸素に受容させることにより過酸化水素
を生成させ、反応停止剤を加えて、該脱水素酵素反応が
終了または停止後に該過酸化水素をペルオキシダーゼお
よび色原体と反応させ、生成する色素を測定することを
特徴とする脱水素酵素または基質の測定法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62082277A JPH07102156B2 (ja) | 1987-04-02 | 1987-04-02 | 脱水素酵素または基質の測定法 |
| EP19880105172 EP0285998B1 (en) | 1987-04-02 | 1988-03-30 | Method and reagent for determination of dehydrogenase or its substrate |
| DE19883882770 DE3882770T2 (de) | 1987-04-02 | 1988-03-30 | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Dehydrogenase oder ihrem Substrat. |
| US07/746,202 US5250420A (en) | 1987-04-02 | 1991-08-15 | Method and reagent for determination of dehydrogenase or its substrate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62082277A JPH07102156B2 (ja) | 1987-04-02 | 1987-04-02 | 脱水素酵素または基質の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63248399A JPS63248399A (ja) | 1988-10-14 |
| JPH07102156B2 true JPH07102156B2 (ja) | 1995-11-08 |
Family
ID=13770003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62082277A Expired - Lifetime JPH07102156B2 (ja) | 1987-04-02 | 1987-04-02 | 脱水素酵素または基質の測定法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0285998B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07102156B2 (ja) |
| DE (1) | DE3882770T2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5624813A (en) * | 1994-04-21 | 1997-04-29 | Mahant; Vijay K. | NAD(P)+ /NAD(P)H based chemiluminescent diagnostics |
| RU94044169A (ru) | 1994-12-16 | 1996-10-20 | И.А. Кочетов | Многослойный аналитический элемент |
| US5817467A (en) * | 1995-11-16 | 1998-10-06 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for quantitatively determining creatinine kinase and a reagent therefor |
| US20050202447A1 (en) * | 2004-03-11 | 2005-09-15 | Surmodics, Inc. | Array print buffers |
| US8008037B2 (en) | 2008-03-27 | 2011-08-30 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Matrix composition with alkylphenazine quaternary salt and a nitrosoaniline |
| JP6055236B2 (ja) * | 2011-08-17 | 2016-12-27 | 株式会社三和化学研究所 | 測定方法 |
| JP6358942B2 (ja) * | 2014-12-05 | 2018-07-18 | 沢井製薬株式会社 | エンドトキシンの測定用試薬及びエンドトキシンの測定方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1141637A (en) * | 1979-10-10 | 1983-02-22 | Erma C. Cameron | Cofactor indicator compositions |
| US4394444A (en) * | 1982-06-21 | 1983-07-19 | Miles Laboratories, Inc. | Cofactor indicator compositions |
| JPS59205999A (ja) * | 1983-05-10 | 1984-11-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 還元型補酵素の定量方法 |
| JPS59210899A (ja) * | 1983-05-13 | 1984-11-29 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 還元型補酵素の定量法 |
| JPS6131097A (ja) * | 1984-07-23 | 1986-02-13 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規な高感度酵素的測定法 |
| JPS6219100A (ja) * | 1985-07-16 | 1987-01-27 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 胆汁酸の定量法 |
-
1987
- 1987-04-02 JP JP62082277A patent/JPH07102156B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-03-30 EP EP19880105172 patent/EP0285998B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-30 DE DE19883882770 patent/DE3882770T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3882770D1 (de) | 1993-09-09 |
| DE3882770T2 (de) | 1994-03-31 |
| EP0285998A3 (en) | 1990-06-13 |
| EP0285998A2 (en) | 1988-10-12 |
| EP0285998B1 (en) | 1993-08-04 |
| JPS63248399A (ja) | 1988-10-14 |
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