JPS63116700A - 微量物質の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）　　産業上の利用分野 本発明は、試料、特に血清又は尿中に存在する倣１ｉ物
質な定量的に測定又は分析するための方法である。

更に詳しくは本発明は、酵素の共存下に分析対象物質を
酵素サイクリング反応させ、検出可能な変化量に増大さ
せておいてから測定する方法に関するものである。

ここで用いる用語「分析対象物質」とは、酵素サイクリ
ング反応に関与する酵素の基質となるものであるが、補
酵素を含まないものとする。また明細書の特許請求の範
囲第１項で、補酵素が分析対象物質に含まれないことを
特に強調するために、分析対象物質を「分析′！Ａ象物
質（但し補酵素を除く）」とした。しかし酵素の「基質
」の場合には補酵素を含む。

川’６％　ｒ酸化還元酵素」とは、酸化還元を触媒する
酵素の総称で、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素、酸素
添加酵素及びヒドロペルオキシダーゼ等が含まれる。

用語「最終分析物質」とは、酵素サイクリング反応にお
いて産生され、適当な検出器で分析可能な物質で、例え
ば過酸化水素、酸素又は還元型ピリジンヌクレオチド等
が含まれる。

本発明方法において、分析しようとする試料中の物質、
中間物質、分析対象物質、最終分析物質、酵素、基質等
の酵素サイクリング反応での関りあいについて、２種類
の酵素の場合を例にとり、好ましい形式を図示すると以
下のようになる。

前記の形式は、好適な例として２＃類の異なる酵素によ
る酵素サイクリング反応を示しているが、酵素が３種類
以−４−含んでいてもかまわない。

用語「ピリジンヌクレオチド」とは、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（以後ＮＡＤ、還元型はＮＡＤＨ
）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以
後ＮＡＤＰ、還元型はＮＡＤＰＨ）又はその類似体等の
ピリジン核を含むヌクレオチドを意味する。

用語「ピリジン酵素」とは、ＮＡＤ　（ＮＡＤＰ）依存
性のデヒドロゲナーゼ（ピリジンデヒドロゲナーゼ）を
意味する。

またここで用いる記号はＦＡＴＰＪ　＝アデノシンー５
′　−三リン酸、ｒＡＤＰＪ　＝アデノシンー５′−二
リン酸、ｒＡＭＰＪ　＝アデノシンー５′−−リン酸を
表す。

生体試料中に存在する多数の代謝産物又は酵素は、補酵
素（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ）を必
要とする酵素反応（単一反応又は幾つかの共役反応）に
よって定量的な反応が進行するため、その時の補酵素の
変化量を測定することにより対象物質を定量することが
できる。

本発明の方法は、酵素の基質となる微量の物質だけでな
く前記の補酵素及びこれらを生成する酵素を定量的又は
定性的に測定できるため、ホルモンや生物活性物質等の
微量物質が測定可能になる等非常に適用範囲の広いもの
である。また更に本発明の方法は酵素免疫測定法、化学
・生物発光反応を用いる方法、酵素サイクリング法又は
蛍光法等との組合わせが可能であるため、より−層の超
微量物質の定量が可能となる。

（ロ）従来の技術 一般に蛍光分析法、発光分析法等は比色法に比べＷ！、
昂の物質を高感度で分析できる方法として知られている
が、試薬中の微量に共存する蛍光性物質による妨害や試
料中の共存物質の影響を受けやすく又それらを測定する
機器があまり普及していない等の散点がある。

放射性物質を用いる方法は、放射能汚染の危険性があり
特殊な設備を必要としたり、操作が煩郭になる等望まし
２くない。

現時点では、酵素サイクリング法が」二記の記載方法よ
りも超微量物質を高感度で測定し得る唯一の方法どし、
て知ら才′１ており、光電光度計（分光光度計を含む）
においてもそれらの物質の検出を可能にするもノテある
（Ｏｌｉｖｅｒ　Ｈ，Ｌｏｗｒｙ、Ｊａｎｅｔ　　〜′
。

