JPS63263097A - Ｎａｄｈ及び／又はｎａｄｐｈの可視部吸光法による定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨ（以下両者を
総括して述べるとぎにはＮＡＤ　（Ｐ）Ｈと記す）を可
視部吸光法によって高感度に測定する方法に関するもの
である。

［従来の技術］ ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨの定量法としては、紫外部吸光性
が最も一般的な方法である。

［発明が解決しようとする問題点コ しかしながら上述した紫外部吸光性では、濁質の影響を
受けやすいこと、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈの分子吸光係数が小
さい為十分な感度が得られないこと等といった欠点を有
していた。

そこでＮＡＤ　（Ｐ）Ｈをジアホラーゼやフェナジンメ
トチルサルフェート（ＰＭＳ）等の触媒によって還元性
発色色素（ホルマザン発色法）に導き、感度を増加させ
たり或は可視部域で測定することを可能とする様な技術
の開発が数多く試みられている。

しかしながらこの様なホルマザン発色法においても、生
じた発色物質が分析機器の流路を汚染するという別の問
題があった。またこの方法では還元された色素物質が不
溶化して十分な発色を示さなくなることがある為、反応
液に適当な分散剤を添加しておく必要があり、反応組成
液上も手間においても煩雑な方法である。更にＮＡＤ　
（Ｐ）Ｈの酸化触媒としてＰＭＳを用いる場合は、ＰＭ
Ｓが易還元性である為反応系中に混在している他の還元
物質もＰＭＳに直接作用して高いバックグラウンド吸収
を示すことが知られている。従って以後の工程でいずれ
の手順を採用するにしても、高感度の定量法を実現する
という所期の目的に鑑みれば、酸化触媒としてＰＭＳを
用いることは好ましいことではない。

本発明はこうした従来技術のもつ問題点を解決する為に
なされたものであって、その目的とするところは、分析
機器の流路を汚染する様な問題を生じることなく、高感
度にＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを定量でｉる様な方
法を提供することにある。

［問題点を解決する為の手段］ 上記目的を達成し得た本発明とは、Ｎ　Ａ、　Ｄ　Ｉ（
及び／又はＮＡＤＰＨを含む試料に１．フラビン類の存
在下で、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクター
ゼ、ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドＬノダクターゼ、ＮＡＤ
ＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼよりなる群から選ば
れた少なくとも１種の酵素を作用させ、生成する還元型
フラビン類を酸素の存在下で自動酸化させることによっ
て過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素に色原体
及びペルオキシダーゼを作用させて酸化発色させ、その
吸光度を測定することによって試料中のＮＡＤＨ及び／
又はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを定量する点に要旨を有するＮ
ＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨの可視部吸光法による定量
法である。

［作用コ 本発明は上述の如く構成されるが、要は分析機器を汚染
するという問題を回避する為に過酸化水素の生成を経て
ペルオキシダーゼによる酸化発色に導く方法を基本的に
採用することとし、更に過酸化水素を生成させる手段と
してＰＭＳの代りに、フラビン類の存在下でＮＡＤＨ−
ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオキ
シドレダクターゼ、ＮＡＤ　（Ｐ）Ｈ−ＦＭＮオキシド
レダクターゼよりなる群から選ばれた少なくとも１種の
酵素を用い、ＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ等の定量を実現した
ものである。即ちＮＡＤ　（Ｐ）Ｈを含む測定系にフラ
ビンを存在させた状態で、上記各種のオキシドレダクタ
ーゼを作用させ、生成する還元型フラビンを分子状酸素
によって自動酸化させて過酸化水素を生成せしめ、ＮＡ
Ｄ　（Ｐ）Ｈを全て過酸化水素に転換させるものである
。そしてこの生成した過酸化水素に色原体及びペルオキ
シダーゼを作用させることによって酸化発色を行なわせ
るものであるが、このときの理論回収率も１００％であ
ることを見出した。

尚ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼとはＮＡＤＨ
−ＦＭＮ系に特異的に作用して酸化還元反応を進行させ
る酵素であり、ＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクター
ゼとはＮＡＤＰＨ−ＦＭＮ系に特異的に作用して酸化還
元反応を進行させる酵素の意味である。又ＮＡＤ　（Ｐ
）Ｈ−・ＦＭＮオキシドレダクターゼとはＮＡＤＨ−Ｆ
ＭＮ系及びＮＡＤＰＨ−ＦＭＮ系の両者に特異的に作用
して酸化還元反応を進行させる酵素の意味である。

本発明で用いるフラビン類としては、フラビンアデニン
ジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド
（ＦＭＮ）、　　リボフラビン等があるがＦＭＮが最適
である。又本発明で用いる各種オキシドダクターゼは一
般的に発光細菌から分離されるが、特にビブリオ・ハー
ベアイから得られるものが本発明方法に最適である。

