JPS62138200A - 還元型ピリジンヌクレオチド補酵素の分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、試料中又は特に生体試料中に生成する還元型
ピリジンヌクレオチド補酵素を共役酵素の存在下に溶存
している酸素量の変化としてとらえ、その酸素の変化量
又生成する過酸化水素量を測定することによって試料中
の成分を分析する方法に関するものである。

更に詳しくは還元型ピリジンヌクレオチド補酵素とこれ
を特異的に酸化するピリジン酵素及びこの酵素の基質の
共存下で、酸化型ピリジンヌクレオチド補酵素及び還元
された基質に変化させる。

酸素を電子受容体とする酸化酵素で最終段階の基質を酸
化する。この時の酸素の変化量又は生成する過酸化水素
の量を適切な検出系で測定して還元型ピリジンヌクレオ
チド補酵素を分析する方法に関するものである。

近年、臨床化学分析では特異性の非常に高い酵素を用い
た測定法が開発され、従来まで主流であった化学的測定
法にとって代わり急進の勢いで普及した。現在、酵素的
測定法の多くは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸系と過酸化水素系とに集約される。ここで還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸系の場合
には３４０ｎｍにおける吸光度の増加の測定を介してそ
れぞれの物質を定量することができる。

しかしながらこの還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸の吸収極大は紫外領域にあるため、生体試料
中に含まれる混濁干渉物質、宥色物質の影響を受ける。

そこでこれら共存物質の干渉を避けて可視領域で測定で
きる様に、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸を発色体にかえるテトラゾリウム塩と電子伝達中間
体（フェナジンメトサルフェート又はジアホラーゼ）の
方法が考案された。しかしながらこの方法はフェナジン
メトサルフェートが光による感受性が高く、形成された
ホルマザン色素は不溶性なため使用器具に付着するなど
の難があった。

しかし過酸化水素系では前記の問題点はなく、検出機器
として光電光度計（分光光度計）、蛍光光度計、電極等
を使うことが可能である。特に、電極法は生体試料中の
干渉物質の影響をほとんど受けない。分光光度計の場合
においても可視部領域で測定可能となるため生体試料中
の濁りの影響を受けに＜＜シたり、種々の色原体を選択
することにより、測定波長及び発色感度を変えることが
できる。さらに、この系では、微量物質を高感度でかつ
最適感度にもっていくことが可能となる。

また、これら発色体は水溶性であるため、特に自動分析
に適用できる。

以上のように長波長の測定ができるため濁りの影響を回
避できること、微量物質の定量の際に発色感度を高める
ことが可能なこと、生成した色素が水溶性であることは
分光光度計、自動分析機において特に重要であり、この
点において還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸系よりも過酸化水素系の方がすぐれている。しかし
ながら生体試料中に含まれている酵素量と物質量の定量
において一般に酵素の特異性を利用した酵素分析法が多
く、特に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸の３４０ｎｍの吸収の増減に導く紫外部吸光度分析が
ほとんどを占めている。そこで還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸を種々の干渉物質の影響を受け
にくい過酸化水素に変換できる方法が強く望まれていた
。現在までにこの過酸化水素を発生させる方法としては
次の様なものが知られている。

第一に、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸との反応で、中間体としてスーパーオキサイドができ
るがこの一部を過酸化水素に変える方法である（Ｖ、ポ
ンチ　及び　Ｍ、Ｕ。

ジアンザニ　及び　Ｋ、チーゼマン　及び　Ｔ。

Ｆ、スレイター、Ｃｈｅｍ、−Ｂｉｏｌ。

Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、２３，２８１−２９１　（
１９７８））。

この方法は半定量的であり生体内試料中の共存物質の影
響を受ける。第二に、サリチル酸ヒドロキシラーゼと安
息香酸との系に於いて、化学量論的に過酸化水素を生成
させる方法が知られている（ホワイト、スチーブンス、
Ｒ，Ｈ，及びカミン。

Ｈ８及び　ギブリン、Ｑ、Ｈ，、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２４７．２３７１　（１９７２））、この方
法で発色させる際、ペルオキシダーゼ反応によって生成
した発色化合物は還元剤として作用する還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸の影響を同時に受ける
ために発色しにくくなり発色感度が小さくなる。これを
避けるために還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸による還元作用に対して感受性のないいくつかの
特殊な発色剤が必要となる （Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　　２９１０４）。