Ｐａ５ｓｏｎｎｅａｕ、Ｄｅｍｏｙ　　Ｗ、５ｃｈｕｌ
　↑ｚ、　　ａｎｄ　　　Ｍａｒｔ、ｈａ　　　Ｋ。

Ｒｏｃｋ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ１ｎ１ｏＨｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ、２３６しかしなか１
ト彼らのカシｊ畳士、Ｎ八りとＮΔＩ）Ｈ又はＮＡＤＰ
とＮＡＤＰＨとを分別定植゛する場合に試料を弱アルカ
リ性で６０°Ｃ，１０分間加熱するために、操作が檜ネ
１０こなるだけでなく共存するクンバク質の変性な伴２
などの欠点がある。それ故この方法を、広く普及してい
る臨床検査用の自動分析機へ適用することは非常に難し
い。

生体内の多くの物質は、ＮＡＤ　、　ＮＡＤＰ　　又は
ＡＴＰ等の補酵素を基竹にしで酵素反応がおこなわれる
ため、その際に生成する　ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨ又はΔ
ＤＰ等を分別定植できれば、相当数の物質及びそれらを
基質にする酵素等を定量することが可能となる。それ故
、これら補酵素の分別定量が簡単にできる方法の開発が
待ち望まれていたが、現在までのところ知られていない
。

（ハ）　発明が解決しようとする問題点本発明は、基質
となり得る物質、補酵素、酵素等多くの物質の微量分析
に利用でき、反応を１トめすに連続分析可能な酵素サイ
クリング法及び試薬系を開発することを目的とする。具
体的な例として、自動分析機に適用でき下記の点を同時
に満足させる酵素サイクリング法を開発する。

（Ａ）　　微量物質の定量において、短時間内に分光光
度計でも検出可能になるようにすること。

（Ｂ）　　補酵素の定量特に　ＮＡＤとＮＡＤＨ又はＮ
ＡＤＰとＮＡＤＰＨとの分別定量において、１段階又は
２段階の操作で測定できるようにし自動分析機への適用
を可能にすること。

（Ｃ）　　微量物質を定量する際、反応試薬液中におい
て酵素サイクリング反応が進行中に、検出可能な変化が
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの減少量の変化として検出でき
るようにすること。

（Ｄ）　　微量物質を定量する際、反応試薬液中におい
て酵素サイクリング反応が進行中に、検出可能な変化が
過酸化水素の増加紙又は溶存酸素の減少量の変化として
検出できるようにすること。

（Ｅ）　　酵素サイクリング反応が進行中に、溶存酸素
の減少とＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ又はＮＡＤＰＨの減少とが化学
量論的に同時に起こるようにし、それらの変化量を別々
に測定することを可能にすること。

（ニ）　問題点を解決するための手段 本発明は、補酵素を除く分析対象物質と酵素とを酵素サ
イクリング反応に関与させる反応系において、その時に
得られる最終分析物質を酵素サイクリング反応を１ヒめ
ることなく検出可能な変化として、適切な検出系によっ
て測定することができる方法であり、それにより生体試
料中のａＳ物質が分析可能となる方法を提供するもので
ｋ）る。

（ホ）　　作用 本発明方法において、補酵素を除く分析対象物質と酵素
とが酵素サイクリング反応に閏年する場合、酵素サイク
リング反応に必要なその他の基質、酵素の共存下で、必
ず分析対象物質は元の分析対象物質に戻る。この時に酵
素の作用により？ｊＪられる最終分析物質は、酵素サイ
クリング反応を止めることなく適切なる検出系で測定す
ることが可能で直接定年できるものである。本発明にて
、酵素サイクリング反応を止めて＠終分析物質を測れる
ことは、勿論のことである。

本発明方法において、検出可能な最終分析物質は酸素、
過酸化水素、還元型ピリジンヌクレオチド、アンモニア
、α−ケ［・酸、リン酸、ＡＤＰ、シトクロムＣ、オキ
ザロ酢酸又はリンゴ酸等その他多くの物質があるが、後
の物はかなり限定されるので、ここでは主に前の３つの
最終分析物質について説明する。

過酸化水素の生成量、溶存酸素の消費昂又は還元型ピリ
ジンヌクレオチドの減少量の測定は、これらに関して公
知の方法にて行なうことができる。

例えば、溶存酸素の消費品の測定法としては、ガスクロ
マトグラフィ法及び酸素ＴＬ板極法がある。

還元型ピリジンヌクレオチドの）威少酸の測定法とし、
てｔ−ｉ−蛍光光ｙｊ■計法との光光度計法きがあり、
この測定は反応試薬中に還元性物質の共存する場合にお
いて干渉を受けないため好適である。

