JPS63263097A - Nadh及び/又はnadphの可視部吸光法による定量法 - Google Patents
Nadh及び/又はnadphの可視部吸光法による定量法Info
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- JPS63263097A JPS63263097A JP9818287A JP9818287A JPS63263097A JP S63263097 A JPS63263097 A JP S63263097A JP 9818287 A JP9818287 A JP 9818287A JP 9818287 A JP9818287 A JP 9818287A JP S63263097 A JPS63263097 A JP S63263097A
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野コ
本発明は、NADH及び/又はNADPH(以下両者を
総括して述べるとぎにはNAD (P)Hと記す)を可
視部吸光法によって高感度に測定する方法に関するもの
である。
総括して述べるとぎにはNAD (P)Hと記す)を可
視部吸光法によって高感度に測定する方法に関するもの
である。
[従来の技術]
NADHやNADPHの定量法としては、紫外部吸光性
が最も一般的な方法である。
が最も一般的な方法である。
[発明が解決しようとする問題点コ
しかしながら上述した紫外部吸光性では、濁質の影響を
受けやすいこと、NAD (P)Hの分子吸光係数が小
さい為十分な感度が得られないこと等といった欠点を有
していた。
受けやすいこと、NAD (P)Hの分子吸光係数が小
さい為十分な感度が得られないこと等といった欠点を有
していた。
そこでNAD (P)Hをジアホラーゼやフェナジンメ
トチルサルフェート(PMS)等の触媒によって還元性
発色色素(ホルマザン発色法)に導き、感度を増加させ
たり或は可視部域で測定することを可能とする様な技術
の開発が数多く試みられている。
トチルサルフェート(PMS)等の触媒によって還元性
発色色素(ホルマザン発色法)に導き、感度を増加させ
たり或は可視部域で測定することを可能とする様な技術
の開発が数多く試みられている。
しかしながらこの様なホルマザン発色法においても、生
じた発色物質が分析機器の流路を汚染するという別の問
題があった。またこの方法では還元された色素物質が不
溶化して十分な発色を示さなくなることがある為、反応
液に適当な分散剤を添加しておく必要があり、反応組成
液上も手間においても煩雑な方法である。更にNAD
(P)Hの酸化触媒としてPMSを用いる場合は、PM
Sが易還元性である為反応系中に混在している他の還元
物質もPMSに直接作用して高いバックグラウンド吸収
を示すことが知られている。従って以後の工程でいずれ
の手順を採用するにしても、高感度の定量法を実現する
という所期の目的に鑑みれば、酸化触媒としてPMSを
用いることは好ましいことではない。
じた発色物質が分析機器の流路を汚染するという別の問
題があった。またこの方法では還元された色素物質が不
溶化して十分な発色を示さなくなることがある為、反応
液に適当な分散剤を添加しておく必要があり、反応組成
液上も手間においても煩雑な方法である。更にNAD
(P)Hの酸化触媒としてPMSを用いる場合は、PM
Sが易還元性である為反応系中に混在している他の還元
物質もPMSに直接作用して高いバックグラウンド吸収
を示すことが知られている。従って以後の工程でいずれ
の手順を採用するにしても、高感度の定量法を実現する
という所期の目的に鑑みれば、酸化触媒としてPMSを
用いることは好ましいことではない。
本発明はこうした従来技術のもつ問題点を解決する為に
なされたものであって、その目的とするところは、分析
機器の流路を汚染する様な問題を生じることなく、高感
度にNADH及び/又はNADPHを定量でiる様な方
法を提供することにある。
なされたものであって、その目的とするところは、分析
機器の流路を汚染する様な問題を生じることなく、高感
度にNADH及び/又はNADPHを定量でiる様な方
法を提供することにある。
[問題点を解決する為の手段]
上記目的を達成し得た本発明とは、N A、 D I(
及び/又はNADPHを含む試料に1.フラビン類の存
在下で、NAD (P)H−FMNオキシドレダクター
ゼ、NADH−FMNオキシドLノダクターゼ、NAD
PH−FMNオキシドレダクターゼよりなる群から選ば
れた少なくとも1種の酵素を作用させ、生成する還元型
フラビン類を酸素の存在下で自動酸化させることによっ
て過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素に色原体
及びペルオキシダーゼを作用させて酸化発色させ、その