今までは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸の過酸化水素への変換方法としては、半定量的である
か又は限定された発色剤が必要などの問題点があった。

本発明者は過酸化水素を比色定量する時に従来の方法の
有する欠点を除いた定量的でかつすべての呈色性試薬を
使用可能になる系を見い出すべく、或いは溶存酸素量の
増減として定量する時には酸素電極により測定するべく
研究の結果、本発明を完成した。即ち、本発明は生体試
料中の成分から生成する還元型ピリジンヌクレオチド捕
酵素を特異的に酸化するピリジン酵素及びその酵素の基
質の共存下で酸化型ピリジンヌクレオチド捕酵素及び還
元された基質に変化させ、しかる後に酸素を電子受容体
として最終段階の基質を酸化する酸化酵素により、溶存
酸素量を変化させる。その結果、変化した溶存酸素量又
は生成した過酸化水素量を適切な検出系で測定すること
を特徴とする方法である。

ここに示した本発明の方法を模式化すると次の様に書け
る。

還元型ピリジンヌクレオチド補酵素十基質（１）ピリジ
ン酵素 酸化型ピリジンヌクレオチド補酵素 ＋　　還元型基質（１） 基質（２） 基質（ｎ−１） 酸素　　＋　　最終段階の基質（ｎ） 検出器：酸素電極　　酸化酵素 検出系 水＋生成物１　　　過酸化水素＋生成物２芭原体　　ペ
ルオキシダーゼ 発色体　　　（カタラーゼ） 以下には、上記方法にて生成した過酸化水素をペルオキ
シダーゼの存在下に、色原体を酸化型の発色体に変化せ
しめ、その光学的濃度を分光光度計にて測定する場合に
ついて、具体的な実施例を述べる０本発明は、これに限
定されず、生成した過酸化水素にアルコール共存下でカ
タラーゼを作用させて生成したアルデヒドを発色系に導
く方法、蛍光光度計又は電極を使用する場合、或いは溶
存酸素量を定量する際には酸素電極を使用する場合にも
適用できる。

用いられるピリジン酵素と酸化酵素との可能性のある組
み合せは具体的な実施例以外にも非常に多く、以下に数
例はどあげる。

（１）　アルコールデヒドロゲナーゼとアルコールオキ
シダーゼ （２）　アラニンデヒドロゲナーゼとＬ−アミノ酸オキ
シダーゼ （３）ガラクトースデヒドロゲナーゼとガラクトースオ
キシダーゼ （４）アシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼとアシルーＣ
ｏＡ−オキシダーゼ （５）７−ジヒドロコレステロールリダクターゼとコレ
ステロールオキシダーゼ （６）グリセロール−３−ホスフェート１−デヒドロゲ
ナーゼとＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ （７）ラクテートデヒドロゲナーゼとラクテートオキシ
ダーゼ ここでは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドの定量、胆汁酸の定量と乳酸脱水素酵素反応を定量す
る場合を挙げて説明するが、生体試料中の他の成分を定
量する場合についても同様にすればよい。またこの方法
は臨床検査だけでなく、食品添加物分析用及び一般分析
用などとしても用いることができるのは勿論である。

実施例１．　　還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤＨ）の定量 発色試薬 グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ５００単位
、ジヒドロキシアセトンリン酸１ｍｍｏｌｅ　　に　０
．１Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）を加えテ１００
ｍ　ｌとし、これを反応液とする。

Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ３０００単
位、ペルオキシダーゼ１０００単位、４−アミノアンチ
ピリン０゜０４ｍｍｏ　ｌ　ｅ、Ｎ−エチル−Ｎ−、（
２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−’ｐルイ
ジンＯ０２ｍｍｏ　ｌ　ｅに０．１Ｍトリス塩酸緩衝掖
液ｐＨ７゜５）を加えてＩＱＯｍｌとし、これを発色液
（１）とする。

Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ３０００単
位、ペルオキシダーゼ１ｏｏｏ単位、３−メチル−２−
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン０．０２ｍｍｏ　ｌ　ｅ
、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）アニリン、０．４ｍｍｏ　ｌ　ｅにＯ，１Ｍ）リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）を加えてｌｏｏｍＩとし、
これを発色液（２）とする。