生成された過酸化水素は満足法、電位差測定法、ボーテ
ログラフィ法、比色測定法及び酵素を用いて蛍光光度計
、分光光度計等で測定する方法により検出される。これ
らの方法の中でカタラーゼ又はペルオキシダーゼを用い
る酵素法は著しく信頼性と傷異性が高い。又過酸化水素
をペルオキシダーゼの存在下に被酸化性呈色試薬と反応
させる場合には、分子吸光係数ど極大吸収波長が異なる
非常に多くの呈色性化合物を選択することができるため
極めて有利である。

しかしながら本発明の方法において、ペルオキシダーゼ
の存在下に過酸化水素と被酸化性呈色試薬とを反応させ
る場合、多くの発色性化合物は還元型ピリジンヌクレオ
チド゛による還元力の影響を受は発色しにくくなる。そ
れ故、この還元力の干渉を受けなくするために、酵素サ
イクリング反応において影響を与えない程度の低濃度の
還元性ピリジンヌクレオチドが還元型ピリジンヌクレオ
チド−再生系から絶えず生成されてくるようにするのが
望すしい。

還元型ピリジンヌクレオチド−再生系に関しては、ピリ
ジンヌクレオチドと還元型の物質及びそれらを基質とす
るピリジン酵素との組合わせであれば何でも良く、例え
ば乳酸とラフチー）・デヒドロゲナーゼ、グリセロール
とグリセロール脱水素酵素、グルタミン酸とグルタミン
酸脱水素酵素、アルコールとアルコール脱水素酵素、グ
リセロール３−リン酸どグリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ等がある。

本発明は生体試料中の殆んどの解糖系の代謝産物（例え
ばグリセロール３−リン酸、ジヒドロキジアセトンリン
醇、グリセルアルデヒド３−リン酸、１．３−ジホスホ
グリセリン酸等）と補酵素（例えばＡＴＰ、ＡＭＰ、Ａ
ＤＰ、ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨ等）及び酵素（例えばリパ
ーゼ、ホスファーターゼ等）の分析ができる非常に有用
な方ある。

本発明方法において、ＮＡＤとＮＡＤＨとの分別定量を
２段階で行なう際の形式の１つを反応連鎖式にて系統的
に書き表わすと次のようになる。

第１段階の反応式 ピリジン酵素 基質１＋ＮＡＤ　　−−−−−−−−−−−＞基質２＋
ＮＡＤＨＡＰＤＨ Ｄ　Ｐ　Ｇ　十Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ−−−−−−−−−−−
＞Ｇ　Ａ　Ｐ　＋　Ｎ　Ａ　ＤＰＩ Ｇ　Ａ　Ｐ　　　　　　−−−−−−−−−−−＞　　
　　　Ｄ　Ａ　Ｐ第１段階の反応では生成されたＮＡＤ
Ｈを前置てジヒドロキシアセトンリン酸として蓄積して
おく。次の第２段階の反応にて酵素サイクリング反応を
行なわせる。

第２段階の反応 ＰＤＨ Ｄ　Ａ　Ｐ　十Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ−−−−−−−−−−−
＞Ｇ　３　Ｐ　＋　Ｎ　Ａ　ＤＰＯ Ｇ　３　Ｆ　＋　　０２　−−−−−−−−−−−＞Ｄ
　Ａ　Ｐ　＋　Ｈ２０ｐ（なお」二式中の記号は次の化
合物と酵素を表わす。

ＤＰＧ　　　　＝１．３−ジホスホグリセリン酸ＧＡＰ
　　　　＝グリセルアルデヒド３−リン酸ＤＡＰ　　　
　＝ジヒドロキシアセトンリン酸Ｇ３Ｐ　　　　＝ｓｎ
−グリセロール３−リン酸ＧＡＰＤＨ＝グリセルアルデ
ヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ ＴＰＩ　　　　＝トリオースリン酸インメラーゼＧＰＤ
Ｈ＝グリセロールー３−リン酸デヒドロゲナーゼ ＧＰＯ＝Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ） 」二式の第２段階の反応においては、ジヒドロキシアセ
トンリン酸はＮＡＤＨの共存下に酵素サイクリング反応
を行なうため、第１段階の反応を阻害しておくことが最
も望ましい。そのためにはグリセルアルデヒド−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ又はトリオースホスフェートイソ
メラーゼの酵素活性なり一トレオースー２．４−シリン
酸又は２−ホスホグリコール酸等で阻害し７ておくとよ
い。