吸光度を測定することによって試料中のNADH及び/
又はN A D P Hを定量する点に要旨を有するN
ADH及び/又はNADPHの可視部吸光法による定量
法である。
及び/又はNADPHを含む試料に1.フラビン類の存
在下で、NAD (P)H−FMNオキシドレダクター
ゼ、NADH−FMNオキシドLノダクターゼ、NAD
PH−FMNオキシドレダクターゼよりなる群から選ば
れた少なくとも1種の酵素を作用させ、生成する還元型
フラビン類を酸素の存在下で自動酸化させることによっ
て過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素に色原体
及びペルオキシダーゼを作用させて酸化発色させ、その
吸光度を測定することによって試料中のNADH及び/
又はN A D P Hを定量する点に要旨を有するN
ADH及び/又はNADPHの可視部吸光法による定量
法である。
[作用コ
本発明は上述の如く構成されるが、要は分析機器を汚染
するという問題を回避する為に過酸化水素の生成を経て
ペルオキシダーゼによる酸化発色に導く方法を基本的に
採用することとし、更に過酸化水素を生成させる手段と
してPMSの代りに、フラビン類の存在下でNADH−
FMNオキシドレダクターゼ、NADPH−FMNオキ
シドレダクターゼ、NAD (P)H−FMNオキシド
レダクターゼよりなる群から選ばれた少なくとも1種の
酵素を用い、NADHやNADPH等の定量を実現した
ものである。即ちNAD (P)Hを含む測定系にフラ
ビンを存在させた状態で、上記各種のオキシドレダクタ
ーゼを作用させ、生成する還元型フラビンを分子状酸素
によって自動酸化させて過酸化水素を生成せしめ、NA
D (P)Hを全て過酸化水素に転換させるものである
。そしてこの生成した過酸化水素に色原体及びペルオキ
シダーゼを作用させることによって酸化発色を行なわせ
るものであるが、このときの理論回収率も100%であ
ることを見出した。
するという問題を回避する為に過酸化水素の生成を経て
ペルオキシダーゼによる酸化発色に導く方法を基本的に
採用することとし、更に過酸化水素を生成させる手段と
してPMSの代りに、フラビン類の存在下でNADH−
FMNオキシドレダクターゼ、NADPH−FMNオキ
シドレダクターゼ、NAD (P)H−FMNオキシド
レダクターゼよりなる群から選ばれた少なくとも1種の
酵素を用い、NADHやNADPH等の定量を実現した
ものである。即ちNAD (P)Hを含む測定系にフラ
ビンを存在させた状態で、上記各種のオキシドレダクタ
ーゼを作用させ、生成する還元型フラビンを分子状酸素
によって自動酸化させて過酸化水素を生成せしめ、NA
D (P)Hを全て過酸化水素に転換させるものである
。そしてこの生成した過酸化水素に色原体及びペルオキ
シダーゼを作用させることによって酸化発色を行なわせ
るものであるが、このときの理論回収率も100%であ
ることを見出した。
尚NADH−FMNオキシドレダクターゼとはNADH
−FMN系に特異的に作用して酸化還元反応を進行させ
る酵素であり、NADPH−FMNオキシドレダクター
ゼとはNADPH−FMN系に特異的に作用して酸化還
元反応を進行させる酵素の意味である。又NAD (P
)H−・FMNオキシドレダクターゼとはNADH−F
MN系及びNADPH−FMN系の両者に特異的に作用
して酸化還元反応を進行させる酵素の意味である。
−FMN系に特異的に作用して酸化還元反応を進行させ
る酵素であり、NADPH−FMNオキシドレダクター
ゼとはNADPH−FMN系に特異的に作用して酸化還
元反応を進行させる酵素の意味である。又NAD (P
)H−・FMNオキシドレダクターゼとはNADH−F
MN系及びNADPH−FMN系の両者に特異的に作用
して酸化還元反応を進行させる酵素の意味である。
本発明で用いるフラビン類としては、フラビンアデニン
ジヌクレオチド(FAD)、フラビンモノヌクレオチド
(FMN)、 リボフラビン等があるがFMNが最適
である。又本発明で用いる各種オキシドダクターゼは一
般的に発光細菌から分離されるが、特にビブリオ・ハー
ベアイから得られるものが本発明方法に最適である。
ジヌクレオチド(FAD)、フラビンモノヌクレオチド
(FMN)、 リボフラビン等があるがFMNが最適
である。又本発明で用いる各種オキシドダクターゼは一
般的に発光細菌から分離されるが、特にビブリオ・ハー
ベアイから得られるものが本発明方法に最適である。
本発明方法において、フラビン類としてFMNを用い、
NADHを定量する場合の反応系を例示すると下記(1
)〜(3)式の如く表わされる。
NADHを定量する場合の反応系を例示すると下記(1
)〜(3)式の如く表わされる。
FIANH2+o、−−→ JOz + FMN