操作 濃度を変えたＮＡＤＨを含む試料６０ｍ１に反応液を１
．５ｍｌ加え、３７度恒温槽中で２分間反応させた後、
さらに発色試薬（１）又は（２）を１．５ｍｌ加え３分
間加温して発色させる。蒸留水を対照としてそれぞれの
色素の検出波長の吸光度を測定する。検体吸光度から試
薬盲検の吸光度を差し引いた値を測定結果の吸光度とし
、その結果をＮＡＤＨの検量線として図−１にまとめた
。

実施例２．　乳酸脱水素酵素の測定 発色試薬 グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ５００単位
、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ１５００
単位、ペルオキシダーゼ５００単位、ジヒドロキシアセ
トンリン酸１ｍｍｏｌｅ、エチレンジアミンテトラ酢酸
１ｍｍｏｌｅ、乳酸リチウム１０ｍｍｏｌｅ、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド０．２ｍｍｏ　ｌ　ｅ、
４−アミノアンチピリン０．０２Ｉ！ＬｍＯｌ　ｔ９％
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジンＯ，１ｍｍｏ　ｌ　ｅに０．０５
Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）を加えて１００ｍ１
とし、これを発色溶液とする。

測定方法 この発色試薬３ｍｌに乳酸脱水素酵素１０単位／ｍｌを
含む試料を５０ｋｌを加えて混和し、５５５ｎｍの波長
で測定した時の３７度での呈色反応のタイムコースを図
−２に示した。図−２かられかるように本発明の方法に
より、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドに
よる３４０ｎｍで測定される乳酸脱水素酵素反応が可視
部領域の５５５ｎｍでの測定が可能となったことが判る
。

実施例３．　　胆汁酸の測定 発色試薬 ３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ２０単位
、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド０．１ｍｍｏ
ｌｅに０．０５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）を加
えて１００ｍ１とし、これを発色試液（１）とする、３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ２０単位、
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ５００　学
位、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ１５０
０単位、ペルオキシダーゼ５００単位、ジヒドロキシア
セトンリン酸１ｍｍｏｌｅ、エチレンジアミンテトラ酢
酸１ｍｍｏｌｅ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド０，１ｍｍｏｌｅに０．０５Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）を加えて１００ｍ１とし、これを溶解液とす
る。この溶解液で１ｍＭＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン０．２５
ｍＭ４−アミノアンチピリンになる様に色原体を溶かし
、この液を発色試液（２）とする。同様に１ｍＭＮ−ス
ルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、０．２５
ｍＭ４−アミノアンチピリン試液の場合には発色試液（
３）とする。同様に１ｍＭＮ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）　−３，５−ジメトキシアニリン、０
．２５ｍＭ４−アミノアンチピリンの場合には発色試液
（４）とする。同様に２ｍＭＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、０．１ｍＭ
３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンの場合
には発色試液（５）とする。

測定方法 １１０ｍｇ／ｄｌのコール酸ナトリウムを含む試料６０
ＪＬＩに発色試液（上記の方法により調製）３ｍｌを加
え、３７度の恒温槽中で５分間反応させた後、蒸留水を
対照として色素の極大波長の吸光度を測定する。

検体吸光度から試薬盲検の吸光度を差し引いた値を、コ
ール酸ナトリウムの測定結果の吸光度として表−１に示
す。

表−１ 発色試薬　（１）　　　（２）　　　（３）　　　（４
）　　　（５）測定波長　３４０　　５５５　　５８０
　　５８３　　５６０吸光度　　０．１６５　０．７４
８　０．３０５　０．３４８　２．７６０測定波長の栄
位はｎｍである。

次にコール酸ナトリウムの濃度を変え、発色試薬（２）
を用いて同様に測定し、検量線の直線性を調べた。

発明の効果 実施例１のＮＡＤＨ及び実施例３の胆汁酸の検量線の直
線性がよいことから、本発明の方法はランベルト・ベー
ルの法則に従っており、化学量論的な定量性がある。

３４０ｎｍに固有の吸収極大値をもつ還元型ビリ゛ジン
ヌクレオチド補酵素を、短波長から可視部領域の長波長
へもっていくことが可能となり、濁り、有色物質の影響
を避けることが可能となることから本発明は極めて有用
である。

ように本発明の方法により過酸化水素への変換が可能に
なり、発色試薬の色原体の組み合せを選ぶことにより、
高感度測定または検出器の最適感度にもっていく測定が
可能となる。