本発明における−１−記の第１段階の反応式をみれば、
グリセルアルデヒド３−リン酸、１．３−ジホスホグリ
セリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ又はトリオースリン酸イソメラーゼ等の分析へも
利用し２うることが理解されるであろう。更に第２段階
の反応式をみれば、グリセロールキナーゼの存在下でＡ
ＴＰ及びグリセロールが分析されることが理解される。

それ故、これらを産生する）・リグリセライド、リパー
セ或いはアデニレートキナーゼ等の分析も可能である。

又本発明ブラ法において、１段階でＮＡＤＨ又はＮ　Ａ
　Ｄ　Ｐ　Ｈを測定する方法を次に示す。それはグリセ
ロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがＮＡＤとＮＡＤ
Ｐ両方を補酵素として利用できるため、ＮＡＤ又はＮＡ
ＤＰだけを補酵素とするグリセルアルデヒド−３−リン
酸デヒドロゲナーゼを前記のＮＡＤＨ測定系測定路に共
存させて、互いに異なる補酵素を利用させればよい。こ
れらのことを反応連鎖式にて、系統的に書き表わすと次
のようになる。

ピリジン酵素 基質１＋ＮＡＤ　　　−−−−−−−−＞基質２＋ＮＡ
ＤＨ（ＮＡＤＰ）　　　Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈ（ＮＡＤＰ
Ｈ）ＤＰＧ＋ＮＡＤＨ−−−−−−−一＞ＧＡＰ＋　　
ＮＡＤ（ＮＡＤＰＨ）　　　Ｔ　Ｐ　Ｉ　　　　　　　
　（ＮＡＤＰ）Ｇ　Ａ　Ｐ　　　　　　　−−−−−−
−−＞　Ｄ　Ａ　ＰＧ、、Ｐ　Ｄ　Ｈ ＤＡＰ＋ＮＡＤＰＨ−−−−−−−−＞　Ｇ３Ｐ＋ＮＡ
ＤＰ（ＮＡＤＨ）　　　　　　　Ｇ　　Ｐ　　Ｏ（ＮＡ
Ｄ）Ｇ　３　Ｐ　＋　　０９−−−−−−−−＞　ＤＡ
Ｐ　＋Ｈ２０２ＡＤＰ、これを産生ずる物質又は酵素の
検出に適用する際に、本発明の好ましい形式を１つの適
切な反応連鎖式で書き表わすと次のごとくなる。

酵素 基質ｌ−１−ＡＴＰ　　　−−−−−＞　　基質２　　
＋　　ＡＤＰＫ ＰＥＰ＋ＡＤＰ　　　−−−−−＞　　ピルビン酸＋Ａ
ＴＰ　Ｄ　Ｈ ピルビン酸＋Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ−−−＞　　　乳酸　＋　
ＮＡＤＯＸ 乳酸　＋　Ｑ２　　−−−−−＞ビルビ゛ン酸十Ｈ２Ｏ
２（なお上式においてＰＥＰ＝ホスホエノールピルビン
酸、ＰＫ＝ピルベートキナーゼ、ＬＤＨ＝ラクテー］・
デヒドロゲナーゼ、ＬＯＸ＝ラクテートオキシダーゼで
ある。） −に記の反応式より本発明の方法は、乳酸、ピルビン酸
及びＡＤＰ等の物質の分析だけでなく、遊離脂肪酸をア
シル−ＣｏＡシンセターゼと反応させた時生成されてく
るＡＭＰの分析にも適用できる。又これらの物質を産生
するＡＴＰアーセ゛、ＮＡＤアーゼ、エノラーセ゛又は
リバーセ゛のような酵素類への分析にも使用できる。

本発明の方法においである特定の物質を７妬をなする際
に、試料中に含まれる内因性のピルビン酸または乳酸の
干渉が大きい場合には、それらを前置てピルビン酸オキ
シダーゼやピルベートデ力ルポキシラーセ等の酵素によ
り消去しておけば良い。

本発明の方法において、Ｗｌ、昂゛物質や酵素及び補酵
素等を定量する場合、前記の方法以外にも酵素サイクリ
ング反応に関与できる酵素の組合わせは、一部を列記す
ると次のようなものがある。