本発明方法において、フラビン類としてＦＭＮを用い、
ＮＡＤＨを定量する場合の反応系を例示すると下記（１
）〜（３）式の如く表わされる。

ＦＩＡＮＨ２＋ｏ、−−→　ＪＯｚ　＋　ＦＭＮ　　　
・・・（２）’ＰＯＤ ・・・（３） 但し、上記（３）式は色原体として４−アミノアンチピ
リン（４−ＡＡ）とＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒトロキシ
ー３−スルホプロピル）ｍ−トルイジンナトリウム（Ｔ
ＯＯ５）を用いた場合を示したものであるが、上記（２
）式による過酸化水素（Ｈ２０２）の生成は非酵素的に
極めて早い速度で進行することが分かった。尚生成する
発色物質であるキノンイミンダイは波長５５５ｎｍにお
いて極大の吸収を有するので、上記波長において吸光度
の測定を行なえば良い。

次に本発明方法において、フラビン類としてＦＭＮを用
い、ＮＡＤＰＨを定量する場合の反応系を例示すると下
記（４）〜（６）式の如く表われるが、この反応系はＮ
ＡＤＨの反応系の場合とほぼ同様に理解すれば良い。

・・・（４） ＦＭＮ、Ｉ＋、　　＋Ｏ，−１１，Ｏ，＋ＦＭＮ　　　
・・・（５）０Ｄ ２１１２０２　　＋４−へへ＋ＴＯＯ５−−→　キノン
イミングイ　＋４ＬＯ・・・（６） 上記の趣旨から明らかな様に、ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシ
ドレダクターゼ又はＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダク
ターゼのいずれかを用いることによって、ＮＡＤＨやＮ
ＡＤＰＨの夫々を個別的に定量できるが、ＮＡＤ　（Ｐ
）Ｈ−ＦＭＮオキシドレダクターゼを用いた場合はＮＡ
ＤＨとＮＡＤＰＨの混合物を総和として定量することが
できる。

本発明方法を実施するに当たっては、使用される酵素及
び基質並びに試薬等の濃度範囲は場合に応じて設定すれ
ばよく、何ら限定するものではないが、好ましい範囲を
例示すると下記の如くである。

各種オキシドレダクターゼ　・・・５〜１０１００Ｏ／
ｍＩｌペルオキシダーゼ　　　　　・・・０．５〜ＬＱ
ＩＪ／　ｍｊＬＦＭＮ　　　　　　　　　　　　・・・
１〜１０μＭ４−ＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　
　　・・・０．０１〜０．１　　％Ｔ　ＯＯＳ　　　　
　　　　　　　　　　　　　−０，０２〜０．２　　％
尚使用する緩衝液についても何ら限定するものではなく
、測定する対象や測定系に応じて従来使用されているも
のを選択すればよいが、ｐＨは５〜９の範囲に設定すべ
きである。又上記４−ＡＡやＴＯＯ３等は、ペルオキシ
ダーゼ反応における水素供与体としての色原体であり、
設定したｐＨや選択した緩衝液に応じて他の色原体を用
いることもできる。

［実施例］ 以下本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、下
記実施例は本発明を限定する性質のものではない。

実施例１ 胆汁酸（コール酸ナトリウム）をＮＡＤＨ−ＦＭＮオキ
シドレダクターゼを用いて定量した。

即ち下記（７）式によりて生成したＮＡＤＨを、前記（
１）〜（３）式に従って測定することによって、コール
酸ナトリウムが定量できる。

Ｎ＾ＤＩ＋＋３−ケトステロイド ・・・　　（７） このときに使用した試薬は下記の如くである。

試薬１ 燐酸！ＨｊＨ液　（１００ｍＭ）、ｐＨ７，０＝−０，
１８５ｍｆ１３α−ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ（７５１１／　ｉｎ　）　　−ｏ、１
ｍｘＮ　Ａ　Ｄ”　　　　（３０１！１Ｍ　）　　　　
　　　・・・０．１ｍＡＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダ
クターゼ（０，６０／　ｍＪ２）　　　　　　　　　　
−０，１ｍＪ！ＦＭＮ　　　　　　（１ｍＭ　　）　　
　　　　　　・”１５μｍ試薬２ ペルオキシダーゼ（９０１Ｊ／　ｍｊｌ）　　＝０．１
ｍＩＬＴ　ＯＯＳ　　　　　　（０，４％）　　　・＝
０．３＋ｎＱ４−ＡＡ　　　　　　（０，２％）　　・
・・０．３ｍＪ１燐酸緩衝液　　　　（ｐＨ１７４００
ｍＭ）　　・・・１．７ｍＡ上記の試薬１に０．１ｍｊ
ｌＬのコール酸ナトリウムを加えた後、１分以上経過し
てから試薬２を混合した、そして３７℃の温度下で、波
長５５５ｎｍにおける吸光度を測定した。