・・・(2)’POD ・・・(3) 但し、上記(3)式は色原体として4−アミノアンチピ
リン(4−AA)とN−エチル−N−(2−ヒトロキシ
ー3−スルホプロピル)m−トルイジンナトリウム(T
OO5)を用いた場合を示したものであるが、上記(2
)式による過酸化水素(H202)の生成は非酵素的に
極めて早い速度で進行することが分かった。尚生成する
発色物質であるキノンイミンダイは波長555nmにお
いて極大の吸収を有するので、上記波長において吸光度
の測定を行なえば良い。
・・・(2)’POD ・・・(3) 但し、上記(3)式は色原体として4−アミノアンチピ
リン(4−AA)とN−エチル−N−(2−ヒトロキシ
ー3−スルホプロピル)m−トルイジンナトリウム(T
OO5)を用いた場合を示したものであるが、上記(2
)式による過酸化水素(H202)の生成は非酵素的に
極めて早い速度で進行することが分かった。尚生成する
発色物質であるキノンイミンダイは波長555nmにお
いて極大の吸収を有するので、上記波長において吸光度
の測定を行なえば良い。
次に本発明方法において、フラビン類としてFMNを用
い、NADPHを定量する場合の反応系を例示すると下
記(4)〜(6)式の如く表われるが、この反応系はN
ADHの反応系の場合とほぼ同様に理解すれば良い。
い、NADPHを定量する場合の反応系を例示すると下
記(4)〜(6)式の如く表われるが、この反応系はN
ADHの反応系の場合とほぼ同様に理解すれば良い。
・・・(4)
FMN、I+、 +O,−11,O,+FMN
・・・(5)0D 211202 +4−へへ+TOO5−−→ キノン
イミングイ +4LO・・・(6) 上記の趣旨から明らかな様に、NADH−FMNオキシ
ドレダクターゼ又はNADPH−FMNオキシドレダク
ターゼのいずれかを用いることによって、NADHやN
ADPHの夫々を個別的に定量できるが、NAD (P
)H−FMNオキシドレダクターゼを用いた場合はNA
DHとNADPHの混合物を総和として定量することが
できる。
・・・(5)0D 211202 +4−へへ+TOO5−−→ キノン
イミングイ +4LO・・・(6) 上記の趣旨から明らかな様に、NADH−FMNオキシ
ドレダクターゼ又はNADPH−FMNオキシドレダク
ターゼのいずれかを用いることによって、NADHやN
ADPHの夫々を個別的に定量できるが、NAD (P
)H−FMNオキシドレダクターゼを用いた場合はNA
DHとNADPHの混合物を総和として定量することが
できる。
本発明方法を実施するに当たっては、使用される酵素及
び基質並びに試薬等の濃度範囲は場合に応じて設定すれ
ばよく、何ら限定するものではないが、好ましい範囲を
例示すると下記の如くである。
び基質並びに試薬等の濃度範囲は場合に応じて設定すれ
ばよく、何ら限定するものではないが、好ましい範囲を
例示すると下記の如くである。
各種オキシドレダクターゼ ・・・5〜10100O/
mIlペルオキシダーゼ ・・・0.5〜LQ
IJ/ mjLFMN ・・・
1〜10μM4−AA
・・・0.01〜0.1 %T OOS
−0,02〜0.2 %
尚使用する緩衝液についても何ら限定するものではなく
、測定する対象や測定系に応じて従来使用されているも
のを選択すればよいが、pHは5〜9の範囲に設定すべ
きである。又上記4−AAやTOO3等は、ペルオキシ
ダーゼ反応における水素供与体としての色原体であり、
設定したpHや選択した緩衝液に応じて他の色原体を用
いることもできる。
mIlペルオキシダーゼ ・・・0.5〜LQ
IJ/ mjLFMN ・・・
1〜10μM4−AA
・・・0.01〜0.1 %T OOS
−0,02〜0.2 %
尚使用する緩衝液についても何ら限定するものではなく
、測定する対象や測定系に応じて従来使用されているも
のを選択すればよいが、pHは5〜9の範囲に設定すべ
きである。又上記4−AAやTOO3等は、ペルオキシ
ダーゼ反応における水素供与体としての色原体であり、
設定したpHや選択した緩衝液に応じて他の色原体を用
いることもできる。
[実施例]
以下本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、下
記実施例は本発明を限定する性質のものではない。
記実施例は本発明を限定する性質のものではない。
実施例1
胆汁酸(コール酸ナトリウム)をNADH−FMNオキ
シドレダクターゼを用いて定量した。
シドレダクターゼを用いて定量した。
即ち下記(7)式によりて生成したNADHを、前記(
1)〜(3)式に従って測定することによって、コール
酸ナトリウムが定量できる。
1)〜(3)式に従って測定することによって、コール
酸ナトリウムが定量できる。
N^DI++3−ケトステロイド
・・・ (7)
このときに使用した試薬は下記の如くである。