【図面の簡単な説明】

図−１は実施例１において記載された発色試薬（１）発
色試薬（２）を用いた時の本発明の方法によって作成し
たＮＡＤＨの検量線である。比較のために、ＮＡＤＨだ
けの吸光度を示す検量線を付は加えた。縦軸は発色試薬
（１）の場合には検出波長５５０ｎｍ発色試薬（２）の
場合には検出波長５７０ｎｍにおける吸光度であり、横
軸は、試料中のＮＡＤＨ濃度（ｍ　Ｍ　）である。 図−２は実施例２に記載した発色試薬の呈色反応のタイ
ムコースを示す、縦軸は検出波長５５５ｎｍにおける吸
光度であり、横軸は、時間変化（分）である。 図−３は実施例３において記載された発色試薬（２）を
用いた時の本発明の方法によって作成したコール酸ナト
リウムの検量線である。縦軸は検出波長５５５ｎｍにお
ける吸光度であり、横軸は、試料中のコール酸ナトリウ
ム濃度（ｍｇ／ａｌ）である。 特許出願人　　株式会社　イムノバイオン図面の浄書（
内容に変更なし） 手続補正書（自発） 昭和６１年１２月１６日 昭和６０年特願第２８０４０２号 ２、発明の名称　還元型ピリジンヌクレオチド補酵素の
分析法 ３、補正をする者 の欄と「図面」 ５、補正の内容 （１）　同書第３百第８行の「又」を「又は」と補正す
る。 （２）　同書第６百第２０行の「との反応で」の前に「
はフェナジンメトサルフェート」を挿入する。 （３）　同書第９Ｎ第８行から第２０行までを別紙のと
おり補正する。 （４）　同書第１２Ｗｆｆ４２０行のｒｍｌＪをｒＩＬ
ＩＪと補正する。 （５）　　「図面」は別紙のとおり。図中に記載した図
の番号（図−２２図−３）を図中から外に出した。 電子受容体として最終段階の基質を酸化する酸化酵素に
より、溶存酸素量を変化させる。その結果、変化した溶
存酸素量又は生成した過酸化水素量を適切な検出系で測
定することを特徴とする方法である。 ここに示した本発明の方法を模式化すると次の様に書け
る。 酸化型ピリジンヌクレオチド補酵素 ↓　　　　基質（ｎ−１）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　還元型ピリジンヌクレオチド補酵素とこれを特異的
   に酸化するピリジン酵素及びこの酵素の基質の共存下で
   、酸化型ピリジンヌクレオチド補酵素及び還元された基
   質に変化させる。酸素を電子受容体とする酸化酵素で最
   終段階の基質を酸化する。この時の酸素の変化量又は生
   成する過酸化水素の量を適切な検出系で測定して還元型
   ピリジンヌクレオチド補酵素を分析する方法。 ２　還元型ピリジンヌクレオチド補酵素が還元型ニコチ
   ンアミドアデニンジヌクレオチドである特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 ３　還元型ピリジンヌクレオチド補酵素が還元型ニコチ
   ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 ４　酸化酵素の最終段階の基質が、ピリジン酵素、その
   基質と還元型ピリジンヌクレオチド補酵素の共存下に第
   一段階で生成した還元された基質である特許請求の範囲
   第１項、第２項又は第３項に記載の方法。 ５　ピリジン酵素がグリセロール−３−リン酸デヒドロ
   ゲナーゼで酸化酵素がＬ−α−グリセロホスフェートオ
   キシダーゼである特許請求の範囲第１項又は第４項に記
   載の方法。 ６　ピリジン酵素がアルコールデヒドロゲナーゼで酸化
   酵素がアルコールオキシダーゼである特許請求の範囲第
   １項又は第４項に記載の方法。 ７　変化した酸素量を測定する検出器が酸素電極である
   特許請求の範囲第１項、第５項又は第６項に記載の方法
   。 ８　生成する過酸化水素の量を測定する適切な検出器が
   分光光度計である特許請求の範囲第１項、第５項又は第
   ６項に記載の方法。 ９　生成する過酸化水素をペルオキダーゼ存在下で、１
   種又は２種の色原体を酸化させて発色体とし、その酸化
   呈色を測定する特許請求の範囲第８項に記載の方法。