（１）ビリルビン又はビリベルジン等の７縫ビリルビン
オキシダーゼとビリベルジンレダクターゼ。

（２）エタノール、アセトアルデヒド、ピルビン酸又は
ＡＤＰ等の定量 アルコールオキシダーゼとアルコールデヒドロゲナーセ
゛。

（３）Ｌ−アミノ酸又はα−ケト酸の定量Ｌ−アミノ酸
オキシダーゼとアミノ酸デヒドロゲナーゼ。

（４）グリオキシル酸、シュウ酸、グリコール酸、ＮＡ
Ｄ又はＮＡＤＰ等の定量 グリオキシル酸オキシダーゼとラクテートデヒドロゲナ
ーゼ。

（５）グリコールアルデヒド、グリオキシル酸、グリコ
ール酸又はＮＡＤ等の定量 グリコール酸オキシダーゼとグリオキシル酸しダクター
セ゛。

以上のように本発明方法は、酵素サイクリング反応に適
用できる共役酵素の種類が豊富なため、生体試料に含有
する多数の微量物質を測定する」二で非常に有利である
。

本発明で示した具体例において、酵素サイクリング反応
を行なわせる共役酵素は、すべて酸化酵素と脱水素酵素
との２柿類から構成されているが、これらを含む３種類
以上の酵素で酵素サイクリング反応を行なわせてもよく
、例えば、Ｄ−ラクテートデヒドロゲナーゼ、ラクテー
トラセマーゼとラクテートオキシダーゼの組合わせ等が
ある。

又、酸化還元酵素を含まずに酵素サイクリング反応を行
なわせる場合としては、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン
酸カルボキシラーセとホスホエノールピルビン酪カルボ
キシキナーゼの組合わせ等がある。

本発明における酵素サイクリング反応において、用いら
れる酸化酵素は、電子受容体として酸素が最も望ましい
がこれ以外のものでもよい。又同様に、脱水素酵素の電
子供与体としてＮＡＤＨ或いはＮＡＤＰＨが望ましいが
これ以外のものでも差し支えない。

本発明方法において、使用される生体試料としては血液
、取消、尿、唾液又は組織ホモジネート等が適する。

次に実施例にて本発明を説明する。

実施例１゜ ジヒドロキシアセトンリン酸の定量 １．０ｍＭ　　ＮＡＤ、０．２ｍＭ　　ピルビン酸、０
．６ｍＭ４−アミノアンチピリン、５０ｍＭトリス用醇
緩栴液（ｐＨ８，０）の組成の溶液を試薬（１）とする
。

２０ｍＭ　　乳酸、２ｍＭ　Ｎ−ｘチＪＬ／−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
、５０００単位／１　ペルオキシダーゼ、１０００−ｉ
ｌｊ位／ｌ　ラクテ−１・デヒドロゲナーゼ、２０００
０単位／ｌ　　Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダ
ーゼ、１００００単位／１グリセロール−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、５００ｍｇ／ｌ　　牛血清アルブミン
、５０ｍＭトリス塩酸緩劉液（ｐＨ８，０）の組成の溶
液を試薬（２）とする。

測定操作 濃度を変えたジヒドロキシアセトンリン酸を含む試料８
０ｇ１に試薬（１）を１．０ｍｌ加え、３７度の恒温槽
で２分間前置て加温しておいてから、さらに試薬（２）
を１．０ｍｌ加えて反応を開始する。１５分後直ぐに蒸
溜水を対照としてそれぞれの反応液の５５０ｎｍの吸光
度を測定した。

検体の吸光度から試薬盲検の吸光度を差し７引いた値を
測定結果の吸光度どし、その結果をジヒドロキシアセト
ンリン酸の検量線どして第１図に示し７た。

実施例２．　　　ＮＡＤＨの定量 この実施例では実施例１に記載したと同じ基本系を再度
利用した。但し、試薬（１）にさらに０．４ｍＭ　　Ａ
ＴＰ、０．４ｍＭ５−ホスホグリセリン酸、］、、Ｏｍ
Ｍ　　塩化マグネシウム、４０００単位／ｌ　ホスホグ
リセｌ／−トキナーゼ、５０００１位／　ｌ　　グリセ
ルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ゛、５ｏｏｏ
申位／１　　＋・リオースリン酸インメラーゼの組成物
が含すれている試薬溶液を試薬（３）とする。又試薬（
２）にさらに２０ｍＭ　　エチレンジアミン４酢酎が含
まれている試薬溶液を試薬（４）とする。

測定操作 濃度を変えたＮ　Ａ　Ｄ　Ｈを含む試料８０ル１に試薬
（３）を１．Ｏｍｌ加え、３７度の恒温槽で５分間反応
させておいてから、さらに試薬（４）を１．０ｍｌ加え
て反応を１０分間行なった。以後の測定操作は実施例１
ど同様である。