試薬1
燐酸!HjH液 (100mM)、pH7,0=−0,
185mf13α−ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ(7511/ in ) −o、1
mxN A D” (301!1M )
・・・0.1mANADH−FMNオキシドレダ
クターゼ(0,60/ mJ2)
−0,1mJ!FMN (1mM )
・”15μm試薬2 ペルオキシダーゼ(901J/ mjl) =0.1
mILT OOS (0,4%) ・=
0.3+nQ4−AA (0,2%) ・
・・0.3mJ1燐酸緩衝液 (pH17400
mM) ・・・1.7mA上記の試薬1に0.1mj
lLのコール酸ナトリウムを加えた後、1分以上経過し
てから試薬2を混合した、そして37℃の温度下で、波
長555nmにおける吸光度を測定した。
185mf13α−ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ(7511/ in ) −o、1
mxN A D” (301!1M )
・・・0.1mANADH−FMNオキシドレダ
クターゼ(0,60/ mJ2)
−0,1mJ!FMN (1mM )
・”15μm試薬2 ペルオキシダーゼ(901J/ mjl) =0.1
mILT OOS (0,4%) ・=
0.3+nQ4−AA (0,2%) ・
・・0.3mJ1燐酸緩衝液 (pH17400
mM) ・・・1.7mA上記の試薬1に0.1mj
lLのコール酸ナトリウムを加えた後、1分以上経過し
てから試薬2を混合した、そして37℃の温度下で、波
長555nmにおける吸光度を測定した。
尚上述の色原体がペルオキシダーゼの作用によって生成
するキノンイミンダイの分子吸光係数は、既存濃度の過
酸化水素及びウリカーゼ(3U/ffIn)並びに尿酸
標準液の添加実験の結果から、14.66mM−’c「
’であることが示された。また測定時のpH7,0は3
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの至適pH
ではないが、酵素量を増やすことによって反応は5分以
内に終結した。
するキノンイミンダイの分子吸光係数は、既存濃度の過
酸化水素及びウリカーゼ(3U/ffIn)並びに尿酸
標準液の添加実験の結果から、14.66mM−’c「
’であることが示された。また測定時のpH7,0は3
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの至適pH
ではないが、酵素量を増やすことによって反応は5分以
内に終結した。
色原体としてのTOO5をフェノール系化合物に替えて
アルカリ条件下で反応を進行させれば、3α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ量を減らすこともできる
。
アルカリ条件下で反応を進行させれば、3α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ量を減らすこともできる
。
実施例1に従って作成された検量線を′s1図に示す。
即ち第1図はコール酸ナトリウム濃度と吸光度(555
rv)との関係を示すグラフである。
rv)との関係を示すグラフである。
第1図に示した検量線によって、コール酸ナトリウムは
最終濃度が0.2〜50μMの範囲で正確に測定できた
。又この結果から、本発明方法は血清中のごく微量のコ
ール酸をも測定で籾る感度を有していることが分かる。
最終濃度が0.2〜50μMの範囲で正確に測定できた
。又この結果から、本発明方法は血清中のごく微量のコ
ール酸をも測定で籾る感度を有していることが分かる。
更にこのときの回収率は、前記分子吸光係数の値から1
00%であることが確認された。
00%であることが確認された。
実施例2
グルコース−6−燐酸(以下G−6−Pと記す)をNA
DPH−FMNオキシドレダクターゼを用いて定量した
。即ち下記(8)式によって生成したNADPHを、前
記(4)〜(6)式に従って測定することによってG−
6−Pが定量できる。
DPH−FMNオキシドレダクターゼを用いて定量した
。即ち下記(8)式によって生成したNADPHを、前
記(4)〜(6)式に従って測定することによってG−
6−Pが定量できる。
このときに使用した試薬は下記の如くである。
試薬1
燐酸緩衝液(100mM)、pH7,0・=O,1,8
5m、1lG−6−Pデヒドロゲナーゼ(30U/ a
nり・・・0.1mu N A D P ” (30mM)
−−・0.1mIlNADPH−FMNオキシドレダク
ターゼ(0,6U/mA ) ・−0,1a+uF
M N (1mM) ・
・・15μl試薬2 ペルオキシダーゼ (90U/In ・0.1mA
T OOS (0,4%) ・・・0.