尚上述の色原体がペルオキシダーゼの作用によって生成
するキノンイミンダイの分子吸光係数は、既存濃度の過
酸化水素及びウリカーゼ（３Ｕ／ｆｆＩｎ）並びに尿酸
標準液の添加実験の結果から、１４．６６ｍＭ−’ｃ「
’であることが示された。また測定時のｐＨ７，０は３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの至適ｐＨ
ではないが、酵素量を増やすことによって反応は５分以
内に終結した。

色原体としてのＴＯＯ５をフェノール系化合物に替えて
アルカリ条件下で反応を進行させれば、３α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ量を減らすこともできる
。

実施例１に従って作成された検量線を′ｓ１図に示す。

即ち第１図はコール酸ナトリウム濃度と吸光度（５５５
ｒｖ）との関係を示すグラフである。

第１図に示した検量線によって、コール酸ナトリウムは
最終濃度が０．２〜５０μＭの範囲で正確に測定できた
。又この結果から、本発明方法は血清中のごく微量のコ
ール酸をも測定で籾る感度を有していることが分かる。

更にこのときの回収率は、前記分子吸光係数の値から１
００％であることが確認された。

実施例２ グルコース−６−燐酸（以下Ｇ−６−Ｐと記す）をＮＡ
ＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼを用いて定量した
。即ち下記（８）式によって生成したＮＡＤＰＨを、前
記（４）〜（６）式に従って測定することによってＧ−
６−Ｐが定量できる。

このときに使用した試薬は下記の如くである。

試薬１ 燐酸緩衝液（１００ｍＭ）、ｐＨ７，０・＝Ｏ，１，８
５ｍ、１ｌＧ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ（３０Ｕ／　ａ
ｎり・・・０．１ｍｕ Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　”　　　　　　　（３０ｍＭ）　　　
−−・０．１ｍＩｌＮＡＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダク
ターゼ（０，６Ｕ／ｍＡ　）　　　・−０，１ａ＋ｕＦ
　Ｍ　Ｎ　　　　　　　　（１ｍＭ）　　　　　　　・
・・１５μｌ試薬２ ペルオキシダーゼ　（９０Ｕ／Ｉｎ　　　・０．１ｍＡ
Ｔ　ＯＯＳ　　　　　　（０，４％）　　　・・・０．
３１１Ａ４−　Ａ　Ａ　　　　　　（０，２％）　　　
・・・０．３ｍｊ！燐酸！燐酸液１衝液（ｐｈ７　、　
ｌｏＯ＋ａＭ）　　　・・・１．７ｍｆ上記の試薬１に
０．１ｍｌのＧ−１３−Ｐを加えた後、１分以上経過し
てから試薬２を混合した。そして波長５５５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した１分子吸光係数１４．６８ｍＭ−’
ｃｍ−’から求めた回収率は１００％であった。

実施例２に従って作成した検量線を第２図に示す。即ち
第２図はＧ−６−Ｐ濃度と吸光度の関係を示すグラフで
ある。第２図の結果からも明らかであるが、Ｇ−６−Ｐ
濃度が０．５〜４０μＭの範囲で直線性を示しているの
が分かる。この様にして本発明方法に従ってＧ−６−Ｐ
濃度を高感度に測定することができる。

［発明の効果］ 上記の結果からも明らかであるが、ＮＡＤＨ及び／又は
ＮＡＤＰＨを過不足なく過酸化水素に転換してペルオキ
シダーゼ反応による酸化発色に導くことによって、分析
機器の流路を汚染する様な問題を生じることなく、高感
度にＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを定量できることに
なった。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は実施例１．２の夫々で求められた検
量線を示す。 ０テ、−・Ｉｇ、’Ｉ’″ ４ニ二二９ −７日 寥獣匪　　ｕ’） Ｕ） 宇七略　　の Ｖ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨを含む試料に、フラビン
   類の存在下で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ＦＭＮオキシドレダク
   ターゼ、ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ＮＡ
   ＤＰＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼよりなる群から選
   ばれた少なくとも１種の酵素を作用させ、生成する還元
   型フラビン類を酸素の存在下で自動酸化させることによ
   って過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素に色原
   体及びペルオキシダーゼを作用させて酸化発色させ、そ
   の吸光度を測定することによって試料中のＮＡＤＨ及び
   ／又はＮＡＤＰＨを定量することを特徴とするＮＡＤＨ
   及び／又はＮＡＤＰＨの可視部吸光法による定量法。