Ｎ　Ａ　Ｄ　ＩＩの濃１ｒｋ：と吸光度変化２・の直線
関係を第２図に示した。

実施例３゜ １世附紋の気で早− この実施例では実ｊ（！ｉ例２に記載１．たど同！：゛
、基本系を１ｑ庶利ｍ　１．、た。（ｊｌ、　ｌ、、試
料中の■噌１耐を測る場合には、試薬（３）にさｒ〜・
に３００中位、／′１３α−ヒドロギうメステロイドデ
Ｆ′ドロゲナーゼを添加した試■；溶液を用いた。ζｉ
ｔｌ以外の試薬及び測定操作は１′施例２と全く同じ２
である。

本発明Ｊｊ法によ−）て感度が増強されたことを例証す
るか、″パ）に２一つの従来法と比較検詞し、てみた。

従来法（１）の試薬組成は０．１Ｍ）リス塩酸＆’５Ｉ
＋ｉ９ｍ　（ｐ■Ｉｓ、ｏ）、３．ＯｍＭ　　ピルビン
酸、１゜ＯｍＭ　　ＮＡＤ、０．１％エマルゲ７８１０
．２０００単位／ｌ　ジアホラーゼ、０．１ｍＭヨード
ニドロチ）・ラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）３００単
位／１　３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ
を含む。従来法（２）の試薬組成は５０ｍＭ　　ｔ・リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、３、ＯｍＭ　　ピルビン
酸、１．ＯｍＭ　　ＮＡＤ、０．１％エマルゲン８１０
、　３００単位／１３α−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼ、１ｍＭ　　ジヒドロキシアセトンリン酸、
２０００単位／ｌ　グリセロール−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、４０００単位／Ｉ　　Ｌ−α−グリセロホス
フェートオキシダーゼ、５０００単位／ｌペルオキシダ
ーゼ、１ｍＭＮ−ｘチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−１−ルイジン、０．３ｍＭ４−
アミノアンチピリンを含む。

試料としては０．１ｍＭコール酸の標準液と２種類の大
血清を用いた。

測定操作 本発明方法での各々の試料を測定する操作手順は実施例
２と同様である。従来法（１）、（２）での操作手順に
おいては、各々の試料８０μｍにそれぞれの反応溶液を
２，０ｍｌ添加することによって反応を開始し、１０分
間後に測定した。従末法（１）の場合の測定波長は５０
０ｎｍで、従来法（２）の場合の測定波長は５５０ｎｍ
である。

検体吸光度から検体盲検（反応試薬から３α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼだけをぬいであるもの）
の吸光度を差し引いた値を測定結果の吸光度として、表
−１にまとめた。

表−１ 標準液　　匍清１　　泊清２ 本発明法　　０．４９０　　０．０６０　　０．０６５
従来法１　　０．０６１　　０．００４　　０．００７
従来法２　　０．０６５　　０．００５　　０．００３
実施例４゜ ピルビン酸の定量 ５０ｍＭ　　イミダゾール緩衝液（ｐＨ７，５）、０．
３ｍＭ　　ＮＡＤＨ，：１．００００単位／１　ラフチ
ー１デヒドロゲナーゼ、１５０００中位／ｌラクテート
オキシダーゼから成る試薬溶液を調整する。つぎに濃度
を変えたピルビン酸を含む試料５０ｇ１に試薬溶液を３
，０以ｌ加えて３７度の恒温槽で反応を開始１１，５分
後直ぐに蒸溜水を対照としてそれぞ才１の反応液の３４
０ｎｍの吸光度を測定した。試薬盲検の吸光度から検体
の吸光度を差し引いた値を測定結果の吸光度とＬ２、そ
の結果をビルビ゛ン酩の検量線どしてｆｆＡ３図に示し
た。

実施例５゜ Ａ、　Ｄ　Ｐの定量［ この実施例では実施例４．に記載ｌまたと同し〕基本系
を再度利用した。但し、試料中のＡＤＰを測る場合には
、実施例４の試薬溶液にさらに５ｍＭ塩化マグネシウＪ
０．０．５ｍＭ　　ホスホエフノールピルビン酸、１０
００単位／ｌ　ピルベートキナーゼを添加し、た試薬溶
液を用いた。その結果をＡＤＰの検量線として第４図に
示りまた。