311A4− A A (0,2%)
・・・0.3mj!燐酸!燐酸液1衝液(ph7 、
loO+aM) ・・・1.7mf上記の試薬1に
0.1mlのG−13−Pを加えた後、1分以上経過し
てから試薬2を混合した。そして波長555nmにおけ
る吸光度を測定した1分子吸光係数14.68mM−’
cm−’から求めた回収率は100%であった。
5m、1lG−6−Pデヒドロゲナーゼ(30U/ a
nり・・・0.1mu N A D P ” (30mM)
−−・0.1mIlNADPH−FMNオキシドレダク
ターゼ(0,6U/mA ) ・−0,1a+uF
M N (1mM) ・
・・15μl試薬2 ペルオキシダーゼ (90U/In ・0.1mA
T OOS (0,4%) ・・・0.
311A4− A A (0,2%)
・・・0.3mj!燐酸!燐酸液1衝液(ph7 、
loO+aM) ・・・1.7mf上記の試薬1に
0.1mlのG−13−Pを加えた後、1分以上経過し
てから試薬2を混合した。そして波長555nmにおけ
る吸光度を測定した1分子吸光係数14.68mM−’
cm−’から求めた回収率は100%であった。
実施例2に従って作成した検量線を第2図に示す。即ち
第2図はG−6−P濃度と吸光度の関係を示すグラフで
ある。第2図の結果からも明らかであるが、G−6−P
濃度が0.5〜40μMの範囲で直線性を示しているの
が分かる。この様にして本発明方法に従ってG−6−P
濃度を高感度に測定することができる。
第2図はG−6−P濃度と吸光度の関係を示すグラフで
ある。第2図の結果からも明らかであるが、G−6−P
濃度が0.5〜40μMの範囲で直線性を示しているの
が分かる。この様にして本発明方法に従ってG−6−P
濃度を高感度に測定することができる。
[発明の効果]
上記の結果からも明らかであるが、NADH及び/又は
NADPHを過不足なく過酸化水素に転換してペルオキ
シダーゼ反応による酸化発色に導くことによって、分析
機器の流路を汚染する様な問題を生じることなく、高感
度にNADH及び/又はNADPHを定量できることに
なった。
NADPHを過不足なく過酸化水素に転換してペルオキ
シダーゼ反応による酸化発色に導くことによって、分析
機器の流路を汚染する様な問題を生じることなく、高感
度にNADH及び/又はNADPHを定量できることに
なった。
第1図及び第2図は実施例1.2の夫々で求められた検
量線を示す。 0テ、−・Ig、’I’″ 4ニ二二9 −7日 寥獣匪 u’) U) 宇七略 の V)
量線を示す。 0テ、−・Ig、’I’″ 4ニ二二9 −7日 寥獣匪 u’) U) 宇七略 の V)
Claims (1)
- NADH及び/又はNADPHを含む試料に、フラビン
類の存在下で、NAD(P)H−FMNオキシドレダク
ターゼ、NADH−FMNオキシドレダクターゼ、NA
DPH−FMNオキシドレダクターゼよりなる群から選
ばれた少なくとも1種の酵素を作用させ、生成する還元
型フラビン類を酸素の存在下で自動酸化させることによ
って過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素に色原
体及びペルオキシダーゼを作用させて酸化発色させ、そ
の吸光度を測定することによって試料中のNADH及び
/又はNADPHを定量することを特徴とするNADH
及び/又はNADPHの可視部吸光法による定量法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9818287A JPH0779714B2 (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | Nadh及び/又はnadphの可視部吸光法による定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9818287A JPH0779714B2 (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | Nadh及び/又はnadphの可視部吸光法による定量法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63263097A true JPS63263097A (ja) | 1988-10-31 |
JPH0779714B2 JPH0779714B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=14212878
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9818287A Expired - Lifetime JPH0779714B2 (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | Nadh及び/又はnadphの可視部吸光法による定量法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0779714B2 (ja) |
-
1987
- 1987-04-20 JP JP9818287A patent/JPH0779714B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0779714B2 (ja) | 1995-08-30 |
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