（へ）発明効果 実施例１の結果から解るように、本発明方法はジヒドロ
キシア十トンリ゛／酸の濃度に比例しまた直線関係がｑ
１＋ちれており、化学量論的な定量性がある。

又エンドポイント法では理論値（分子吸光係数からの計
！　、、、、、ｌ：　）とＬ７て０．０９の吸光度しか
示さない試料が本発明においては０．９以ｌ−を示して
おり、回−発色剤を用いた場合においても非常に感ＩＷ
は増幅されている。

実施例２かも解るように、従来ＮＡＤどＮＡＤＨどの分
別室−早においては物理的分離操作又は化学的処理を必
要とする等の手間がかかったが、本発明方法では簡単に
Ｎ　Ａ　Ｉ）の共存ドにＮＡＤＨを定量することができ
るため、自動分析機への適用が１１丁能となる。

実施例３かも解るように、本発明方法は２つの従来法に
比較して、血清中に微量Ｌ２か含まれていない胆シ］”
酸を高感度で定量しており、極めて有用である。

前記の実施例では総べて生成しまた過酸化水素を足部し
ていたが、実施例４．５は前記に比較し、て感度の面で
は劣るが還元剤の共存下で影響を受けない３４０　ｎ　
ｍのＮＡＤＨの吸光度変化を測定する方法である。しか
し前記と同様、実施例４．５での本発明方法は、微量の
ピルビン酸、ＡＤＰ等を定量する場合に感度面で限界が
あるエンドポイン）・法に比較して反応速度法で測定す
るため、非常に高感度で足部することが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はジヒドロキシアセトンリン酸の検量線である。 縦軸は５５０ｎｍにおける１５分間の吸光度変化であり
、横軸は試料中のジヒドロキシアセトンリン酸の濃度（
ｍＭ）である。 第２図はＮＡＤＨの検量線である。縦軸は５５０１ｍに
おける１０分間の吸光度変化であり、横軸は試料中のＮ
ＡＤＨの濃度（ｍ、　Ｍ　）である。 第３図はピルビン酸の検量線である。縦軸は３４０ｎｍ
における５分間の吸光度変化であり、横軸は試料中のピ
ルビン酸の濃ｔＷ（ｍＭ）である。 第４図はＡＤＰの検量線である。縦軸は３４０ｎｍにお
ける５分間の吸光度変化であり、横軸は試ネ】Ｉ中のＡ
ＤＰの濃度（ｍ　Ｍ　）である。 第１固 某、３図 ２２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　分析対象物質（但し補酵素を除く）と酵素とが酵素
   サイクリング反応に直接に関与する系において、この時
   に得られる最終分析物質は、この酵素サイクリング反応
   を止めずに連続的に分析可能なるものであり、これを分
   析することにより試料中の物質を分析する方法。 ２　分析対象物質が、試料中の物質から中間物質を経て
   化学量論的に又はこれに比例して生成されてくる物質で
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３　酵素が少なくとも酸化還元酵素を含むものである特
   許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４　酸化還元酵素が少なくとも酸化酵素を含むものであ
   る特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５　酸化還元酵素が少なくとも酸化酵素とピリジン酵素
   を含むものである特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６　酸化還元酵素が酸化酵素とピリジン酵素の２種類か
   らなる特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７　最初に酸化酵素が分析対象物質と基質に作用してそ
   れらに対応する産生物と最終分析物質を生成させ、次に
   ピリジン酵素が基質と分析対象物質に対応する産生物に
   作用して最終分析物質と元の分析対象物質にかえるか、
   又は最初にピリジン酵素が分析対象物質と基質に作用し
   てそれらに対応する産生物と最終分析物質を生成させ、
   次に酸化酵素が基質と分析対象物質に対応する産生物に
   作用して最終分析物質と元の分析対象物質にかえる特許
   請求の範囲第６項記載の方法。 ８　分析対象物質がグリセロール３−リン酸又はジヒド
   ロキシアセトンリン酸、酸化酵素がＬ−α−グリセロホ
   スフェートオキシダーゼ、ピリジン酵素がグリセロール
   −３−リン酸デヒドロゲナーゼである特許請求の範囲第
   ７項に記載の方法。 ９　分析対象物質ジヒドロキシアセトンリン酸が、グリ
   セルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、１，３
   −ジホスホグリセリン酸及びトリオースホスフェートイ
   ソメラーゼの共存下に、試料中の分析しようとする物質
   又は中間物質であるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから生成さ
   れてくるものである特許請求の範囲第８項に記載の方法
   。 １０　１，３−ジホスホグリセリン酸がホスホグリセレ
   ートキナーゼの共存下で産生されてくるものである特許
   請求の範囲第９項に記載の方法。 １１　酵素サイクリング反応を行なわせる前にグリセル
   アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ又はトリオー
   スホスフェートイソメラーゼの酵素作用を止めるための
   阻害剤を加える特許請求の範囲第９項又は第１０項に記
   載の方法。 １２　酵素阻害剤がＤ−トレオース−２，４−ジリン酸
   又は２−ホスホグリコール酸である特許請求の範囲第１
   １項に記載の方法。 １３　ジヒドロキシアセトンリン酸が、酵素免疫測定法
   において標識酵素として使用されるトリオースホスフェ
   ートイソメラーゼの作用により生成されてくるものであ
   る特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １４　試料中の分析しようとする物質がリパーゼで、こ
   れがグリセロールキナーゼの共存下にて、分析対象物質
   グリセロール３−リン酸を生成するものである特許請求
   の範囲第８項に記載の方法。 １５　分析対象物質が乳酸又はピルビン酸、酸化酵素が
   ラクテートオキシダーゼ、ピリジン酵素がラクテートデ
   ヒドロゲナーゼである特許請求の範囲第７項に記載の方
   法。 １６　試料中の分析しようとする物質又は中間物質がＡ
   ＤＰのとき、そのＡＤＰがピルベートキナーゼ及びホス
   ホエノーピルビン酸の共存下に、分析対象物質ピルビン
   酸を生成するものである特許請求の範囲第１５項に記載
   の方法。 １７　ピルビン酸が、酵素免疫測定法において標識酵素
   として使用されるピルベートキナーゼの作用により生成
   されてくるものである特許請求の範囲第１５項に記載の
   方法。 １８　分析対象物質がビリルビン、ビリベルジン又はそ
   の両方、酸化酵素がビリルビンオキシダーゼ、ピリジン
   酵素がビリベルジンレダクターゼである特許請求の範囲
   第７項に記載の方法。 １９　酵素サイクリング反応に必要な酵素の基質として
   酸素、還元型ピリジンヌクレオチドのいずれか又は総べ
   てを含み、最終分析物質が過酸化水素、酸素、還元型ピ
   リジンヌクレオチドのいずれか又は総べてを含むもので
   ある特許請求の範囲第１項から第１８項記載の方法。 ２０　酵素サイクリング反応に必要な酵素の基質として
   酸素、還元型ピリジンヌクレオチドと、還元型ピリジン
   ヌクレオチド−再生系を含み、最終分析物質が過酸化水
   素又は酸素である特許請求の範囲第１項から第１８項記
   載の方法。 ２１　還元型ピリジンヌクレオチド−再生系として乳酸
   及び乳酸脱水素酵素、アルコール及びアルコール脱水素
   酵素、グリセロール及びグリセロール脱水素酵素又はグ
   ルタミン酸及びグルタミン酸脱水素酵素等を含む系より
   成る群から選ばれたものである特許請求の範囲第２０項
   に記載の方法。 ２２　最終分析物質が還元型ピリジンヌクレオチドのと
   き、その減少量として吸光度を測定する特許請求の範囲
   第１９項に記載の方法。 ２３　還元型ピリジンヌクレオチドがＮＡＤＨまたはＮ
   ＡＤＰＨである特許請求の範囲第１９項から第２２項の
   いずれかに記載の方法。 ２４　最終分析物質が酸素のとき、その消費量として酸
   素電極又はポーラログラフィにより測定する特許請求の
   範囲第１９項又は第２０項に記載の方法。 ２５　最終分析物質が過酸化水素のとき、その生成量と
   してカタラーゼ又はペルオキシダーゼを用いて酵素測定
   するかまたは過酸化水素電極により測定する特許請求の
   範囲第１９項又は第２０項に記載の方法。 ２６　ペルオキシダーゼを用いて酵素測定するとき、こ
   の酵素と被酸化性呈色試薬を添加し、色又は吸光度変化
   を測定する特許請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７　被酸化性呈色試薬が４−アミノアンチピリンとフ
   ェノール類又はアニリン類との組合わせからなる特許請
   求の範囲第２６項記載の方法。